מאמר שיטה

בתכנות מחדש vivo של תאים סומטיים למבוגרים לpluripotency ידי ביטוי יתר של גורמי יאמאנאקה

15K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50837

⸱

17 בדצמבר 2013

 ,  ,  , 
1Nanomedicine Lab, UCL School of Pharmacy, University College London, 2Nanomedicine Lab, Faculty of Medical & Human Sciences, University of Manchester

במאמר זה

סיכום

מחקר זה מדגים את התכנות מחדש של תאים סומטיים לקראת פלוריפוטנטיות in vivo ללא יצירת טרטומות. השתמשנו בהזרקת וריד זנב הידרודינמית של DNA פלסמיד המקודד את גורמי Yamanka כדי לגרום לתכנות מחדש in vivo של הפטוציטים בוגרים לתאים בעלי פלוריפוטנטיות מוגברת.

תקציר

תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPS) הנובעים מתכנות מחדש של תאים סומטיים למצב פלוריפוטנטי על ידי ביטוי מאולץ של גורמים מוגדרים מציעים הזדמנויות חדשות לרפואה רגנרטיבית. יישומים קליניים כאלה של תאי iPS היו מוגבלים עד כה, בעיקר בשל היעילות הירודה של מתודולוגיות התכנות מחדש הקיימות והסיכון של תאי iPS שנוצרו ליצור גידולים עם ההשתלה.

שיערנו כי ניתן להשיג תכנות מחדש של תאים סומטיים לקראת פלוריפוטנטיות in vivo על ידי העברת גנים של גורמי תכנות מחדש. על מנת לתכנת מחדש ביעילות תאים in vivo, רמות גבוהות של גורמי השעתוק של Yamanaka (OKSM) צריכות להתבטא ברקמת המטרה. ניתן להשיג זאת על ידי שימוש בווקטורים שונים של גנים נגיפיים או לא נגיפיים בהתאם לרקמת המטרה. במחקר הספציפי הזה, נעשה שימוש בהזרקת וריד זנב הידרודינמי (HTV) של DNA פלסמיד כדי להעביר את גורמי OKSM להפטוציטים של עכברים. זה סיפק הוכחה לתכנות מחדש in vivo של תאים בוגרים וסומטיים לקראת מצב פלוריפוטנטי עם יעילות גבוהה וקינטיקה מהירה. יתר על כן, לא נצפתה היווצרות גידול או טרטומה באתרם.

ניתן להסיק כי תכנות מחדש של תאים סומטיים in vivo עשוי להציע גישה פוטנציאלית לגרימת פלוריפוטנטיות משופרת במהירות, ביעילות ובבטחה בהשוואה לפרוטוקולים המבוצעים במבחנה וניתן ליישם אותם על סוגי רקמות שונים בעתיד.

מבוא

חששות אתיים לגבי השימוש בתאי גזע עובריים היו אחת המגבלות בפיתוח מחקר תאי גזע. עם זאת, התגלית של יאמאנאקה ועמיתיו כי ביטוי מאולץ של ארבעה גורמי שעתוק (כלומר: Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc (OKSM)) יכול להוביל לתכנות מחדש במבחנה של תאים סומטיים לתאים פלוריפוטנטיים, הנקראים תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPS), פתחה הזדמנויות חדשות. העברת גניםויראלית 1-5 ו-6-10 לא ויראלית, טרנסלוקציה ציטופלזמית של חלבון11,12 וטרנספקציה של miRNA13-16 הן בין השיטות השונות המשמשות כיום ליצירת תאי iPS. עם זאת, מתודולוגיות תכנות מחדש כאלה סובלות מבעיות שונות המגבילות את תרגומן לקליניקה, כגון: א) מגבלות חמורות ביעילות התכנות מחדש של התאים; ב) השימוש העיקרי בווקטורים ויראליים; ג) פרוטוקולים ארוכים ורב-שלביים של תנאי תרבית; וד) הסיכון לגידול על ידי השתלת תאי iPS שנוצרו במבחנה 17-20.

