פיתחנו assay במבחנה כדי לחקור את התפקיד של מסלולי immunoregulatory בויסות הפרשת ציטוקינים על ידי תאי T מסוג CD4 HIV-ספציפיים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
במבחנה Assay כדי להעריך את ההשפעה של immunoregulatory מסלולים על פונקצית Effector הנייד HIV-ספציפית T מסוג CD4
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
תשישות תא T היא גורם מרכזי בסילוק הפתוגן נכשל במהלך זיהומים נגיפיים כרוניים. מסלולי immunoregulatory, כגון PD-1 ו-IL-10, הם שהוגברו בחשיפה אנטיגן המתמשכת הזה ולתרום לירידה של התפשטות, פונקצית cytolytic מופחתת, ולקויי ייצור ציטוקינים על ידי תאי CD4 ו CD8 T. במודל העכברי של זיהום LCMV, מנהלה של חסימת נוגדנים כנגד שני מסלולים אלה בתוספת תגובות תא T. עם זאת, אין כיום assay במבחנה כדי למדוד את ההשפעה של מצור כזה על הפרשת ציטוקינים בתאים מדגימות אנושיות. הפרוטוקול והגישה ניסויית שלנו מאפשרים לנו באופן מדויק ויעיל לכמת את השיקום של ייצור ציטוקינים על ידי תאי T מסוג CD4 HIV-ספציפיים מנבדקים נגועים ב-HIV.
כאן, אנו מתארים במבחנה עיצוב ניסיוני המאפשר מדידות של הפרשת ציטוקינים על ידי תאי T מסוג CD4 HIV-ספציפיים ואת השפעתן על cel האחרתת ליטר. תאי CD8 T היו מתרוקנים מכל הדם וPBMCs שנותרה היו מבודדות באמצעות שיטת הפרדת Ficoll. PBMCs המדולדלת CD8 אז הודגרו עם חסימת נוגדנים כנגד PD-L1 ו / או IL-10Rα, ולאחר גירוי עם בריכת פפטיד Gag-HIV-1, תאים הודגרו על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. לאחר 48 שעה, supernatant נאסף לניתוח ציטוקינים על ידי מערכי חרוזים וכדורי תא נאספו גם עבור ניתוח פנוטיפי באמצעות cytometry זרימה או ניתוח תעתיק באמצעות qRT-PCR. לניתוח מפורט יותר, אוכלוסיות תאים שונות התקבלו על ידי דלדול משנה סלקטיבית מPBMCs או על ידי מיון באמצעות cytometry זרימה לפני שהוערך באותה מבחני. שיטות אלה מספקות גישה רגישה וספציפית מאוד על מנת לקבוע את האפנון של ייצור ציטוקינים על ידי תאי T-helper אנטיגן הספציפי ולקבוע יחסי גומלין פונקציונליים בין אוכלוסיות השונות של תאים חיסוניים.
מבוא
במהלך זיהומים נגיפיים מתמשכים, תאים הספציפי-T וירוס לרכוש ליקויים תפקודיים בתהליך המכונה תשישות תא T. בשלב מוקדם במחקרי vivo במודל העכברי LCMV של זיהום נגיפי כרוני ציין כי תאי T ספציפי וירוס המותשים צמצמו פונקצית cytolytic כנגד תאים נגועים בנגיף, לאבד את היכולת שלהם להתרבות וצמצמו יכולת לייצר ציטוקינים כגון IL-2, TNF- α וIFN-γ 1,2. רשת מורכבת של מסלולי immunoregulatory, כגון PD-1 ו-IL-10, הם שהוגברו במהלך זיהומים כרוניים ותורמת לתפקוד תא T (הנסקרת ב 3,4). בvivo ממשל של חסימת נוגדנים נגד מסלולים מעכבים אלו בעכבר LCMV דגם משוחזר תפקוד של תאי T ספציפי וירוס מותשים וסליקה נגיפית משופ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. דלדול ובידוד של PBMCs באמצעות הפרדת Ficoll
- לרוקן תאי CD8 + T על ידי הוספת קוקטייל דלדול אדם CD8 + ב50 / מיליליטר μl של דם מלא.
- מערבבים היטב דגירה עבור 20 דקות בטמפרטורת חדר (18-25 ° C).
