הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

במבחנה Assay כדי להעריך את ההשפעה של immunoregulatory מסלולים על פונקצית Effector הנייד HIV-ספציפית T מסוג CD4

13.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50821

⸱

15 באוקטובר 2013

 ,  ,  ,  , 
1The Ragon Institute of MGH, MIT and Harvard, 2Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM)

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פיתחנו assay במבחנה כדי לחקור את התפקיד של מסלולי immunoregulatory בויסות הפרשת ציטוקינים על ידי תאי T מסוג CD4 HIV-ספציפיים.

תקציר

תשישות תא T היא גורם מרכזי בסילוק הפתוגן נכשל במהלך זיהומים נגיפיים כרוניים. מסלולי immunoregulatory, כגון PD-1 ו-IL-10, הם שהוגברו בחשיפה אנטיגן המתמשכת הזה ולתרום לירידה של התפשטות, פונקצית cytolytic מופחתת, ולקויי ייצור ציטוקינים על ידי תאי CD4 ו CD8 T. במודל העכברי של זיהום LCMV, מנהלה של חסימת נוגדנים כנגד שני מסלולים אלה בתוספת תגובות תא T. עם זאת, אין כיום assay במבחנה כדי למדוד את ההשפעה של מצור כזה על הפרשת ציטוקינים בתאים מדגימות אנושיות. הפרוטוקול והגישה ניסויית שלנו מאפשרים לנו באופן מדויק ויעיל לכמת את השיקום של ייצור ציטוקינים על ידי תאי T מסוג CD4 HIV-ספציפיים מנבדקים נגועים ב-HIV.

כאן, אנו מתארים במבחנה עיצוב ניסיוני המאפשר מדידות של הפרשת ציטוקינים על ידי תאי T מסוג CD4 HIV-ספציפיים ואת השפעתן על cel האחרתת ליטר. תאי CD8 T היו מתרוקנים מכל הדם וPBMCs שנותרה היו מבודדות באמצעות שיטת הפרדת Ficoll. PBMCs המדולדלת CD8 אז הודגרו עם חסימת נוגדנים כנגד PD-L1 ו / או IL-10Rα, ולאחר גירוי עם בריכת פפטיד Gag-HIV-1, תאים הודגרו על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. לאחר 48 שעה, supernatant נאסף לניתוח ציטוקינים על ידי מערכי חרוזים וכדורי תא נאספו גם עבור ניתוח פנוטיפי באמצעות cytometry זרימה או ניתוח תעתיק באמצעות qRT-PCR. לניתוח מפורט יותר, אוכלוסיות תאים שונות התקבלו על ידי דלדול משנה סלקטיבית מPBMCs או על ידי מיון באמצעות cytometry זרימה לפני שהוערך באותה מבחני. שיטות אלה מספקות גישה רגישה וספציפית מאוד על מנת לקבוע את האפנון של ייצור ציטוקינים על ידי תאי T-helper אנטיגן הספציפי ולקבוע יחסי גומלין פונקציונליים בין אוכלוסיות השונות של תאים חיסוניים.

מבוא

במהלך זיהומים נגיפיים מתמשכים, תאים הספציפי-T וירוס לרכוש ליקויים תפקודיים בתהליך המכונה תשישות תא T. בשלב מוקדם במחקרי vivo במודל העכברי LCMV של זיהום נגיפי כרוני ציין כי תאי T ספציפי וירוס המותשים צמצמו פונקצית cytolytic כנגד תאים נגועים בנגיף, לאבד את היכולת שלהם להתרבות וצמצמו יכולת לייצר ציטוקינים כגון IL-2, TNF- α וIFN-γ 1,2. רשת מורכבת של מסלולי immunoregulatory, כגון PD-1 ו-IL-10, הם שהוגברו במהלך זיהומים כרוניים ותורמת לתפקוד תא T (הנסקרת ב 3,4). בvivo ממשל של חסימת נוגדנים נגד מסלולים מעכבים אלו בעכבר LCMV דגם משוחזר תפקוד של תאי T ספציפי וירוס מותשים וסליקה נגיפית משופרת, המציין כי תשישות תא T היא תופעה הפיכה באופן חלקי (הנסקרת ב 5).

