פורסים תרבות השיטה למעקב אחר ההתפתחות של חיידקים בשיני explant תרבות

סיכום

כאן אנו פירוט שיטה לחיידקים שן תרבות בפרוסות לסת תחתונה באמצעות מסוק רקמות. שיטה זו מאפשרת גישה ייחודית לשן במהלך פיתוח, מתן הזדמנות מצוינת למניפולציה ושושלת מעקב, אינו זמין בשיטות תרבות מסורתיות יותר.

תקציר

תרבות explant מאפשרת מניפולציה של פיתוח איברים בנקודות זמן ספציפי ולכן שיטה חשובה לביולוג התפתחותי. לאיברים רבים שקשה לגשת לפיתוח רקמות על מנת לאפשר ניטור בזמן vivo התרבות לשעבר. שיטת התרבות הפרוסה מאפשרת גישה לרקמה, כך שיכולות להיות אחרי תנועות morphogenetic ואוכלוסיות תאים ספציפיות יכולות להיות ממוקדות עבור מניפולציה או התחקות שושלת.

במאמר זה אנו מתארים שיטה של ​​התרבות הפרוסה שהייתה מוצלח מאוד לתרבות של חיידקי שן במגוון מינים. השיטה מספקת גישה מצוינת לחיידקי השן, אשר לפתח בקצב דומה לזה שנצפה בvivo, מוקף ברקמות לסת האחרות. זה מאפשר אינטראקציות רקמות בין השן והרקמה שמסביב כדי להיות במעקב. למרות שמאמר זה מתמקד בחיידקי שן, באותו הפרוטוקול ניתן ליישם כדי לעקוב אחר התפתחותם של מספרשל איברים אחרים, כגון בלוטות רוק, סחוס של מקל, בלוטות באף, בלשון, ובאוזן.

מבוא

עבור מספר הניסויים חשוב להיות מסוגלים רקמות תרבות vivo לשעבר לעקוב אחר התפתחות. תרבות של פיתוח רקמה מספקת גישה בתקופות מוגדרות של פיתוח ומאפשרת מניפולציה של גנים על ידי התוספת של גורמים למדיום התרבות, או בחרוזים טעונים, ועל ידי השימוש בtransfection electroporation ^ו1. בניסויים רבים, חשוב להיות מסוגל לדמיין את הרקמה ככל שהוא גדל, לדוגמא, כדי לעקוב אחר גורלם של תאי שושלת מתויגת כרקמה עוברת המורפוגנזה. זה יכול להיות בעייתי במיוחד לרקמות המתפתחות עמוק בתוך העובר, שאינן ברורים כאשר בלוק של רקמות מן העובר הוא תרבותי. שיניים הן דוגמאות טובות לכך, כפי שהם מפתחים בתוך תהליך האף הלסת התחתונה, הלסת העליונה וקדמי. כאשר כל הלסת התחתונה היא בתרבית ניתן לראות המבנים השטחיים של השן אך ניתן לנתח שינויים במורפולוגיה רק ​​לאחר חתך של רקמה קבועה 2. יש לנו להתאים טכניקת תרבות פרוסה חיות ומאפשרת לנו לעקוב אחר התפתחות חיידקים בשיניים ובמתן גישה לחלקים השונים של השן במהלך פיתוח. תרבויות טכניקת פרוסות נבט שן בממשק גז הנוזלי, באמצעות שיטת Trowell שונה ^3. תרבויות הפרוסה אלה היו מאוד שימושיות באופן ישיר הבא המורפוגנזה של השן, ומאפשר איתור שושלת של רכיבים שונים, כגון קשר האמייל ואת הגבשושיות וזקיק ^1,4-7 שיניים. הטכניקה אינה מוגבלת לעוברי עכברים והצלחה כבר בשימוש לפרוסות תרבות חיות של חזיר ^ו8,9 רקמות שיניים נחש. בנוסף ליתרון של להיות מסוגל לדמיין התפתחות שן, שיטת פרוסה גם יש את היתרון שהפרוסות הדקיקות של רקמה הגדילו את הגישה לחומרים מזינים מבינונית ואוויר מהחממה. התוצאה היא צמיחה משופרת של חיידקי השן, אשר תואם את פיתוח in vivo, וinvas המופעיון של תאי האנדותל לפטמית ^7. לעומת זאת, חיידקי שן בתרבויות לסת תחתונה כולו לפתח איטיים יותר מאלה in vivo ומרכז התרבות הוא לעתים קרובות נמקים בתרבויות לטווח ארוך. בתרבות הפרוסה, השן מתפתחת בתוך פרוסה של הלסת, והאינטראקציה שלה עם העצם מתפתח סביב ורקמות אחרות יכולה להיות במעקב. בשיטה שלנו הרקמה קצוצה ישר אחרי נתיחה ללא צורך להטביע במדיום תמיכת ^10,11 ואין צורך בכל מערכת לצרף את הרקמה לקרש החיתוך. השיטה היא לכן לא פולשנית ומהירה, המאפשרת ללסתות רבות להיות מחולקים בפגישה אחת.