העברת גנים של גורמי שעתוק מוגדרים3-5 על ידי רטרו-וירוסים היא השיטה הנפוצה ביותר לתכנות מחדש של תאים סומטיים. עם זאת, הוא מכיל את הסיכונים מהאפשרות של מוטגנזה החדרתית, התמרה יציבה וביטוי פרוטו-אונקוגן לטווח ארוך21,22. נחקרו גם וקטורים להעברת גנים לא ויראליים כגון DNA פלסמיד6,7,23 או העברת RNA10 באמצעות ליפוזומים או אלקטרופורציה. בעוד שהם בטוחים יותר בהשוואה לווירוסים, וקטורים אלה מציעים יעילות התמרה ותכנות מחדש מוגבלת משמעותית24,25 .

אחת הדוגמות המרכזיות של תחום מתפתח זה היא שהשתלה in vivo של תאי iPS תוביל להתמיינות בלתי מבוקרת שלהם ולהיווצרות מסה דמוית גידול (טרטומה), המורכבת מרקמות שונות משלוש שכבות הנבט השונות. לכן, הרעיון של תכנות מחדש לפלוריפוטנטיות התמקד בעיקר במניפולציות חוץ גופיות של תאים סומטיים ראשוניים שחולצו (לרוב פיברובלסטים). עם זאת, כפי שתואר לעיל, עיקרון זה סובל מפרוטוקולים ארוכים ומורכבים של תרביות תאים, כולל סבבי טיפול מרובים (העברת גנים, גורמי גדילה, אנטיביוטיקה, נוגדי חמצון) שעלולים בעצמם להגביר את הסיכון להיווצרות טרטומה או צורות אחרות של גידול עם השתלת התאים24-28.

אנו מציעים כי תכנות מחדש של תאים סומטיים בוגרים in vivo על ידי ביטוי יתר חולף של גורמי השעתוק OKSM אינו מוביל להיווצרות מאוחרת יותר של טרטומות29. השיטה להשיג זאת תהיה תלויה בהשגת רמות גבוהות של ביטוי גורם שעתוק בתוך רקמת המטרה בצורה הבטוחה ביותר האפשרית. במחקר זה, בחרנו בטכנולוגיית העברת גנים מבוססת ללא וירוסים שהוכחה כמכוונת ביעילות לכבד על מנת לתכנת מחדש תאים לפלוריפוטנטיות in vivo. טכנולוגיה זו כוללת הזרקת וריד זנב הידרודינמי מהיר בנפח גדול (HTV) של DNA פלסמיד30,31. ניתן להשיג רמות ביטוי גבוהות של גנים שעברו טרנספטציה בהפטוציטים בוגרים בעקבות שיטת העברת גנים לא ויראלית זו. יתר על כן, טכנולוגיה זו ממזערת את הסיכונים הפוטנציאליים משימוש בווקטורים נגיפיים (למשל החדרה גנומית קבועה, מוטגנזה החדרתית).

פרוטוקול

1. תכנות מחדש של רקמת הכבד in vivo על ידי HTV מתן pDNA

  1. אפשר לעכברי Balb/C נקבות, בני 6 שבועות, להתאקלם במתקן בעלי החיים למשך שבוע לפני ביצוע הליך כלשהו.
  2. הכינו 0.9% מלח במים מזוקקים וסננו דרך מיקרופילטר של 0.22 מיקרומטר.
  3. הכן תמיסה עם 75 מיקרוגרם pCX-OKS-2A ו-75 מיקרוגרם של pCX-cMyc DNA פלסמיד ב-1.5 מ"ל 0.9% מלח לעכבר. הערה: נפח ההזרקה הכולל חייב להיות בין 8-10% ממשקל הגוף הכולל.
    הערה: לפני ההזרקה, שמור את העכברים בתא חימום בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שניתן יהיה לראות בקלות את ורידי הזנב ולהיראות מורחבים.
  4. לגרום להרדמה עם איזופלורן לפני (בתא החימום) ובמהלך ההזרקה (עם מסכת הרדמה).
  5. יש לתת את תמיסת ה-pDNA או בקרת מי מלח עם מזרק 27 גרם על ידי הזרקת HTV. הערה: כדי שהטרנספקציה תצליח, יש להזריק את הנפח הכולל תוך לא יותר מ-5-7 שניות.
  6. עקוב אחר כך שבעלי החיים מתאוששים כראוי מההזרקה.