ממצאים על המודל LCMV דואר הוארך במהירות לדלקות ויראליות כרוניות אנושיות כמו HBV, HCV ו-HIV 5. בהידבקות ב-HIV-1 כרונית, PD-1 ו-IL-10 מסלוליהם הוגברו בנושאים נגועים ולתאם עם פרמטרים של התקדמות מחלה, באופן ישיר עם העומס הנגיפי והפכו עם CD4 לספור 6-8. מצור נוגדן של מסלולי PD-1 או IL-10 בהתפשטות מבחנה המשוחזרת של תאי CD4 ו CD8 T-HIV ספציפיים המצביעים על כך, בדומה למודל של עכברי LCMV, תשישות תא T בבני האדם היא תופעה הפיכה באופן חלקי. עם זאת, בשל האופי העדין של ניסויים על דגימות אנושיות, כמו גם מגבלות ברגישות של מבחני חוץ גופייה, חקירה יסודית של פרופילי השיקום התפקודי הושגו על ידי התערבויות אלה הוא בולטים נעדרו. מבחני למניעת הפצת נשק היו, עד כה, המבחנה assay אמין רק בנבדק במרבית המחקרים, אך יש חוסר מדהים של ראיות על ההשפעה של בין אלהventions על: 1) יכולת ההרג של תאי T ציטוטוקסיים, 2) השפעת נגיפים של תאי T על שכפול נגיפי, 3) פרופיל הפרשת ציטוקינים, ו4) ההשפעה על עזרה תא T מסוג CD4 בתת תא אחר.

מכתים ציטוקינים תאיים (ICS) הוא זרימה מאוד שימושית ושימוש נרחב assay המבוסס cytometry המשמש לזיהוי ייצור של ציטוקינים בסוגי תאים שונים בשני עכברים ובני אדם. כמו כן, נעשה שימוש כדי לחקור את ההשפעה של מצור נוגדן של מסלולים מעכבים. במבחני ICS, הפרשת ציטוקינים חסומה על ידי התוספת של Brefeldin ו / או Monensin. ציטוקינים לכודים בתוך התאים ולאחר מכן זוהו עם נוגדני ניאון באמצעות cytometry זרימה צבעוני. משך assay הוא מוגבל בדרך כלל 6 או 12 שעות לאחר גירוי אנטיגן שכן הן Brefeldin וMonensin, אשר מתווספים בדרך כלל תוך 2 שעות של בנוסף אנטיגן, הם רעילים לתאים. ICS assay הוא טכניקה רבת עוצמה שהייתה לי שימושיn החקירה של ההשפעה של in vivo ממשל של חסימת התערבות נוגדנים בעכברים שבו תאים שהוצאו לאחר תקופה מסוימת של זמן לאחר חשיפת נוגדן 9. עם זאת, ישנן מספר מגבלות ליישום של גישה ניסויית זה כדי להעריך את ההשפעה של המצור על קולטנים מעכבים בדגימות אנושיות. בעת ביצוע התערבויות נוגדן של מסלולים מעכבים בגירוי 6 או 12 שעות במבחנה (בדרך כלל במקרה של דגימות אנושיות), המצור על קולטנים מעכבים ברוב המקרים אינו משנה את התדירות של תגובת תאי T אנטיגן הספציפי כפי שהיא נמדדת על ידי מבחני סטנדרטיים ICS 6, 7. מדידות של ייצור ציטוקינים לכל תא כפי שהיא נמדדת על ידי עוצמת הקרינה ממוצעת או החציוני נתנו תוצאות לא עקביות 6, 7, 10. מצד השני, כאשר ICS מתבצע בנקודת זמן מאוחר לאחר גירוי (כלומר שישה ימים), שינויים במספר ג מפרישי ציטוקיניםניתן לצפות אמות. ההבדלים הם השפעה משולבת של התפשטות שהשתנתה, הישרדות, ושינויים בתפקוד מפעיל המצטברים על פני תקופת הזמן המוגדרת 6. דרך אחת להתגבר באופן חלקי על המגבלות האלה היא כדי לדגור במשך תקופות זמן ארוכות יותר (36 שעה למשל, 60 שעה, וכו '.) עם האנטיגן לפני התוספת של חוסם הפרשת ציטוקינים מבלי להמתין ללהתרחש התפשטות. אנחנו השתמשנו בהצלחה בשיטה זו כדי לקבוע את קינטיקה של הפרשת ציטוקינים על ידי תאי CD4 ו CD8 T-HIV הספציפיים 11,12, עם זאת, גישה זו אינה מסוגלת לזהות את תגובות קטנות ולא תיתן תוצאה משולבת של סך הפרשת ציטוקינים המתרחשת מאז גירוי. לכן, ICS הוא לא מספיק שיטה רגישה כדי לזהות את ההשפעה של מצור של מסלולים מעכבים על הכמות של ציטוקינים המיוצרת על ידי תאי T מופעלים לעומת quantitation ציטוקינים mRNA או מדידות של הפרשת ציטוקינים בsupernatanלא באותן נקודות הזמן. בנוסף, רוב ציטוקינים המיוצרים על ידי תאי T מופעלים לפעול באופנה autocrine על ידי תרומה למשוב חיובי או שלילי לולאות באמצעות אינטראקציה עם תאי המציגים אנטיגנים. לכן, תוספת של Brefeldin או Monensin במהלך assay ICS מונעת הפרשת ציטוקינים וכך הגירוי של תאי T הוא לא אופטימלי. לבסוף, זיהוי של ציטוקינים מרובים עם ICS הוא מוגבל על ידי זמינה והרגישות של נוגדנים לזיהוי של ציטוקינים עם cytometry זרימה, כמו גם מאילוצים במספר fluorochromes, שניתן להשתמש בו זמנית בכל פנל נתון.

