מאמר שיטה

פרוטוקול מהיר לשילוב מערכים חוץ-כרומוזומליים עם קצב העברה גבוה לגנום C. elegans

9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50773

⸱

9 בדצמבר 2013

 ,  ,  , 
1Université Claude Bernard Lyon, 2Centre de Génétique et de Physiologie Moléculaires et Cellulaires, CNRS UMR 5534

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר הליך מהיר וצריכת חומר נמוך לשילוב של מערכים חוץ-כרומוזומליים טרנסגניים בגנום Caenorhabditis elegans באמצעות קרינה אולטרה סגולה (UV). יתר על כן, פרוטוקול זה מתאים במיוחד לקווים טרנסגניים המשדרים מערכים חוץ-כרומוזומליים בקצב גבוה.

תקציר

מיקרו-הזרקת DNA לציטופלזמה של בלוטת המין הסינציאלית של Caenorhabditis elegans היא הטכניקה העיקרית המשמשת להקמת קווים טרנסגניים המציגים שיעורי העברה חלקיים ומשתנים של מערכים חוץ-כרומוזומליים לדור הבא. בנוסף, בעלי חיים טרנסגניים הם פסיפס ומבטאים את הטרנסגן במספר משתנה של תאים. ניתן לשלב מערכים חוץ-כרומוזומליים בגנום C. elegans באמצעות קרינת UV כדי ליצור זנים טרנסגניים שאינם פסיפס עם שיעור העברה של 100% של הטרנסגן. במידה זו, צאצאי F1 של בעלי חיים טרנסגניים מוקרני UV נבדקים עבור בעלי חיים הנושאים אינטגרציה הטרוזיגוטית של הטרנסגן, מה שמוביל לשיעור העברה מנדליאני של 75% לצאצאי F2. אחד האתגרים של שיטה זו הוא להבחין בין אחוז ההעברה הטרנסגנית באוכלוסייה לפני (X% בעלי חיים טרנסגניים) ואחרי האינטגרציה (≥75% בעלי חיים טרנסגניים F2). לפיכך, שיטה זו מחייבת בחירת קו טרנסגני לא משולב עם אחוז של בעלי חיים טרנסגניים הנמוך משמעותית מההפרדה המנדלית של 75%. כתוצאה מכך, קווים טרנסגניים לא משולבים עם קצב העברת מערך חוץ-כרומוזומלי לדור הבא ≤60% מועדפים בדרך כלל לאינטגרציה, ושילוב טרנסגנים בזנים מעבירים מאוד קשה. כאן אנו מראים כי היעילות של שילוב מערכים חוץ-כרומוזומליים בגנום מוגברת בעת שימוש בקווים טרנסגניים בעלי העברה גבוהה (≥80%). הפרוטוקול המתואר מאפשר בחירה קלה של מספר קווים עצמאיים עם שילוב טרנסגנים הומוזיגוטיים בגנום לאחר הקרנת UV של תולעים טרנסגניות המציגות שיעור גבוה של העברת מערך חוץ-כרומוזומלי. יתר על כן, שיטה זו היא די מהירה וצורכת חומר נמוך. האפשרות ליצור במהירות קווים שונים המבטאים טרנסגן משולב מסוים מעוררת עניין רב למחקרים המתמקדים בדפוס ביטוי ובקרה של גנים, לוקליזציה של חלבונים וביטוי יתר, כמו גם לפיתוח סמנים תת-תאיים.

