Method Article

שיטת Quantitation רגישה וספציפית לקביעת חלבון-C שרירן לב סרום הכבילה ידי Immunoassay Electrochemiluminescence

DOI:

10.3791/50786

⸱

August 8th, 2013

 ,  ,  , 
1Department of Cell and Molecular Physiology, Loyola University Chicago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סמנים ביולוגיים למדידה בדגימות ביולוגיות מורכבות יותר ויותר מנחים את קבלת החלטות קליניות. אנו מתארים שיטה רגישה ביותר למדידה בו זמנית לב שרירן מחייב חלבון-C, מגה קריאטין קינאז, וטרופונין לבי בדגימות סרום מנבדקים עם אוטם שריר הלב ונבדקים בריאים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סמנים ביולוגיים הופכים להיות יותר ויותר חשובים בקבלת החלטות קלינית, כמו גם מדע בסיסי. אבחון אוטם שריר הלב (MI) הוא מונע במידה רבה על ידי גילוי לב חלבונים ספציפיים בסרום או הפלזמה של חולים כמדד לפגיעה בשריר לב. לאחר שהראה לאחרונה כי לב שרירן מחייב חלבון-C (cMyBP-C) ניתן לזהות בסרום לאחר אוטם לבבי, יש לנו הצענו אותו כסמן ביולוגי פוטנציאל לאמ"ן. סמנים ביולוגיים מזוהים בדרך כלל על ידי מבחני immunosorbent אנזים צמודי כריך מסורתי. עם זאת, טכניקה זו דורשת נפח דגימה גדול, יש לו טווח דינמי קטן, ויכולה למדוד רק חלבון בכל פעם.

כאן אנו מראים immunoassay זמנית שבניתנים למדידה בשלושה חלבוני לב בו זמנית עם רגישות גבוהה. מדידת cMyBP-C יחד בuniplex או עם MB קריאטין קינאז וטרופונין לבי הראה רגישות דומה. טכניקה זו משתמשת בקנה מידת Meso דיסקברי(MSD) שיטת ריבוב בצלחת 96 היטב בשילוב עם electrochemiluminescence לצורך זיהוי. אמנם רק בנפחי מדגם קטנים נדרשים, רגישות גבוהה וטווח דינמי גדול מושגות. שימוש בטכניקה זו, מדדנו I רמות בדגימות סרום מ -16 נבדקים עם MI cMyBP-C, מגה קריאטין קינאז, ולב טרופונין והשווה את התוצאות עם 16 נבדקי ביקורת. היינו מסוגל לזהות את כל שלושת הסמנים בדגימות הללו ומצאנו את כל שלושת סמנים להיות מוגבר לאחר אוטם לבבי. טכניקה זו היא, אם כן, מתאימה לגילוי של סמנים ביולוגיים רגיש לב בדגימות סרום.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המדידה של כמויות נמוכות של חלבון בדגימות ביולוגיות מורכבות, כגון סרום, היא בעלת חשיבות קלינית גוברת לניהול מטופל, כמו גם מדע בסיסי. לדוגמה, עלייה ברמות בסרום של סמנים ביולוגיים לב, כמו טרופונין I, בהגדרה קלינית היא בקנה אחד עם אוטם שריר הלב (MI) 1. כדי לזהות חלבונים בדגימות סרום, assay immunosorbent אנזים צמוד הסטנדרטי (ELISA) הוא הטכניקה משמשת לרוב כיש לו רגישות גבוהה ומאפשר לכימות מוחלטת של אנליטי. עם זאת, ELISAs המסורתי דורש כמות גדולה יחסית של מדגם (בדרך כלל 100 μl), יש לי אות רקע גבוהה בחלק מהנוזלים ביולוגיים, והם מוגבלים למדידת אחת בלבד אנליטי לELISA 2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Assay cMyBP-C Uniplex

  1. ביום שלפני הניסוי, מעיל הצלחת הסטנדרטית החשופה 96, גם MSD עם נוגדן ללכוד. לcMyBP-C, יש להשתמש בנפח של 30 μl עכבר נוגדן אנטי cMyBP-C חד שבטי (ג'לטין חינם) בריכוז של 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​מדולל בופר פוספט (PBS).
  2. מאז גם הוא הידרופובי, פיפטה הפתרון לפינה התחתונה של הבאר, ואז להקיש על הצדדים של הצלחת להתפשט על פני כל הפתרון טוב.
  3. הצלחת מכוסה באוטם צלחת וטופחו O / N ב 4 ° C בלי לרעוד.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