פרוטוקול

1. להקים

1. חידוד המכשירים לנתיחה (באמצעות אבן השחזה משומנת עם שמן מינרלים) ולעקר לפני השימוש לתרבות איבר באמצעות 70% תרסיס אתנול ועיקור יבש חום. לחדד את המחטים לנתיחה באמצעות אלקטרוליזה ב2 M נתרן הידרוקסידי באמצעות הספקה 12V.
2. הכן את מדיום התרבות המשמש לנתיחה והתרבות של איברים עובריים, בהיקף של F12 של מתקדם השתנה Dulbecco נשר בינוני (F12 DMEM) בתוספת 1% Glutamax ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין.

2. Dissection עובר

1. לברור נקבה בהריון הזדווגו מתוזמן באמצעות שיטת לוח זמנים אחד כפי שאושר על ידי משרד הפנים או גוף מנהל אחר. משם לנתח את העור באזור הבטן התחתון, וחתך את הבטן באמצעות מספריים. אתר את שתי קרנות הרחם, אשר מתחברות יחד על קו האמצע התחתון.
2. לנתח את הרחם ואת המקום בצינור מלא בינוני על קרח. When על קרח, הרקמה ניתן להשאיר לכמה שעות.
3. הסר את הרחם ומניחים בצלחת פטרי במדיום מתחת למיקרוסקופ. איפה יש לבצע ניתוחי עובר אפשריים במינרית זרימת מכסה המנוע כדי למזער את הזיהום.
4. לנתח את העוברים מהרחם ולשחרר אותם מרקמות extraembryonic.
5. לערוף את העוברים באמצעות מחט טונגסטן ולהעביר את הראשים לתוך צלחת טרי של מדיום.
6. לבודד את הלסתות מראשי על ידי הצבת מחט לתוך חלל הפה ולחתוך לכיוון החלק האחורי של הראש (איורים 1 א ו 1 ב '). לסתות מבודדות יכולות להיות מאוחסנות באופן זמני במדיום על קרח בעת שהמתינו לקיצוץ.
7. לפרוסות לסת תחתונה כל שלבי E11.5-E15.5 הם אידיאלי עבור תרבות נבט שן. לאחר E15.5 העצם מתפתח בלסת התחתונה הוא קשה מדי לקיצוץ. פרוסות שיניים עדיין יכולות להתבצע אך העצם (עצם מכתשיים dentary ויוצרים) חייב להיות ראשון הוסר על ידינתיחה לפני קיצוץ ^9. הסרת עצם בזהירות באמצעות מחטי טונגסטן ומלקחיים.