2. זלוף כבד ובידוד של הפקטוציטים ראשוניים למחקרי qRT-PCR

  1. בנקודות זמן שונות, כולל 2, 4, 8, 12 ו-24 ימים לאחר הזרקת HTV, יש לגרום להרדמה עמוקה עם איזופלורן.
  2. ריססו 70% אתנול על בטן החיה, בצעו חתך דרך העור בקו האמצע הגחוני בעזרת מספריים כירורגיים ונתחו את שכבת שריר הבטן כדי לחשוף את הקרביים.
  3. חותכים את הסרעפת כדי לחשוף את חלל בית החזה בעזרת מספריים ומהדקים את וריד הקאווה בעזרת מלקחיים נעילה.
  4. עקור את הקרביים ימינה ואת אונות הכבד כך שגם הקאווה התחתונה וגם וריד הפורטל יהיו נגישים בקלות.
  5. קנול את וריד הקאווה התחתון עם קטטר 22 G וחתוך את וריד הפורטל כדי למנוע לחץ עודף.
  6. התחל את הזילוף עם 10 מ"ל של מאגר HBSS (ללא Ca2+ ו-Mg 2+, עם ביקרבונט), שחומם מראש ב-37 מעלות צלזיוס.
  7. המשיכו את הזלוף עם Liver Digest Medium, שחומם מראש ב-37 מעלות צלזיוס, בקצב זרימה של 0.6 מ"ל/דקה (למשך 15 דקות) עד שהכבד מתנפח ורופף. הערה: עיכול וזלוף מוגזמים עלולים לפגוע בהפטוציטים או בתאים שתוכנתו מחדש.
  8. המשך את הניסוי ב-4 מעלות צלזיוס.
  9. הסר את הכבד במלקחיים לאחר חיתוך הרצועות הפלציפורמיות והכליליות ושטוף אותו עם מדיום שטיפת הפטוציטים, תוך העברתו דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר לקבלת תרחיף תאים.
  10. אסוף את תרחיף התאים בצינורות של 50 מ"ל והתאם את הנפח ל-15 מ"ל עם Hepatocyte Wash Medium.
  11. צנטריפוגה את תרחיף התא ב-50 גרם למשך 4 דקות. שמור על הטמפרטורה על 4 מעלות צלזיוס. השלך את הסופרנטנט (המכיל קופפר ותאי אפיתל) והשהה מחדש את כדורית התא (המכילה את הפטוציטים) ב-10 מ"ל של מדיום שטיפת הפטוציטים. הערה: יש להשעות את כדור התא בזהירות רבה, הפטוציטים הם תאים שבירים מאוד.
  12. חזור על הליך הצנטריפוגה בסך הכל שלוש פעמים והשהה מחדש את הגלולה הסופית ב -10 מ"ל של מדיום שטיפת הפטוציטים.
  13. הערך את מספר התא באמצעות מיקרוסקופ אופטי והמוציטומטר.
  14. הכן ציטוטים של 2 x 106 תאים, צנטריפוגה ב 300 x g כדי לשחזר את כל התאים ולהשליך את הסופרנטנט.
  15. בשלב זה, ניתן להקפיא את כדור התא ולשמור אותו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לעיבוד נוסף או להשתמש בו מיד למיצוי ה-RNA.

3. מחקר ביטוי גנים של הפטוציטים מבודדים לוויסות יתר של גנים פלוריפוטנטיים

  1. חלץ RNA מ-2 x 106 תאים עם ערכת עמודות ספין בהתאם להוראות הספק.
  2. השתמש ב-1 מיקרוגרם של ה-RNA המופק כדי לבצע qRT-PCR דו-שלבי בהתאם להוראות הספק.
  3. השתמש בהפטוציטים של בעלי החיים שהוזרקו במי מלח כבקרה כדי לתקן את ביטוי הגנים היחסי של תכנות מחדש, פלוריפוטנטיות וסמני הפטוציטים.