- לאחר דגירה, לערבב דם כל עם HBSS (תמיסת מלח מאוזנת של האנק ללא Ca 2 + או Mg 2 +) ושכבה מעל Histopaque. ספין ב340 RCF ל30 דקות (לא בלם, האצה איטית).
- לאסוף PBMCs ולהעביר לחרוטי 50ml חדשי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בעת ביצוע מדידות ציטוקינים באמצעות מערכת זו במבחנה, זה הכרחי כדי להיות מסוגל להבחין בין תגובות אנטיגן הספציפי בהשוואה לשום שליטת גירוי. באופן כללי, אנחנו נחשבים לתגובות חיוביות כמו כל ערכים של גירוי אנטיגני שנותנות עלייה לפחות פי שלוש ברמות ציטוקינים בהשוואה לשום שליטת הגירוי ושהיו בתוך הטווח ליניארי של assay. אנחנו משתמשים במבחני רגישות גבוהים מערך חרוז שיכול לזהות ריכוזים של ציטוקינים נמוכים כמו 0.16 pg / ml, מה שמאפשר לנו להתבונן בתגובות אנטיגן הספציפי חלשות T מסוג CD4.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
אוסף supernatant הוא חלק הכרחי של עיצוב ניסיוני זה. כאשר קצירת supernatants עבור assay Luminex, aliquots נעשו והמשיכו ב-80 ° C כדי למנוע פירוק חלבונים בשל ההפשרה להקפיא מחזורים. הקפאה והפשרה יכולה להיות תהליכים קשים לחלבונים, ועל ידי מזעור הקפאה מפשירה, אות תהיה מוגדלת במבחנים. לכן, קל יותר להשיג נתונים הדיר ומדויקים יותר כאשר עובדים מaliquots כי כבר-מופשר הקפאה אותו מספר הפעמים.
אנחנו ביצענו בעבר ניתוח הקינטית ש.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
אנו מודים לגורדון פרימן למתן נוגדן החסימה אנטי PD-L1. אנו מודים לצוות הרפואי ומעבדה בבית החולים הכללי מסצ'וסטס וכל משתתפי המחקר לתפקיד רב הערך שלהם בפרויקט זה.
מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות של המכונים הלאומיים לבריאות (PO1 AI-080,192; DEK), הלאומי ללב ריאות ודם מכון של המכון הלאומי לבריאות (RO1 HL-092,565; DEK). DEK נתמך פרס קריירה Scholar המחקר של בריאות קרן המחקר לקוויבק (FRQS) על ידי. FP נתמך על ידי מענק מלגה של כללי וועד הפועל של בית החולים מסצ'וסטס על מחקר והמוסד לבריאות הגלובלית של הרווארד (HGHI).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| תמיסת מלח מאוזנת של הנקס ללא Ca2+ או Mg2+ | Sigma | H9394 | |
| RPMI 1640 | Sigma | R0883 | |
| Histopaque-1077 | Sigma | 10771 | |
| סרום אנושי AB | Gemini BioProducts | 100-512 | |
| פניצילין/סטרפטומיצין | Mediatech | 30 001 CI | |
| L-גלוטמין | Mediatech | 25 005 CI | |
| HEPES מאגר | Mediatech | 25060CI | |
| FcR מגיב חוסם, אנושי | Miltenyi | 130-059-901 | |
| RosetteSep Human CD8 + דלדול קוקטייל | תאי גזע | 15663 | |
| LIVE / DEAD ערכת כתמי תאים מתים לתיקון, עבור עירור UV | Invitrogen | L23105 | |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Improm-II מערכת תמלול הפוך | Promega | A3800 | |
| Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master Mix | Agilent | 600830 | |
| BD Cytofix/Cytoperm קיבוע/פרמיביליזציה ערכת פתרון | BD | 554714 | |
| Tween-20 | Fisher | BP337100 | |
| IFN-γ פריימר | Invitrogen | FOR: CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA | |
| GAPDH פריימר | Invitrogen | עבור: TCATCATCTCTGCCCCCTCTCT rev: AGTGATGGCATGGACTGTGG |
מקורות
- Zajac, A. J., et al. Viral immune evasion due to persistence of activated T cells without effector function. J. Exp. Med. 188, 2205-2213 (1998).
- Wherry, E. J., Blattman, J. N., Murali-Krishna, K., vander Most, R., Ahmed, R.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