מבוא

טרנסגנים נמצאים בשימוש נרחב ב-C. elegans למגוון רחב של יישומים. זנים טרנסגניים נוצרים בדרך כלל על ידי הזרקת DNA לתוך בלוטת המין ההרמפרודיטה הסינציאלית1,2. ה-DNA הנושא את הטרנסגן המעניין נטבע יחד עם פלסמידים המקודדים סמני הזרקה משותפת1,3,4. סמני הזרקה משותפת הם טרנסגנים מבוססים המובילים לביטוי של חלבון פלואורסצנטי או לפנוטיפ התנהגותי או מורפולוגי ספציפי. ה-DNA המוזרק מתארגן מחדש ליצירת מערכים חוץ-כרומוזומליים מרובי עותקים; לפיכך, הטרנסגן המעניין וסמן ההזרקה מועברים יחד5,4. קווים טרנסגניים נבחרים בדור F2 של בעלי חיים מוזרקים על ידי מעקב אחר הפנוטיפ המושרה על ידי ביטוי סמן ההזרקה (פלואורסצנטי או פנוטיפ ספציפי)1. קווים טרנסגניים מציגים שיעורי העברה חלקיים ומשתנים של המערכים החוץ-כרומוזומליים לדור הבא. בהתאם לזן, 10-100% (100% הוא אירוע נדיר) מבעלי החיים יורשים מערכים חוץ-כרומוזומליים. בנוסף, בעלי חיים טרנסגניים הם פסיפס ומבטאים את הטרנסגן במספר משתנה של תאים. סביר להניח שפסיפס זה קשור לקצב ההדבקה לדור הבא. ואכן, הן בקו הנבט והן בתאים סומטיים קצב ההעברה תלוי בהפרדה של המערכים החוץ-כרומוזומליים במהלך חלוקת התאים. אחת הדרכים להימנע מבעיה זו היא לשלב את הטרנסגן בגנום. באופן קלאסי, שילוב של טרנסגן בכרומוזום מסתמך על הקרנה (אולטרה סגולה או גמא) של תולעים טרנסגניות הנושאות מערכים חוץ-כרומוזומליים3. בקצרה, 50-100 בעלי חיים הרמפרודיטים מוקרנים בשלב הזחל L4. בדור F1 נבחרים 200-800 בעלי חיים טרנסגניים ומתורבתים בנפרד על צלחות. על פי ההפרדה המנדליאנית, בעלי חיים טרנסגניים F1 הנושאים אינטגרציה הטרוזיגוטית של הטרנסגן בגנום ייצרו 1/2 מצאצאים טרנסגניים שהם הטרוזיגוטיים עבור המערך המשולב, 1/4 מצאצאים טרנסגניים הם הומוזיגוטיים עבור המערך המשולב, ו-1/4 מצאצאים שלא שילבו את המערך (איור 1). לפיכך, צלחות המכילות את דור F2 מוקרנות ויזואלית עבור ≥75% בעלי חיים טרנסגניים כפי שנצפה על ידי ביטוי סמן ההזרקה. כ-1/3 מבעלי החיים F2 שנבחרו להיות מועמדים לאינטגרציה מניחים שהם הומוזיגוטיים עבור המערך המשולב ומייצרים 100% מחיות F3 הומוזיגוטיות. לפיכך, מכל צלחת שנבחרה, שלוש עד שמונה חיות F2 טרנסגניות מתורבות בנפרד ונבחרות צלחות עם 100% צאצאים טרנסגניים. לאחר מכן, שמונה בעלי חיים F3 מתורבתים בנפרד כדי לאשר את התורשה של 100% של הטרנסגן.

החסרונות העיקריים של שיטה זו הם

  1. זה דורש מסך ויזואלי של כמה מאות לוחות F1 עבור ≥75% צאצאי F2 טרנסגניים, דבר שגוזל זמן בשל אחוז ההעברה המשתנה והבלתי צפוי של מערכים חוץ-כרומוזומליים לא משולבים. לחלופין, כדי להימנע מהקרנה של לוחות F1 ניתן לבצע מספר שלבי הרעבה לאחר הקרנה של בעלי חיים P0; ואחריו בחירת 100 בעלי חיים טרנסגניים וסינון ל-100% צאצאים טרנסגניים3.
  2. הוא אינו מותאם לזנים המציגים אחוז העברת מערך חוץ-כרומוזומלי גבוה מ-60% מכיוון שקשה להבחין באחוז זה מ-75%.
  3. מכיוון שניתן להשתמש רק בזנים עם קצב העברה נמוך יחסית, יש צורך במספר גבוה של בעלי חיים טרנסגניים P0 מוקרנים, כמו גם תצפית על בעלי חיים רבים F1 ו-F2, מה שגוזל זמן רב ודורש מספר לא מבוטל של צלחות.

הקרנת תולעים גורמת ככל הנראה לשברים דו-גדיליים ב-DNA ושילוב של מערכים חוץ-כרומוזומליים בכרומוזומים מתרחש במהלך תיקון ה-DNA. לפיכך, סביר להניח שהסיכויים להשיג אינטגרציה מוצלחת בתיווך הקרנה עומדים ביחס ישר למספר תאי קו הנבט הנושאים מערך חוץ-כרומוזומלי. זנים עם קצב העברה גבוה עשויים להכיל יותר מערכי DNA טרנסגניים מאשר זנים עם קצב העברה נמוך כפי שהוצעב-2, ולהציג מספר גבוה יותר של תאי קו נבט הנושאים מערכים חוץ-כרומוזומליים. לפיכך, הגענו למסקנה שבקווים בעלי שידור גבוה, טרנסגנים עשויים להיות קלים יותר לשילוב מאשר בקווים עם קצב העברה נמוך. עם זאת, הפרוטוקול הסטנדרטי אינו כולל את האפשרות לשלב טרנסגנים עם תדר העברה גבוה מכיוון שבקושי ניתן להבחין בין אחוז בעלי החיים הטרנסגניים עם מערך חוץ-כרומוזומלי לא משולב לבין זה של צאצאים של בעל חיים F1 הנושא אינטגרציה הטרוזיגוטית של הטרנסגן בגנום (איור 1).