פיתחנו במבחנה גישה ניסויית רגישה מאוד כדי להעריך את ההשפעה של מסלולי immunoregulatory בויסות הפרשת ציטוקינים על ידי תאי T מסוג CD4 HIV-ספציפיים ולאחר מכן עזרה CD4 לאנטיגן הצגת תאים (נגמ"שים) ותאי הרג טבעי (תאי NK). גם בשיטה זו ניתן להשתמש כדי להעריך את סבלנותct של מצור של מולקולות מעכבות על תפקוד תאי CD8 T על ידי depleting תאי T מסוג CD4 מPBMCs או על ידי גירוי עם פפטידים אופטימליים שמוכרים רק על ידי תאי CD8 T. בניגוד למבחני מכתים ציטוקינים תאיים, החלטנו שלא להתערב בהפרשת ציטוקינים על ידי תאי T מסוג CD4 HIV-ספציפיים על מנת להיות מסוגל: 1) לבצע כימות מדויק יותר של רמות ציטוקינים המיוצרים; 2) לחקור פנל רחב יותר של ציטוקינים או מולקולות מפעיל: 3) להעריך את ההשפעה של ציטוקינים המיוצרים על ידי תאי T מסוג CD4 HIV-ספציפיים על תת תא אחר. אנו לעורר PBMCs המדולדלת CD8 עם בריכת פפטיד Gag-HIV-1 בנוכחות חסימת נוגדנים למסלול immunoregulatory של עניין. לאחר הזמן הרצוי של דגירה, בדרך כלל 48 שעות, אנו אוספים supernatants למדוד הפרשת ציטוקינים עם מערכי חרוז ולאסוף את כדורי תא או לניתוח פנוטיפי של תת תא אחר או לניתוח תעתיק. של לב, בזמן t48 נקודת זמן שעות שלו, אנחנו לא לזהות אוכלוסייה משמעותית של תאים מתרבים T 12. זוהי גישה גמישה וכמה עיבודים של עיצוב זה יכול להיות מיושמים לטיפול בהשערות שונות. לדוגמא, תת תאים הבודדים (כגון תאי HIV-ספציפיים T מסוג CD4 או PD-1 תאי T מסוג CD4 גבוהים, וכו '.) ניתן למיין לאחר 12 שעות של דגירה לפני דגירה נוספת ל36 שעה אחריו אוסף של supernatants וכדורי תא כדי לחקור באופן ספציפי יותר את ההשפעה של התערבויות מצור על הפרשת ציטוקינים על ידי אוכלוסיות מוגדרות של PBMCs.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. דלדול ובידוד של PBMCs באמצעות הפרדת Ficoll

  1. לרוקן תאי CD8 + T על ידי הוספת קוקטייל דלדול אדם CD8 + ב50 / מיליליטר μl של דם מלא.
  2. מערבבים היטב דגירה עבור 20 דקות בטמפרטורת חדר (18-25 ° C).
  3. לאחר דגירה, לערבב דם כל עם HBSS (תמיסת מלח מאוזנת של האנק ללא Ca 2 + או Mg 2 +) ושכבה מעל Histopaque. ספין ב340 RCF ל30 דקות (לא בלם, האצה איטית).
  4. לאסוף PBMCs ולהעביר לחרוטי 50ml חדשים. לשטוף 2x עם 45 RPMI מיליליטר 1640 בתוספת 50 IU פניצילין, 50 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, 2 מ"מ L-גלוטמין, וHEPES 1% על ידי ספינינג 10 דקות ב 340 RCF.

