Microinjection מתא בודד לניתוח תקשורת נייד

Summary

אנו מתארים כאן כיצד לבצע microinjection מתחיל מתא בודד הצהוב לוציפר לדמיין תקשורת סלולרית באמצעות-צומת פער בתאים חיים, ולספק כמה עצות שימושיות. אנו מצפים כי מסמך זה יעזור לכולם להעריך את מידת צימוד הסלולר בשל צומת פער פונקציונליים. הכל המתואר כאן יכול להיות, באופן עקרוני, מותאמי צבעי ניאון אחרים עם משקל מולקולרי להלן 1,000 Daltons.

Abstract

צמתים של פער הם ערוצים בין-תאיים המאפשרים תקשורת של תאים שכנים. תקשורת זו תלויה בתרומה של חצי ערוץ על ידי כל תא שכן ליצירת צומת הפער. בתאי יונקים, תעלת החצי נוצרת על ידי שישה קונקסינים, מונומרים עם ארבעה תחומים טרנסממברניים ומסוף C ו- N בתוך הציטופלזמה. צמתים מרווחים מאפשרים החלפת יונים, שליחים שניים ומטבוליטים קטנים. בנוסף, יש להם תפקידים חשובים בצורות רבות של תקשורת תאית בתהליכים פיזיולוגיים כגון העברה סינפטית, התכווצות לב, צמיחת תאים והתמיינות. אנו מפרטים כיצד לבצע מיקרו-הזרקה של תא בודד של לוציפר צהוב כדי לדמיין תקשורת תאית באמצעות צמתים מרווחים בתאים חיים. צפוי כי בצמתים של פערים פונקציונליים, הצבע יתפזר מהתא הטעון לתאים המחוברים. זוהי טכניקה שימושית מאוד לחקר צמתים מרווחים מכיוון שאתה יכול להעריך את דיפוזיה של הקרינה בזמן אמת. אנו דנים כיצד להכין את התאים ואת המיקרופיפטה, כיצד להשתמש במיקרומניפולטור ולהזריק צבע פלואורסצנטי בעל משקל מולקולרי נמוך בקו תאי אפיתל.

Introduction

צמתים הפער הם ערוצי אינטר המאפשרים אינטרקום בין תאים שכנים ^1. תקשורת זו המחברת בין שני תאים או יותר השכנות, שבהן כל אחד תורם עם connexon או hemichannel כדי ליצור את ערוץ אינטר. בתאי יונקים, את connexon נוצר על ידי שישה connexins, מונומרים עם ארבעה תחומים הטרנסממברני ו- C ו- N מסוף בתוך הציטופלסמה ^2. צמתים הפער לא רק לאפשר מעבר של יונים, שליחים משניים מטבוליטים קטנים, אלא גם לתרום הרבה צורות של תקשורת סלולרית בתהליכים פיזיולוגיים רבים, כגון העברה סינפטית, התכווצות הלב, צמיחת תאים ו ^{-3 בידול, 4, 5, 6, 7, 8.} בנוסף צומת פער נקשרומחלות רבות כולל סרטן ^{9, 10,} ניוון שרירים ^11, כמה מחלות גנטיות demyelinating ¹² מחלות.

סוג זה של crosstalk בין תאית יכול להיות מוערך על ידי מספר שיטות ^{13, 14, 15, 16.} במאמר זה, אנו מראים כיצד לבצע microinjection מתחיל מתא בודד הצהוב לוציפר לדמיין תקשורת סלולרית באמצעות-צומת פער בתאים חיים. אנו דנים כיצד להכין את התאים ואת micropipette, את השימוש של micromanipulator והזרמת לצבוע צהוב לוציפר בקו תא אפיתל הרתי. בדרך כלל, הליך ניסיוני זה יכול להיות מנותח על ידי הממוצע של תאי מחוברי התא טעון עם צבע. בנוסף, שיטה זו יכולה לשמש עם צבעי ניאון אחרים עם משקל מולקולרי מתחת הפערצומת חתוכים המהווה כ -1,000 Daltons.

Protocol

1. הכנת תאים

1. יש לשמור על תרבות של קו תא אפיתל הרתי (IT76M1) או תא להיבדק באינקובטור (37 ° C / 5% CO _2).
2. שוטפים את התאים עם PBS 1x (לחזור פריט זה 3x).
3. להוסיף טריפסין על התאים למשך 5 דקות.
4. הוסף בינוני (פעמים מהיקף טריפסין הוסיף בסעיף 1.3) עם 10% FBS (בסרום שור עוברי) אל התאים עם טריפסין ו צנטריפוגות (800 XG במשך 5 דקות).
5. ספירת התאים ב hemocytometer.
6. התאם את הצפיפות של תאים בהתאם לסוג התא כמו התאים צריכים להיות בקשר הדוק עם שני כדי לאפשר צימוד. הערה: במקרה שלנו, השתמשנו 3 x 10 ⁵ תאים לכל 35 מ"מ צלחת פטרי.