את עקרונות היסוד ואת זרימת העבודה של assay 3-Plex מוצגים באיור 1, ואת זרימת העבודה הכוללת מתוארת בטבלה 1. מבחני Uniplex לעבוד יחד באותו עיקרון אלא שכל התחתית היטב מצופה בנוגדן ללכוד אחד. זיהוי אות נעשה על ידי ECL שבו אות חשמלי מוחל על תחתית הבאר. זה, בתורו, יוזם ייצור מקומי של אור באמצעות תגובה כימית של הקריאה החיץ עם תווית sulfo-TAG בנוגדנים לזיהוי. זה מוביל לרקע הנמוך ורגישות גבוהה של assay. בתרשים 2, עקומת התקן של cMyBP-C בassa.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר זה, אנו מציגים את הישימות של immunoassay זמנית לגילוי של סמנים ביולוגיים בסרום לב מרובים מחולים. טכניקה זו יש יתרונות רבים על פני ELISA המסורתי. ראשית, ECL בערכת assay משמש במקום זיהוי colorimetric. בECL, אות חשמלי מגרה את הייצור המקומי של הנכס נמדד (אור), ובכך שחרר את סוגר אירוע הגירוי מהאות, אשר מפחיתה רקע 14. זה מאפשר רגישות גבוהה, כפי שניתן לראות בטבלה 2.

ריבוב assay אינו התו.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בקשת פטנט מלאה תלויה ועומדת (בקשת מס 'סידורי 13/464, 466, פאב מס' A1 ארה"ב 2012 / 0,282,618 ותאריך. 05/04/12) כדי לקבוע את גורמי הסיכון הקשורים לפירוק ושחרור cMyBP-C לתוך נוזל גוף אדם ולכמת את רמת cMyBP-C בנוזלים בגוף אנושי.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מומן על ידי מכונים הלאומי לבריאות מענקים R01HL105826 וK02HL114749 (ד"ר Sadayappan), ומלגות לאיגוד לב אמריקאי במערב התיכון; 11PRE7240022 (מר Barefield) ו13POST14720024 (ד"ר Govindan). המחברים תודה להכיר בסיועו של ד"ר ג'ימי פייג', ג'יל Clampit וד"ר ג'ון הדסון, MSD, לתמיכה הטכנית ובספרות מצוינת שלהם בפיתוח assay.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
MSD Read-Buffer T (4X) עם פעילי שטחMeso Scale DiscoveryR92TC-2 
Tween-20Acros9005-64-5 
MSD Blocker AMeso Scale DiscoveryR93BA-1 
תמיסת מלח חוצצת פוספט, 10Xפישר ביוריאגנטיםBP399-4מסנן לפני השימוש
נוגדן C חלבון קושר מיוזין, חד שבטי עכבר (E7), סנטהקרוזSC-137180Lלציפוי, הנוגדן חייב להיות נטול
<חזק>צלחות וציוד
Multi-Array 96-well צלחת סטנדרטיתMeso Scale DiscoveryL15XA-3 
אב טיפוס של 3-plex, ארבע נקודות, 96 בארות עם cMyBP-C, cTnI ו-CK-MBMeso Scale DiscoveryN452A-1 
ThermaSeal איטום סרטמוצרי מדעי החיים בע"מST-3098 
MSD SECTOR Imager 2400Aבקנה מידה בינוני 
שייקר מיקרוטיטר דיגיטלי MTS 2/4IKA3208001 
ללא ג'לטין ג'לטין גילוי

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thygesen, K., et al. Third universal definition of myocardial infarction. Eur. Heart J. 33, 2551-2567 (2012).
  2. Leng, S. X., et al. ELISA and multiplex technologies for cytokine measurement in inflammation and aging research. J....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cardiac Myosin Binding Protein CElectrochemiluminescence ImmunoassayMultiplex ImmunoassaySerum Biomarker DetectionMeso Scale Discovery96 Well PlateCalibrator Standard CurveDetection Antibody LabelingReid Buffer AdditionCross Reactivity Analysis

Related Articles