2. מצור נוגדנים וגירוי אנטיגן ספציפי של תאים

  1. תאי resuspend ב2x10 6 לכל מצב בRPMI 1640 מכיל 10% סרום אדם בתוספת 50 IU פניצילין, 50 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, 2 מ"מ L-גלוטמין, ו -1% HEPES,היווה 500 μl לכל מצב.
  2. Aliquot 500 μl של תא השעיה לכל צינור FACS.
  3. בהתאם למסלול שנחקר, להוסיף PD-L1, IL-10Rα חסימת נוגדנים ו / או בקרות אלוטיפ ב10 מיקרוגרם / מיליליטר ו דגירה במשך 15 דקות ב37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  4. לעורר תאים עם בריכת פפטיד HIV-1 Gag בריכוז סופי 1 מיקרוגרם / מיליליטר / פפטיד. כמו כן כולל שליטת "אין גירוי" לכל מצב חסימה. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 48 שעות.

3. איסוף וניתוח של supernatant

  1. לאחר 48 שעות, ספין למטה צינורות FACS ל7 דקות ב340 RCF.
  2. לאסוף בזהירות 2 x 225 supernatant μl בצינורות Eppendorf עבור מערכי חרוז Luminex מבלי להפריע גלולה.
  3. להשבית וירוס בsupernatant נאסף עם 25 μl 0.5% PBS-Tween לתת ריכוז סופי של 0.05% PBS-Tween.
  4. supernatants חנות שנאסף שאינם immediately משמש ב-80 ° C במקפיא.
  5. למדוד ריכוזים ציטוקינים רצויים באמצעות ערכת Millipore Luminex על פי הפרוטוקול של היצרן.

4. איסוף וניתוח פנוטיפי של תאים באמצעות cytometry הזרימה

  1. לאחר איסוף supernatant, לשטוף תאים ב-PBS 3ml. ספין תאים למשך 7 דקות ב340 RCF ולמזוג לשטוף עודף.
  2. כתם לכדאיות באמצעות ערכת כתם תאים מתות בשידור חי / DEAD ניתן לתקן על פי הפרוטוקול של היצרן.
  3. שטפו תאי PBS למשך 7 דקות ב340 RCF וב 4 ° C. Resuspend ב 100 μl FBS 1% PBS.
  4. אם מכתים את מונוציטים או תאי המציגים אנטיגנים אחרים, קולטני Fc בלוק על ידי הוספת 1.4 μl של FCR חסימה מגיב ומערבולת לערבב.
  5. דגירה של 10 דקות ב 4 ° C.
  6. הוספת נוגדני פני השטח, מערבולת, ו דגירה של 20 דקות ב 4 ° C בחושך.
  7. שטוף תאים עם FBS 1% PBS, למזוג שטיפה עודפת, ולהוסיף 200 paraformaldehyde μl 4%. לדגורבטמפרטורת חדר למשך 20 דקות בחושך.
  8. שטוף תאים עם FBS 1% PBS, resuspend ב 250 μl FBS 1% PBS, ולרכוש בmultilaser cytometer זרימה (לדוגמא BD LSRII או Fortessa).

5. ניתוח של תאים באמצעות qRT-PCR

  1. לתאים לא ניתח באמצעות cytometry זרימה: לאחר איסוף supernatant, תאי lyse ב300 μl RLT Qiagen המאגר המכיל 1% בטא mercaptoethanol. אם לא ממשיך בפרוטוקול, ניתן להקפיא תאים ב -80 ° C לאחר שלב זה.
  2. בודד RNA באמצעות ערכת בידוד RNA הבאה הפרוטוקול של היצרן.
  3. לסנתז cDNA מ-RNA באמצעות ערכת סינתזת cDNA הבאה הפרוטוקול של היצרן.
  4. לבצע PCR כמותיים תוך שימוש בטכנולוגית SYBR ירוק.
  5. ליצור תמהיל פריימר עבור כל צבע יסוד המשמש כוללים גנים משק בית (למשל IL-13, IL-10, IFN-γ, GAPDH) על ידי הוספת פריימרים לnuclease ללא מים לתת ריכוז סופי של 10מיקרומטר. שמור על קרח.
  6. יצירת תערובת הורים עבור כל צבע יסוד על ידי הוספת מים 10.5 μl nuclease חינם, 12.5 ירוק SYBR μl, ותמהיל פריימר μl 1 לכל צלחת היטב. שמור על קרח.
  7. פיפטה תערובת הורים 24 μl לבאר כל הצלחת שתשמש.
  8. הוספת cDNA μl 1 היטב כל אחד על פי תבנית.
  9. כובע בארות וצלחת צנטריפוגות במשך 3 דקות ב800 RCF.
  10. הפעל צלחת על מכונה qRT-PCR, למשל מכשיר Stratagene MX3005P.