4. ניתוח ציטומטריית זרימה של פלוריפוטנטיות משופרת ברמת החלבון

  1. בימים 1 ו-4 לאחר ההזרקה, בצע זלוף כבד ובודד הפטוציטים ראשוניים כפי שצוין לעיל.
  2. התאם את צפיפות התאים ל-1 x 107 תאים/מ"ל והכן 100 מיקרוליטר אליקוטים.
  3. תקן את התאים עם מאגר קיבוע BD Cytofix וחלחל עם מאגר סלסול/שטיפה 1x BD.
  4. דגרו את התאים עם OCT4-PerCP-Cy5.5 נגד עכבר או נגד עכבר Nanog-PE למשך 30 דקות.
  5. כלול בקרות שליליות ואיזוטיפ.
  6. נתח את התאים המוכתמים על ידי CyAn ADP High Performance Research Flow Cytometer.

5. צביעה חיסונית של חתכי כבד לסמנים של פלוריפוטנטיות

  1. ארבעה ימים לאחר ההזרקה, יש להחדיר את הכבד כפי שצוין לעיל אך רק עם מאגר HBSS על מנת להוציא את הדם מרקמת הכבד.
  2. חותכים חתיכת רקמת כבד וטובלים אותה ב-2-מתילבוטן (מקורר מראש בחנקן נוזלי) על מנת להמשיך בהקפאה.
  3. ניתן לשמור רקמות קפואות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס או לחתוך ישירות בחלקים בעובי 14 מיקרומטר באמצעות קריוסטט.
  4. יבש באוויר את חלקי הטישו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר ולאחר מכן תקן עם מתנול, מקורר מראש ב-20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. יבש באוויר למשך 15 דקות ולאחר מכן שטוף את החלקים פעמיים עם PBS (5 דקות כל אחד).
  5. דגרו את החלקים במאגר חוסם (5% סרום עיזים-0.1% טריטון ב-PBS pH 7.3) בטמפרטורת החדר למשך שעה, ולאחר מכן שני שלבי כביסה עם מאגר כביסה (1% BSA-0.1% טריטון ב-PBS, pH 7.3).
  6. דגרו את חלקי הרקמה למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם נוגדנים ראשוניים נגד OCT4, anti-SOX2 ו-anti-Nanog.
  7. למחרת, שטפו את החלקים 3x (5 דקות כל אחד) עם מאגר כביסה ודגרו אותם למשך שעה וחצי בטמפרטורת החדר עם הנוגדן המשני.
  8. שטפו את חלקי הכבד עם PBS (3x, 5 דקות כל אחד) והרכיבו אותם במדיום המכיל DAPI ואנטי-פייד.
  9. דמיין את השקופיות תחת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי.

6. פוספטאז אלקליין (ALP) צביעה של קטעי רקמת כבד

  1. השג קטעי רקמת כבד כמתואר קודם.
  2. מחממים את חלקי הרקמה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות לפני ביצוע הצביעה.
  3. יש לתקן עם 4% פרפורמלדהיד למשך 2 דקות. הערה: זמן קיבוע מוגזם יכול להפחית את פעילות ALP.
  4. יבש את החלקים באוויר למשך 30 דקות ולאחר מכן דגירה עם מצע נוזלי BCIP/NBT ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  5. שטפו את המגלשות במים מזוקקים והרכיבו עם אמצעי הרכבה מימיים.
  6. צלם תמונות אקראיות במיקרוסקופ אור.

7. כימות רמות אלבומין ואנזימי כבד בסרום להערכת רעילות הכבד

  1. בימים 4, 8, 12 ו-120 לאחר הטרנספקציה, אספו 300 מיקרוליטר דם ישירות מחדר הלב.
  2. שמור את הדם על קרח בזמן איסוף הדגימות השונות כדי למנוע קרישה.
  3. לאחר שכל הדגימות מוכנות, יש לדגור למשך 30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס עד לקרישי דם.
  4. צנטריפוגה את הדגימות ב-2,000 x גרם למשך 5 דקות.
  5. פיפטה בזהירות את הסרום (בסופרנטנט) לצינור אפנדורף חדש והקפיא בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לעיבוד הדגימות.
  6. נתח את רמות הסרום עבור אלבומין, ALT, AST, ALP ו-GLDH.