כאן אנו מראים כי עבור טרנסגן מסוים, מספר הקווים המשולבים שהוחזרו לאחר הקרנה באור אולטרה סגול (UV) תלוי באחוז השידור ההתחלתי של המערך הלא משולב. אנו מציגים פרוטוקול משופר לאינטגרציה טרנסגנית בתיווך קרינת UV הרלוונטי במיוחד לקווים המציגים קצב גבוה של העברת מערך טרנסגנים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. תרבית נמטודות טרנסגניות לפני האינטגרציה

ניתן ליצור

ניתן ליצור קווים טרנסגניים כמתוארב-1. קווים אלה מכילים בדרך כלל פלסמיד סמן הזרקה משותפת המוביל לביטוי של חלבון פלואורסצנטי או לפנוטיפ התנהגותי או מורפולוגי ספציפי בשלב התפתחות נתון1,3. ניתן ליישם פרוטוקול אינטגרציה זה על זנים המבטאים סמני הזרקה פלואורסצנטיים או לא פלואורסצנטיים. בדוגמה הבאה, נעשה שימוש בזן עם סמן הזרקה פלואורסצנטית.

  1. הכן צלחות תרבות:
    1. הכינו כ -500 צלחות פטרי גדולות בגודל 60 מ"מ שנמזגו באופן אספטי עם 10 מ"ל כל אחת ממדיום גידול נמטודות (NGM)6,7.
    2. זרע כל צלחת עם 0.3 מ"ל תרבית Escherichia coli OP50 רוויה לפי הליך סטנדרטי6,7.
  2. הערך את קצב ההעברה של הקו הטרנסגני שיש לשלב:
    1. עבור כל קו טרנסגני, בחר עשרה בוגרים פלואורסצנטיים על עשר לוחות תרבית נפרדים תחת סטריאוסקופ פלואורסצנטי באמצעות קיסם תולעים כמתוארב-7.
    2. יש לגדל את בעלי החיים באינקובטור תולעים בטמפרטורה של 15-25 מעלות צלזיוס (תלוי ברקע הגנטי) כדי לאפשר לתולעים להתרבות.
    3. התבונן בצאצאים מדי יום כדי להעריך באיזה שלב התפתחותי מתבטא סמן ההזרקה המשותפת וניתן לצפות בו בצורה הטובה ביותר. הביטוי של רוב סמני ההזרקה המשותפת הנמצאים בשימוש כיום נצפה בשלב הזחל L4 או בבגרות.
    4. העריכו את קצב ההעברה של הצאצאים על ידי קביעת אחוז הצאצאים הפלואורסצנטיים על ידי תצפית תחת סטריאוסקופ פלואורסצנטי.
  3. בחר קו טרנסגני לשילוב טרנסגנים:
    1. בחר את הקו הטרנסגני עם שיעור ההדבקה הגבוה ביותר האפשרי (באופן אידיאלי ≥80%).
  4. להשיג אוכלוסייה של בעלי חיים טרנסגניים המסונכרנים בשלב הזחל L4 לצורך אינטגרציה:
    1. בחר 30 בוגרים פלואורסצנטיים על חמש צלחות תרבית (שש חיות בצלחת).
    2. תנו לתולעים להטיל ביצים במשך 3-4 שעות בחום של 15 מעלות צלזיוס.
    3. הסר את המבוגרים מהצלחות לאחר בדיקת נוכחות של לפחות 30 ביצים בצלחת.
    4. תרבו את בעלי החיים בחממת תולעים בטמפרטורה של 15-25 מעלות צלזיוס עד שהצאצאים מגיעים לשלב הזחל L4 (96 שעות ב-15 מעלות צלזיוס או 36 שעות ב-25 מעלות צלזיוס).