3. חיתוך עובר

1. הכן את פרוסות רקמת הלסת התחתונה באמצעות מסוק רקמת שולחן סטנדרטי (איור 1 ג). השתמש בלהב חדש לאחר כ 200 לסתות, ולוודא שהוא נמצא מיושר עם דיסק ההתקנה כאשר הוא נופל.
2. נקה את תקליטור ההתקנה ולהב עם אתנול 70% לפני השימוש. יש לנקוט זהירות בעת שימוש במכונה, כפי שהלהב הוא חד מאוד.
3. הגדר את המסוק במרחק חיתוך של בין 200-400 מיקרומטר בהתאם לגיל של הדגימה, ותלויים אם נדרש כל נבט השן. הגדר את כוח הלהב על מקסימום.
4. העבר את לסת תחתונה לדיסק הרכבת הפלסטיק באמצעות פיפטה או מלקחיים. מסדרים את הלסת התחתונה על הדיסק כדי לוודא את הכיוון הוא עדיין ברור. לשון הפיתוח יכולה לשמש ציון דרך שימושית לקביעת כיוון. לaf שימוש טוחנותrontal / נטייה רוחבית (ראה מטוס של קיצוץ באיור 1 ב '), ואילו לחותכות להשתמש פרוסה sagittal דרך הלסת התחתונה על מנת לשקף את הכיוון של שיניים אלה שונים כאשר הם גדלים (ראו מטוס של קיצוץ באיור 2 א).
5. הסר את המדיום העודף מרחבי הרקמות באמצעות נייר סינון על מנת לייבש את הלסת התחתונה על דיסק ההרכבה מעט.
6. מייד לאחר ייבוש, הנח את הדיסק על שולחן הנירוסטה העגול של המסוק. הדלק את המכשיר ולחץ להתחיל. השולחן עובר באופן אוטומטי משמאל לימין ואילו באותו הזמן זרוע ביצוע קיצוץ הלהב עולה וירד במהירות של עד 200 משיכות / דקה.
7. כבה את המחשב ברגע שהרקמה כבר פרוסות לחלוטין. ודא זרוע הלהב היא במצב המורם ולהסיר את הדיסק. אל תניח את אצבעות מתחת לזרוע הלהב או להשאיר את המכונה ללא השגחה כאשר קיצוץ.
8. קח את דיסק ההרכבה ולהוסיף t הבינוני באופן מיידיo את הפרוסות על הדיסק על מנת למנוע ייבוש מוגזם. לעקור בזהירות את הרקמה הפרוס מהחלק התחתון של הדיסק באמצעות מחט טונגסטן ולאחר מכן טפטפת לתוך צלחת פטרי קטנה של מדיום (איור 2 א).
9. הפרד את הפרוסות באמצעות מחט ולאחר מכן בחר את פרוסות רקמה המכילות הרקמות של עניין תחת סטראו (1D דמויות, 1E, ו2B). מניחים פרוסות נבחרות בתרבות מנות טריות עם מדיום.

4. פורסים תרבות

1. הכן מנות התרבות מרכזיות היטב איבר מוכנות לתרבות על ידי הוספה כ 2 מיליליטר של מים autoclaved אל הבאר החיצונית על מנת למנוע התייבשות, ועל ידי מיצוב רשת מתכת על פני מרכז הצלחת (3A דמויות ו3B).
2. הכן את רשתות מתכת על ידי חיתוך רצועות כ 4 סנטימטר x 1.5 סנטימטר מיריעות של רשת הנירוסטה. השתמש ניקוב חורים לעשות חור במרכז ולכופףהצדדים כדי ליצור סוף מעד. הרשת צריכה להתאים שטוחה על פני הבאר המרכזית, שוכבת במקביל לתחתית הצלחת (3A דמויות ו3B). החיטוי הרשתות לעקר לפני השימוש.
3. חותכי חתיכת קרום (PET) (גודל נקבובית 0.4 מיקרומטר) גדול מספיק כדי לכסות את החור ברשת של terephthalate פוליאתילן השקוף. מניחים את הקרום לחתוך לתוך הצלחת עם הפרוסה שנבחרה.
4. מניחים את הפרוסה על גבי הקרום ולאחר מכן הרם בזהירות את הקרום מבינוני, עם פרוסה שיטחה במרכז.
5. הנח את המסנן על הרשת מעל החור העגול במרכז, ולהוסיף כ 1 מיליליטר של מדיום תרבות היטב, עד לרמה של הממברנה.
6. למניפולציות להוסיף חלבונים או מעכבי מולקולה קטנים לבינוניות (לדוגמא ^8).
7. לצלם את הפרוסה לשיא של מורפולוגיה ביום 0 של התרבות.
8. מניחים את הכלים באווירת humidified של 5% CO _{2 על 37 מעלות צלזיוס בחממה.}
9. לצלם את התרבויות במרווחי זמן קבועים בממוצע 7 ימים. לשנות את התרבות בינונית בכל שעה 48-72. לצילום להציג את הפרוסות עם מקור אור מלמטה (איורים 2C-E).