8. המטוקסילין ואאוזין (H&E) וצביעת חומצה-שיף תקופתית (PAS) של חלקי כבד להערכת רעילות הכבד

  1. בנקודות זמן שונות, כולל 2, 4, 8, 12, 24, 50 ו-120 ימים לאחר הזרקת HTV; בצע זלוף כבד עם מאגר HBSS רק כפי שתואר קודם לכן.
  2. חותכים חתיכת רקמת כבד ומקבעים פנימה 4% פרפורמלדהיד.
  3. הטמיעו רקמת כבד בגושי פרפין, חתך וצביעה עם צביעת H&E או PAS.
  4. צלם תמונות אקראיות במיקרוסקופ אור.

תוצאות

איור 1 מציג סקירה כללית של הפרוצדורה, הכוללת העברה של פלסמידים המקודדים ל-OKSM לכבד של עכברים, ואת הטכניקות השונות שבוצעו כדי לצפות בתכנות מחדש של תאים in vivo. בעקבות הזרקה של הפלסמידים בשיטת HTV, נצפתה עלייה משמעותית בביטוי הגנים של גורמי התכנות המחדש שהועברו (Oct3/4, Sox2, Klf4, ו-cMyc) ברמת ה-mRNA ביום השני לאחר ההזרקה. הביטוי של גורמים אלו פוחת עם הזמן לאחר ההזרקה, כפי שמוצג ב-איור 2a. בנוגע לביטוי של סמני פלוריפוטנטיות אנדוגניים (Nanog, Ecat1 ו-Rex1), רמותיהם עלו באופן משמעותי בהשוואה לאלו של הפטוציטים מבעלי חיים שהוזרק להם תמיס סליין ביום 2 ו-4 לאחר ההזרקה, וחזרו לרמות הבסיס מהיום ה-8 ואילך (איור 2b). במקביל, דדפרנציאציה של אוכלוסיית ההפטוציטים אוששה על ידי דיוון של גנים ספציפיים להפטוציטים (Alb, Aat, ו-Trf), שהיה מובהק סטטיסטית ביום 4 והגיע לרמות הבסיס מהיום ה-8 ואילך (איור 2d).

נבדק הביטוי של Oct3/4 ו-Nanog ברמת החלבון באמצעות ציטומטריה של זרימה. כפי שמוצג ב- איור 2גרק Oct3/4 מבוטא ביום ה-1 לאחר הזרקת HTV, בעוד שעבור ביטוי של סמן הפלוריפוטנטיות האנדוגני Nanog היה צורך להמתין עד ליום ה-4.

התרחשותו של תכנות תאים מחדש in vivo אוששה עוד יותר באמצעות אנליזה אימונוהיסטוכימית של רקמות כבד עם נוגדנים anti-OCT4, anti-SOX2 ו-anti-Nanog, ובאמצעות צביעה ספציפית לפעילות ALP. תאים חיוביים לכל הסמנים ולפעילות האנזימטית נמצאו באופן עקבי ברקמות כבד של חיות שהוזרקו ב-OKSM, אך לא בקבוצות הביקורת שהוזרקו בתמיסת מלח (איור 3).

תופעות הלוואי הרעילות האפשריות והיווצרות טרטומה כתוצאה מתכנות מחדש של תאים in vivo באמצעות הזרקת pDNA ב-HTV נבחנו על ידי כימות רמות אנזימי כבד בסרום, וכן צביעות H&E ו-PAS של חתכי רקמת כבד לאורך תקופה של 120 ימים. סימנים חולפים ולא חמורים של נזק רקמתי נצפו עד היום השני, אך לא לאחר מכן. לא נצפתה היווצרות של טרטומות או כל סימן לדיספלזיה או לשינויים מורפולוגיים במהלך תקופת המחקר (Figure 4). לא היו חריגות מבניות או תפקודיות בכבד לאורך מהלך המחקר באף אחת מהחיות, כפי שאושש על ידי רמות אלבומין ואנזימי כבד וצביעת גליקוגן של חתכי רקמה (Figures 4b and c).

הזרקת גורמי תכנות מחדש in vivo, דיאגרמת עכבר, פלסמיד, אנליזה של רקמה, PCR, ציטומטריה.
איור 1. סקירה סכמטית של הליך תכנות מחדש in vivo והאנליזה שלו. הפרוטוקול כולל שני שלבים עיקריים: (i) מתן גורמי תכנות מחדש in vivo ו-(ii) הפקת רקמה ואנליזה של דגימות. לחצו כאן להצגת איור גדול יותר.