2. קרינת UV והתאוששות של תולעים טרנסגניות

  1. הקרנת תולעים:
    1. בחר 30-100 חיות L4 טרנסגניות פלואורסצנטיות על צלחות תרבית נפרדות (15-20 חיות בצלחת).
    2. מניחים את הצלחות, כשהמכסים מוסרים, בקישור צולב UV. מקרין את התולעים ב-0.012 J/cm2. שימו לב שזנים רגישים פחות או יותר ל-UV וכי התוצאות יכולות להיות משתנות בהתאם ל-UV המשמש. ניתן לבדוק טווח מינון בין 0.010-0.015 J/cm2.
  2. התאוששות תולעים לאחר הקרנה:
    1. הניחו צלחות עם תולעים מוקרנות למשך הלילה בטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס להתאוששות.
    2. בדוק את מספר החיות שנותרו בחיים. אצלנו שיעור הישרדות של כ-80-90% מותאם לקרינה יעילה.
    3. גדל את בעלי החיים המוקרנים בטמפרטורה של 15-25 מעלות צלזיוס עד שהצאצאים הגיעו לשלב ההתפתחותי המאפשר התבוננות בביטוי סמן ההזרקה, כפי שנקבע בשלב 1.2.

3. בידוד של קווים טרנסגניים משולבים

  1. מבחר בעלי חיים F1:
    1. יחיד 150-200 בעלי חיים פלואורסצנטיים F1 על צלחות תרבית נפרדות. עבור קווים משדרים מאוד (≥80%), מספיקים 100 בעלי חיים F1.
    2. שמור את לוחות F1 אלה בטמפרטורה של 15-25 מעלות צלזיוס עד שהצאצאים יגיעו לשלב מתאים לתצפית על בעלי חיים F2 פלואורסצנטיים.
    3. השליכו את כל לוחות F1 המציגים 1) 1) ללא צאצאים, מה שמצביע על כך שהחיה F1 הייתה עקרה או מתה, או 2) לא או רק מעט חיות F2 פלואורסצנטיות, מה שמצביע על כך שחיית F1 לא העבירה את הטרנסגן בקצב הצפוי. שלב זה מהיר ומייצג יתרון אמיתי בהשוואה לפרוטוקול הסטנדרטי הדורש הערכה של אחוז תולעי F2 פלואורסצנטיות על מנת לבחור לוחות F1 המציגים ≥75% צאצאים פלואורסצנטיים (טבלה 1).
  2. מבחר בעלי חיים F2:
    1. יחיד ארבע חיות F2 טרנסגניות פלואורסצנטיות מכל צלחת F1 שנבחרה. בעת שימוש בטרנסגנים פלואורסצנטיים (למשל mCherry8, gfp9 או dsRed10), בחר תולעי F2 עם רמה גבוהה של פלואורסצנטיות מכיוון שהדבר יכול להצביע על כך שבעלי חיים אלה הם הומוזיגוטיים עבור המערך המשולב. שימו לב שכאשר קוטפים בעלי חיים F2 חשוב לא לשאת ביצים או זחלים, על מנת להימנע מתוצאות שליליות כוזבות בשלב הבא.
    2. גדל בעלי חיים F2 בטמפרטורה של 15-25 מעלות צלזיוס.
  3. בידוד ואימות של זנים טרנסגניים משולבים:
    1. צלחות מסך F2 עבור 100% תולעים טרנסגניות F3 פלואורסצנטיות. המסך מהיר למדי מכיוון שנוכחותה של תולעת אחת שאינה פלואורסצנטית מעידה על כך שיש לזרוק את הצלחת. בעל חיים F2 הומוזיגוטי עבור הטרנסגן המשולב ייתן 100% צאצאים פלואורסצנטיים הומוזיגוטיים.
    2. יחיד שמונה חיות F3 פלואורסצנטיות מלוחות נבחרים כדי לאשר את התורשה של 100% של הטרנסגן. בתיאוריה, בחירת חיה אחת מספיקה בשלב זה. עם זאת, בחירת שמונה בעלי חיים פלואורסצנטיים F3 עשויה להיות נחוצה כדי להימנע מבחירת בעלי חיים לא פוריים או לא בריאים מכיוון שהקרנה עלולה לגרום באופן אקראי למוטציות המשפיעות על גנים חשובים לפיזיולוגיה של תולעים.
    3. במידת האפשר שמור על מספר זנים טרנסגניים משולבים עצמאיים, כלומר זנים שהוחזרו מבעלי חיים שונים F1.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