6. הסתגלות לתאית ציטוקין הכתמה ב48 שעות

הוספת Brefeldin וMonensin 6 שעות לפני מכתים ציטוקינים תאיים. Brefeldin מתווסף בריכוז של 10 מיקרוגרם / מיליליטר בזמן Monensin מתווסף על פי הוראות יצרן. לנוחיותכם, ניתן להוסיף Brefeldin 12 שעה לפני להכתים בריכוז של 5 מיקרוגרם / מיליליטר.

  1. אחרי כתם פני השטח, לשטוף תאים עם FBS PBS 1% וכתם בציטוקינים tracellular כגון IL-12, IFN-γ, ו-TNF-α באמצעות ערכת קיבוע / permeabilization פתרון ופרוטוקול.
  2. שטוף תאים, resuspend ב 250 μl FBS 1% PBS, ולהפעיל על multilaser cytometer זרימה (LSR למשל BD השני או Fortessa).

7. הסתגלות למיון תאים

  1. 16 שעות לאחר גירוי, כתם לכדאיות באמצעות ערכת כתם תאים מתות בשידור חי / DEAD ניתן לתקן על פי הפרוטוקול של היצרן. שמור את התאים על קרח במהלך ההליך כולו.
  2. שטוף תאים עם PBS במשך 7 דקות ב340 RCF וב 4 ° C. Resuspend ב 100 μl FBS 1% PBS.
  3. הוספת נוגדני פני השטח, מערבולת לערבב, ותאי דגירה על קרח בחושך עבור 20 דקות.
  4. שטפו תאים עם FBS 1% PBS ב340 RCF וב 4 ° C ו resuspend ב 500 μl RPMI הקר 1640 המכיל 10% בסרום שור עוברי בתוספת 50 IU פניצילין, 50 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, 2 מ"מ L-גלוטמין, ו -1% HEPES.
  5. תאי סינון באמצעות 5 מיליליטר פוליסטTube מסביב לתחתית רנה עם מכסה תא מסננת.
  6. הכן צינורות איסוף למין על ידי הוספת 200 RPMI μl 1640 המכיל 10% בסרום שור עוברי בתוספת 50 IU פניצילין, 50 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, 2 מ"מ L-גלוטמין, וHEPES 1% לצינור אחד. שמור את כל הצינורות על קרח במהלך מיון.
  7. בשידור חי למיין את תת התא של ריבית על מכשיר (לדוגמא BD FACS Aria II) ממוקם במתקן המצויד לחומרים ביולוגיים מסוכנים.
  8. אחרי התאים מוינו, תאי מקום בחזרה בחממה לסכום רצוי של זמן ופעל עם ניתוח אוסף supernatant / Luminex וניתוח אוסף התא גלולה / ה-PCR.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בעת ביצוע מדידות ציטוקינים באמצעות מערכת זו במבחנה, זה הכרחי כדי להיות מסוגל להבחין בין תגובות אנטיגן הספציפי בהשוואה לשום שליטת גירוי. באופן כללי, אנחנו נחשבים לתגובות חיוביות כמו כל ערכים של גירוי אנטיגני שנותנות עלייה לפחות פי שלוש ברמות ציטוקינים בהשוואה לשום שליטת הגירוי ושהיו בתוך הטווח ליניארי של assay. אנחנו משתמשים במבחני רגישות גבוהים מערך חרוז שיכול לזהות ריכוזים של ציטוקינים נמוכים כמו 0.16 pg / ml, מה שמאפשר לנו להתבונן בתגובות אנטיגן הספציפי חלשות T מסוג CD4...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אוסף supernatant הוא חלק הכרחי של עיצוב ניסיוני זה. כאשר קצירת supernatants עבור assay Luminex, aliquots נעשו והמשיכו ב-80 ° C כדי למנוע פירוק חלבונים בשל ההפשרה להקפיא מחזורים. הקפאה והפשרה יכולה להיות תהליכים קשים לחלבונים, ועל ידי מזעור הקפאה מפשירה, אות תהיה מוגדלת במבחנים. לכן, קל יותר להשיג נתונים הדיר ומדויקים יותר כאשר עובדים מaliquots כי כבר-מופשר הקפאה אותו מספר הפעמים.