ניתוח ביטוי גנים; תרשימי עמודות עם נתוני ביטוי יחסי לאורך ימים; איורים א-ד; תוצאות מדעיות.
איור 2. ביטוי יתר in vivo של גורמי השעתוק של Yamanaka בכבד של עכבר בוגר. עכברי Balb/C קיבלו הזרקה מסוג HTV של תמיסת סלין 0.9% לבדה, 75 μg של pCX-OKS-2A ו-75 μg של pCX-cMyc בתמיסת סלין 0.9%, ובימים 2, 4, 8, 12, 24, בוצע ניתוח RT-qPCR של הפטוציטים כדי לקבוע את ביטוי הגנים היחסי של: (א) גורמי השעתוק שהועברו (OKSM) ו(ב) סמני פלוריפוטנטיות אנדוגניים; (ג) ניתוח ציטומטריה של זרימה של תאים חיוביים ל-OCT3/4 ותאים חיוביים ל-Nanog; (ד) ביטוי גנים יחסי של סמני הפטוציטים כפי שנקבע באמצעות RT-qPCR. כל רמות ביטוי הגנים נורמלו לקבוצת ה-HTV שהוזרקה סלין. (* p<0.05 מציין הבדל מובהק סטטיסטית בהשוואה לקבוצות ה-HTV שהוזרקה סלין, שהתקבל על ידי ניתוח שונות ומבחן השוואה זוגי של Tukey). האיור הותאם מתוך Yilmazer et al.29 לחצו כאן להצגת איור גדול יותר.

השוואת מיקרוסקופיית אימונופלורסצנציה של OCT4, SOX2, NANOG בתאים שטופלו בתמיסת מלח לעומת תאים שטופלו ב-OKSM.
איור 3. תכנות מחדש של תאים In vivo ברקמת כבד של עכבר בוגר באמצעות אימונוהיסטוכימיה. עכברי Balb/C שקיבלו הזרקת HTV של תמיסת מלח 0.9% בלבד, 75 μg של pCX-OKS-2A ו-75 μg pCX-cMyc בתמיסת מלח 0.9%. ביום 4, נאספו כבדים וחתכי רקמה קפואים נצבעו עם נוגדנים anti-OCT4, anti-SOX2 או anti-Nanog להערכת התגובה האימונולוגית, או ב-BCIP/NBT לקביעת פעילות ALP ברקמה (40X). פסי קנה מידה מייצגים 100 μm. האיור עובד מתוך Yilmazer et al.29 לחץ כאן להצגת איור גדול יותר.

היסטולוגיה של הכבד, רמות אנזימים ואלבומין בטיפול במי מלח לעומת OKSM, תוצאות הניסוי.
איור 4. השפעת תכנות מחדש של תאים in vivo על תפקוד הכבד ועל פתולוגיה היסטולוגית. עכברי Balb/C שקיבלו הזרקה של HTV של 75 μg של pCX-OKS-2A ו-75 μg של pCX-cMyc ב-0.9% saline או 0.9% saline בלבד. בימים 2, 4, 8, 12, 50 ו-120 בוצעו בידוד ועיבוד של רקמות כבד וסרום עבור: (a) צביעת H&E; (b) רמות של אנזימי כבד; (c) רמות אלבומין; (d) צביעת PAS. תמונות מייצגות צולמו במיקרוסקופ אור (10X). סרגי קנה מידה מייצגים 100 μm. איור מותאם מ-Yilmazer et al.29 לחץ כאן להצגת איור גדול יותר.