שילובים של טרנסגנים בשני קווים שונים המעבירים מערכים חוץ-כרומוזומליים בתדירות דומה בערך (50-60%) בוצעו באמצעות הפרוטוקול הסטנדרטי והפרוטוקול המשופר (Table 1). הפרוטוקול הסטנדרטי אפשר את השגתו של שלושה קווים משולבים עצמאיים לאחר הקרנת UV של 91 בעלי חיים טרנסגניים בשלב L4, בעוד שהפרוטוקול המשופר אפשר את השגתו של קו משולב אחד לאחר הקרנת UV של 30 בעלי חיים טרנסגניים בשלב L4. הדבר מרמז כי יעילות השילוב דומה עבור שני הפרוטוקולים (קו משולב אחד לכל 30 בעלי חיים בשלב L4 שהוקרנו). עם זאת, לא ניתן לשלול את האפשרות ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול המתואר כאן מספק שיטה יעילה לשילוב מערכים טרנסגניים חוץ-כרומוזומליים בגנום של C. elegans. באמצעות קווים לא משולבים שונים, שהעבירו את אותו טרנסגן Pdyc-1::d yc-1::gfp (pKG45) בשיעורים שונים (10-15%, 50-60% ו->80%), הראינו שמספר הזנים המשולבים שהתאוששו לאחר קרינת UV תלוי ברמת ההעברה הראשונית של הקו הלא משולב (טבלה 2). לכן, קל יותר לשלב טרנסגנים בקווים המציגים קצב העברה גבוה.

טרנסגנים משולבים מעניינים למגוון רחב של מטרות, כולל מחקרים הקשורים לוויסות גנים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרס כלכלי מתחרה.

תודות

המחברים מבקשים להודות לקלייר לקרואזי וללורן סגלט על יצירת Pdyc-1::d yc-1::gfp; Pmyo-2::d sRed ו-Pmyo-3::gfp זנים טרנסגניים. אנו מודים לאנדי פייר על מתנת הפלסמיד האדום Pmyo-2::d s, ולפמלה הופה על מתנת הפלסמיד Pmyo-3::gfp. עבודה זו נוסדה על ידי המרכז הלאומי הצרפתי למחקר מדעי (CNRS) ואוניברסיטת קלוד ברנרד בליון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
AgarProlabo20768.292להכנת NGM (מדיום גידול נמטודות) (6,7)
NaClChimie-Plus40045להכנת NGM
Bacto-peptoneBD211820להכנת NGM
KH2PO4Roth3904-1להכנת NGM
K2HPO4Prolabo26930.293להכנת NGM
MgSO4RothP027.2להכנת NGM
CaCl2Prolabo22317.297להכנת NGM
כולסטרולRectapurלהכנת NGM
מרק LBSigmaL3022לתרבית של OP50 חיידקים
ציוד
UV צולב קישורפישר מדעיאורך גל 254 ננומטר
מיקרוסקופ SteREO Discovery V8Carl Zeiss, Inc.
צלחות פטרי, 60 מ"מCMLBPS55E6
חוט פלטיניום 0.25 מ"מאלפא אסר7440-06-4לבחירה לתולעים (7)

מקורות

  1. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833(2008).
  2. Mello, C., Kramer, J. M., Stinchlomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10 (12), 3959-3970 (1991).
  3. Transformation and microinjection. WormBook. Evans, T. C. , The C. elegans Research Community, WormBook. (2006).
  4. Hobert, O. PCR Fusion-Based Approach to Create Reporter Gene Constructs for Expression Analysis in Transgenic C. elegans. BioTechniques. 32, 728-730 (2002).
  5. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  7. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis. J. Vis. Exp. (47), e2293(2011).
  8. Merritt, C., Rasoloson, D., Gallo, C., Voronina, E., Ko, D., Seydoux, G. A modular vector kit for transgenesis in C. elegans. International Worm Meeting. , (2007).
  9. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Green Prasher, D. Fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
  10. Fleenor, J., Fire, A. Discosoma sp. Red Fluorescent Protein (dsRED) as a reporter in C. elegans. Worm Breeder's Gazette. 16 (3), 16(2000).
  11. Lecroisey, C., et al. ZYX-1, the unique zyxin protein of Caenorhabditis elegans, is involved in dystrophin-dependent muscle degeneration. Mol. Biol. Cell. , (2013).
  12. Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157 (3), 1217-1226 (2001).
  13. Frøkjaer-Jensen, C., et al. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nat. Genet. 40 (11), 1375-1383 (2008).
  14. Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination. Nat. Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

UVF1F2

מאמרים קשורים