2. הכנת Micropipette

1. משוך את micropipette כמפורט מתוך micropipette נימי זכוכית (1.5 מ"מ קוטר) על סופי 0.2 מיקרומטר של קוטר כדי להשיג התנגדות סופית של כ -30 MΩf "> ^{17, 18.}
   הערה: לחלופין, טפטפות הזרקה ניתן לרכוש. ההתנגדות תלוי בגודל התא, כמו למשל microelectrode עמידות גבוהה יותר יהיה צורך עבור תאי acinar הלבלב, למשל (100-150 MΩ) ^19. בעיה נפוצה שעלולה להתרחש היא ממטרים של פתרון צהוב לוציפר אז מה שיכול להכשיל את micropipette והן עשויות לחייב סינון או צנטריפוגה מוקדמת. לפני ההזרקה, micropipette יש לנתח תחת מיקרוסקופ כדי לזהות אם קיימת חסימה או כל סוג של הפרעה ^13. את micropipette יכול להיבדק על ידי הזרקת LY עם קצה micropipette בתוך תמיסת מלח.

3. בדיקת Micropipette

1. הכן את הפתרון צהוב לוציפר (5%) ב -150 mmol / L LiCI ולטעון את micropipette באמצעות מזרק או למלא את משבצות (מכניס אותו פתרון LY).
2. מניחים את micropipeטטי על צלחת פטרי 35 מ"מ עם תאי IT76M1 בתחנת עבודת microinjection ו להטביע את קצה micropipette הזכוכית לתוך המדיום הסלולרי. דגש על micropipette ולבצע בדיקה זורם לצבוע ידי החלת דופק.

4. תא בודד לוציפר צהוב Microinjection

1. פוקוס מיקרוסקופ ממש מעל שכבת התאים באמצעות קטיון fi Magni גבוהה (40X), ואז להנמיך את פיפטה לאט אל התאים באמצעות micromanipulator.
2. לנקב את תא המטרה כאשר הקצה הוא קרוב עד כדי נגיעת קרום התא, ולהחיל דופק hyperpolarizing קטן להציג את LY לתוך התא. המתח להחיל יהיה תלוי מטען נטו של צבע כדי להיות מוזרק. לחילופין, ישנם צבעים אחרים יכולים לשמש עם הטכניקה הזו כפי שמוצג בטבלה 1.
   הערה: באופן עקרוני כל צבע הידרופילי עם MW פחות 1KDa יוכל לשמש. עם זאת, את קצב ההעברה יכול להשתנות על פי המשקל hydrophilicity. בנוסף, uהעברת Nspecific של צבע המשמש חייבת להיות מוערכת.
3. צלמו תמונות תא 3 דקות לאחר הזרקת צבע או לעשות סרט קטן עם מיקרוסקופיה זמן לשגות (30 fps).
   הערה: גישה דומה ניתן היה לראות היטומי ואח '(2015) ^20. כדי למנוע תקשורת באמצעות גשרים בין תאית (מיטוזה שלמה) חברת dextran שיתוף הזרקת rhodamin (מ 2 עד 10 KDA), אשר אינו עוברת דרך צומת פער אבל עוברת דרך גשרים בין תאית וסוגים מסוימים של nanotubules המומלץ כפי שמוצג באיור 2 .

Results

תא אפיתל הרתי קו IT-76MI שמש להעריך צימוד לצבוע ידי צומת פער כמו תאים אלה תוארו להביע צומת פער פונקציונליים נוצרו על ידי connexin 43 ^21. איור 1 מציג את הזריקה של לוציפר צהוב כשהם מיושמים בתא אחד מתחת קצה פיפטה. לאחר כמה דקות, תאים המחוברים להיות ניאון (כוכביות) המציין את הדיפוזיה של צבע פלואורסצנטי דרך צמתים הפער. מספר התאים והזמן הפך פלורסנט מזוהה ישירות עם מידת תקשורת סלולרית בין תאים אלה. איור 2 מציג את ה...

Discussion

כדי לאמת את הנוכחות של צומת הפער בין תאית פונקציונלי, להשתמש באמצעים, אשר קרום חדיר, למרות חדיר ידי ערוצי אינטר נדרשים ^16. והעמסה, צבע פלואורסצנטי הראשון להבחין תא אל תא צימוד ^22, הוא חדיר בין ממברנות הלא junctional ³ ו הוחלפה ולכן על ידי צבע צהוב לוציפר ^15. בשלב זה, כדי למצוא את הבחירה הטובה ביותר בין הסוגים השונים של קליעים נותבים ניאון תלוי בהיקף ותנאי הניסוי. ההליך של טעינת תא עם צב...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
לוציפר צהוב	Sigma	L0259
ליתיום כלוריד	Sigma	L4408
PBS טבליות	סיגמא	P4417
RPMI	Sigma	R4130
סרום עוברי בקר	Cultilab
Trypsin	Sigma	T4799
שולחן מבודד רעידות	ניופורט	VH3036W-OPT	יש צורך בשולחן מבודד רטט כדי להגן על הניסויים מפני רעידות ולמנוע נזק לתאים
מיקרומניפולטור	Narishige	MMO-203	ציוד זה מאפשר התאמות מדויקות של המיקרופיפטה, הדרושה להזרקת מיקרו תאים.
מחולל נוכחי	Digitimer	DS2	כדי לייצר את זרימת הצבע דרך המיקרופיפטה, ניתן זרם מתחת לננו אמפר אחד באמצעות מחולל זרם עם אלקטרודה בתוך המיקרופיפטה או מגבר בעל מעגל פיצוי קיבול (אלקטרומטר ישן) או פונקציות הזרקת זרם של מגברי מהדק תיקון חדשים, וחוט ההארקה שקוע בצלחת הצלחת. לחלופין, ניתן להזריק את הצבע על ידי מיקרו-מזרק פנאומטי, בהתאם להמלצות המפעל.