5. איתור שושלת

אם נדרש איתור שושלת, ניתן להזריק לתוך נבט שן צבעי lipophilic כגון DiI או Dio לפני שלב 4, התרבות הפרוסה.

1. משוך מחטי זכוכית נימים באמצעות חולץ מחט.
2. לשבור את קצה המחט באמצעות מלקחיים ומניח את הקצה למטה לתוך תמיסת הצבע. השאר לכמה דקות בזמן שהצבע ממלא את הקצה על ידי פעולת נימים.
3. מניחים את המחט מלאה לבעל ולצרף דרך צינורות אל aspirator מזרק או פה.
4. מקם את קצה המחט במדיום תרבות נגיעה באזור של הפרוסה בשל להיות מתויגים. החל לחץ אוויר כדי לתפוס כמות קטנה של צבע מתוך המחטד על גבי הרקמה.
5. הסר את המחט ולבדוק לתיוג תחת הקרינה.
6. ניתן להעביר פרוסות כותרתו בהצלחה למסננים ותרבותיים כפי שמתואר בשלב 4.

תוצאות

על מנת לעקוב אחר התנועה של זקיק השיניים טוחנת הראשון, נלקחו 250 מיקרומטר פרוסות קדמיות דרך לסת תחתונה בשיטה שתוארה לעיל. זקיק השיניים הוא השכבה של mesenchyme שמקיף את האפיתל האמייל החיצוני (OEE) של השן המתפתחת, ובעבר הוכח לקחת חלק בהיווצרות של רקמה של periodontium ^6. לסתות נותחו בE14.5, שלב הכובע של התפתחות שן. בפרוסה את קווי המתאר של אפיתל השיניים היו ברור, וmesenchyme השיניים העיבוי יכול להיות מזוהה כטבעת כהה מסביב (איור 4 א) אפיתל השן. DiI הוזרק בmes...

דיון

שיטה זו של תרבות שן יש את היתרון שהגישה לניבט השן הוא מצוין, המאפשר ייחוס מדויק באיתור מיקום של חרוזים בתוך האפיתל או mesenchyme. באזורים מוגדרים של נבט השן המתפתח יכולים להיות ממוקדים ולכן באופן ספציפי. במהלך תרבות המורפולוגיה המשתנות של נבט השן יכולה להיות אחריו, ואת ההשפעה של מניפולציות העריכה במהירות.

השיטה, לעומת זאת, מתאימה רק לחיידקי שן צעירים לפני היווצרות משמעותית של רקמות קשות, כגון הדנטין ואמייל, שכן א...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אתנול	VWR	101077Y	100% אתנול דולל ב-H2O מזוקק ל-70%.
DMEM F12	Gibco	12634-010	Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12
GlutaMAX	Gibco	35050-061
פניצילין-סטרפטומיצין	Sigma	P0781
DiI (בדיקות מולקולריות)	Vybrant	V-22885	פתרון
	Invitrogen		Cell Tracker CM-DiI, C-7000
DiO ( בדיקות מולקולריות)	Vybrant	V22886
Geminator 500	תומאס	תומאס מס' 3885A20	עיקור בחום יבש
מסוק רקמות McIlwain	Ted Pella, Inc.	10180	בטבלה סטנדרטית
(צלחת תרבית איברים במרכז באר)	ממברנות 353037
(מוסיף תרבית תאים, 0.4 μ גודל נקבוביות מ')	BD Falcon	353090	PET קרום חרוט מסלול, פורמט 6 בארות
רשתות מתכת (נירוסטה - AISI 304 - רשת)	Goodfellow	FE228710	(Fe / Cr18 / Ni10)
AutoFlow Direct Heat CO2< / sub> חממה	Nuaire	NU-5500
Picospritzer III	Intracel Ltd	051-0500-900 0-100 psi	חד ערוץ פיקוספריצר III
נימי זכוכית עם נימה 1 מ"מ	WPI	TW100F-4
חוט טונגסטן 0.1 מ"מ		Goodfellow
0.38 מ"מ	W005155		Goodfellow
	Sigma	A5177	משמש לעוקבי שושלת שאיבת פה