אנחנו ביצענו בעבר ניתוח הקינטית ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

אנו מודים לגורדון פרימן למתן נוגדן החסימה אנטי PD-L1. אנו מודים לצוות הרפואי ומעבדה בבית החולים הכללי מסצ'וסטס וכל משתתפי המחקר לתפקיד רב הערך שלהם בפרויקט זה.

מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות של המכונים הלאומיים לבריאות (PO1 AI-080,192; DEK), הלאומי ללב ריאות ודם מכון של המכון הלאומי לבריאות (RO1 HL-092,565; DEK). DEK נתמך פרס קריירה Scholar המחקר של בריאות קרן המחקר לקוויבק (FRQS) על ידי. FP נתמך על ידי מענק מלגה של כללי וועד הפועל של בית החולים מסצ'וסטס על מחקר והמוסד לבריאות הגלובלית של הרווארד (HGHI).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תמיסת מלח מאוזנת של הנקס ללא Ca2+ או Mg2+SigmaH9394
RPMI 1640SigmaR0883
Histopaque-1077Sigma10771
סרום אנושי ABGemini BioProducts100-512
פניצילין/סטרפטומיציןMediatech30 001 CI
L-גלוטמיןMediatech25 005 CI
HEPES מאגרMediatech25060CI
FcR מגיב חוסם, אנושיMiltenyi130-059-901
RosetteSep Human CD8 + דלדול קוקטייל תאי גזע15663
LIVE / DEAD ערכת כתמי תאים מתים לתיקון, עבור עירור UVInvitrogenL23105
Rneasy Mini KitQiagen74104
Improm-II מערכת תמלול הפוךPromegaA3800
Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master MixAgilent600830
BD Cytofix/Cytoperm קיבוע/פרמיביליזציה ערכת פתרוןBD554714
Tween-20FisherBP337100
IFN-γ פריימרInvitrogenFOR: CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA
GAPDH פריימרInvitrogenעבור: TCATCATCTCTGCCCCCTCTCT rev: AGTGATGGCATGGACTGTGG

מקורות

  1. Zajac, A. J., et al. Viral immune evasion due to persistence of activated T cells without effector function. J. Exp. Med. 188, 2205-2213 (1998).
  2. Wherry, E. J., Blattman, J. N., Murali-Krishna, K., vander Most, R., Ahmed, R. Viral persistence alters CD8 T-cell immunodominance and tissue distribution and results in distinct stages of functional impairment. J. Virol. 77, 4911-4927 (2003).
  3. Kwon, D. S., Kaufmann, D. E. Protective and detrimental roles of IL-10 in HIV pathogenesis. Eur. Cytokine Netw. 21, 208-214 (2010).
  4. Porichis, F., Kaufmann, D. E. Role of PD-1 in HIV pathogenesis and as target for therapy. Curr. HIV/AIDS Rep. 9, 81-90 (2012).
  5. Wherry, E. J. T cell exhaustion. Nat. 12, 492-499 (2011).
  6. Trautmann, L., et al. Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction. Nat. Med. 12, 1198-1202 (2006).
  7. Day, C. L., et al. PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression. Nature. 443, 350-354 (2006).
  8. Brockman, M. A., et al. IL-10 is up-regulated in multiple cell types during viremic HIV infection and reversibly inhibits virus-specific T cells. Blood. 114, 346-356 (2009).
  9. Barber, D. L., et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 439, 682-687 (2006).
  10. Zhang, J. Y., et al. PD-1 up-regulation is correlated with HIV-specific memory CD8+ T-cell exhaustion in typical progressors but not in long-term nonprogressors. Blood. 109, 4671-4678 (2007).
  11. Ndhlovu, Z. M., et al. High-dimensional immunomonitoring models of HIV-1-specific CD8 T-cell responses accurately identify subjects achieving spontaneous viral control. Blood. 121, 801-811 (2013).
  12. Porichis, F., et al. Responsiveness of HIV-specific CD4 T cells to PD-1 blockade. Blood. 118, 965-974 (2011).
  13. Kwon, D. S., et al. CD4+ CD25+ regulatory T cells impair HIV-1-specific CD4 T cell responses by upregulating interleukin-10 production in monocytes. 86, 6586-6594 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

T CD4 HIVPD 1IL 10RFicollLuminexqRT PCRGag HIV
במבחנה Assay כדי להעריך את ההשפעה של immunoregulatory מסלולים על פונקצית Effector הנייד HIV-ספציפית T מסוג CD4
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.