דיון

מחקר זה מספק ראיות עקרונות לתכנות מחדש של תאים in vivo לקראת פלוריפוטנטיות בעקבות העברה יעילה וביטוי יתר של גורמי OKSM לכבד העכבר הבוגר. בעזרת טכניקות שונות כגון qRT-PCR, ציטומטריית זרימה, IHC או ניתוח סרום, רקמת המטרה נחקרה כדי לצפות בתכנות מחדש של תאים in vivo . מהר מאוד מהשראת ביטוי יתר של גורם OKSM ברקמה, סמני פלוריפוטנטיות היו מווסתים ברמות ה-mRNA והחלבון (תוך 48 שעות). במהלך הניסויים הללו, בין 5-15% מהתאים שחולצו מהרקמה הוכחו כחיוביים ל-Nanog ו-Oct3/4. יתר על כן, לא נצפו חריגות מבניות או תפקודיות בכבד במשך 120 יום. ביטוי של טרנסגנים על ידי הזרקת HTV של DNA פלסמיד ברקמות שאינן כבד (ריאות, טחול, כליות ולב) דווח בעבר, אולם רמות ביטוי הגנים היו נמוכות לפחות ב-3 סדרי גודל מאלו בהפטוציטים30. הנתונים במחקר זה מצביעים על כך שתכנות מחדש של תאים סומטיים לקראת מצב פלוריפוטנטי in vivo הוא בטוח, מהיר ויעיל. לאור רוב מתודולוגיות התכנות מחדש של תאים במבחנה הקיימות שבדרך כלל משיגות יצירת תאים פלוריפוטנטיים (iPS) תוך 3 שבועות עם פחות מ-1% מהיעילות32, תכנות מחדש in vivo לפלוריפוטנטיות עשוי להציע חלופות מעניינות מאוד. אנו משערים כי ניתן ליישם את הרעיון של תכנות מחדש in vivo לפלוריפוטנטיות על סוגים שונים של תאים סומטיים בעלי יעילות גבוהה (תלוי בווקטור בו נעשה שימוש), אולם יהיה צורך לקבוע את רמת הפלוריפוטנטיות התפקודית שהושגה בתאים שתוכנתו מחדש in vivo . יתר על כן, עם פיתוח פרוטוקולים וטכנולוגיות משופרים, ניתן יהיה לחלץ תאים מתוכנתים מחדש in vivo ולהשתמש בהם למטרות רפואה רגנרטיבית.

ישנם כמה צעדים קריטיים שיש לבצע על מנת לתכנת מחדש תאים בוגרים וסומטיים in vivo ביעילות גבוהה. השגת רמות גבוהות של ביטוי גנים ברקמת המטרה היא תנאי מוקדם. במחקר זה זה הומחש על ידי שימוש בהעברה וביטוי יעילים של DNA פלסמיד להפטוציטים באמצעות הזרקת HTV. הגורמים החשובים ביותר להזרקת HTV הם הנפח, שאמור להיות בין 8-10% ממשקל הגוף הכולל של בעל החיים, ומהירות ההזרקה, אותה יש לבצע תוך 5-7 שניות. אין להשתמש בעכברים מתחת לגיל 6 שבועות, מכיוון שהזרקת HTV עלולה לגרום לנזק רב יותר לרקמות בכבד, מה שעלול להשפיע על יעילות התכנות מחדש של התאים. לרקע הגנטי של בעלי החיים לא הייתה השפעה על קביעת היעילות של תכנות מחדש in vivo , שכן דיווחנו בעבר על רמות דומות של תכנות מחדש הן בעכברי Balb/C והן בעכברי TNG-A, האחרון הוא זן טרנסגני הנושא את מדווח ה-eGFP המוחדר ללוקוס Nanog וגדל על רקע Sv12929.

אנו משערים כי ניתן ליישם תכנות מחדש של תאים in vivo למצב פלוריפוטנטי (שיהיה צורך לקבוע) על סוגי רקמות אחרים בתנאי שגורמי OKSM מועברים ביעילות לתאי המטרה, ומאפשרים רמות גבוהות של ביטוי גנים. מגוון של וקטורים להעברת גנים לא נגיפיים וויראליים נחקרו בניסויים פרה-קליניים וקליניים על מנת להתמקד בסוגי תאים ורקמות שונים33. לדוגמה, עבור רקמות עצביות או עיניים, נגיפים הקשורים לאדנו היו הבחירה הווקטורית המועדפת להעברת גנים יעילה in vivo 34-37, בעוד שברקמת שריר הוכח כי הזרקות DNA פלסמיד עירום מביאות לרמות גבוהות יחסית של ביטוי גנים38,39. לכן, יש לבחור בקפידה את השיטה של וקטור העברת גנים בהתאם לסוג הרקמה על מנת להשיג תכנות מחדש יעיל ומהיר של תאים in vivo לקראת מצב פלוריפוטנטי.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

עבודה זו נתמכה באופן חלקי על ידי מועצת המחקר להנדסה ומדעי הפיזיקה (EPSRC, סווינדון, בריטניה) ותוכניות FP-7 של הנציבות האירופית NANONEUROHOP (PIEF-GA-2010-276051) ו-ANTICARB (HEALTH-2008-20157). AY נתמכה על ידי מלגת דוקטורט במשרה מלאה ממשרד החינוך (טורקיה) ו-IL מכירה בתמיכה חלקית מהמועצה הבריטית וקרן CAIXA (ספרד). למממנים לא היה כל תפקיד בתכנון המחקר, איסוף וניתוח נתונים, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
pCX-OKS-2A pDNAAddgene19771מתקבל מ-Addgene כדקירה חיידקית, ייצור פלסמיד שבוצע במפעל פלסמיד (גרמניה)
pCX-cMycAddgene19772מתקבל מ-Addgene כדקירה חיידקית, ייצור פלסמיד שבוצע במפעל פלסמיד (גרמניה)
0.22 μ m מסנןMillioporeSLGP033RS
IsofluraneAbbottB505
HBSS bufferSigma-AldrichH6648Ca2+ ו-Mg2+ חינם, עם ביקרבונט
Liver DigestMedium Gibco17703-034
Hepatocyte Wash MediumGibco17704-024
100 & מו; מסננת תאים mBD Biosciences352360
ערכת Nucleospin RNA IIMacherey-Nagel740955.25ערכה לבידוד RNA מתאים ורקמות
ערכת סינתזת cDNA iScriptBio-Rad170-8890
iO SYBR Green SupermixBio-Rad170-8880
Oct3/4 רצף סיגמא פריימר קדימהניתן בהערותTGAACCTTCAGGAGATATGCAA
Oct3/4 פריימר הפוךסיגמאשניתן בהערותCTCAATGCTAGTTCGCTCTCTTCTC
Sox2 פריימר קדימהרצף סיגמאניתן בהערותGGTTACCTCTTCCTCCCCCACCAG
Sox2 פריימר הפוךרצף סיגמאשניתן בהערותTCACATGTGCGACAGGGGCAG
C-myc קדימה פריימררצף סיגמאשניתן בהערותCAGAGGAGGAACGAGCTGAAGCGC
C-myc פריימר הפוךסיגמאשניתן בהערותTTATGCACCAGAGTTTCGAAGCTGTTCG
פריימר קדימה Nanogסיגמאשניתן בהערותCAGAAAAACCAACCAGTGGTTGAAGACTAG
רצף סיגמא פריימר הפוך של Nanogשניתן בהערותGCAATGGATGCTGGGATACTC
Ecat1 קדימה פריימררצף סיגמא ניתן בהערותTGTGGGGCCCTGAAAGGCGAGCTGAGAT
Ecat1 פריימר הפוךסיגמאשניתן בהערותATGGGCCCCCATACGACGACGCTCAACT
Rex1 פריימר קדימהרצף סיגמאשניתן בהערותACGAGTGGCAGTTTTTCTTCTTGGGA
Rex1 פריימר הפוךסיגמאניתן בהערותTATGACTCACTTCCAGGGGGCACT
Alb קדימה פריימרסיגמארצף שניתן בהערותGTTCGCTACACCCAGAAAGC
Alb פריימר הפוךסיגמאשניתן בהערותCCACACAAGGCAGTCTCTGA
Aat קדימה פריימרסיגמאניתן בהערותCAGAGGAGGCCAAGAAAGTG
Aat פריימר הפוךסיגמאשניתן בהערותATGGACAGTCTGGGGAAGTG
Trf קדימה פריימרסיגמארצף שניתן בהערותACCATGTTGTGGTCTCACCGA
Trf פריימר הפוךרצף סיגמאניתן בהערותACAGAAGGTCCTTGGTGGTG
B אקטין קדימה פריימרסיגמאניתן בהערותGACCTCTATGCCAACACAGT
B אקטין פריימר הפוךסיגמאשניתן בהערותAGTACTTGCGCTCAGGAGGA
BD מאגר קיבוע ציטופקסBD Biosciences
1x BD סלסול/שטיפה מאגרBD Biosciences560585
נגד עכבר OCT4-PerCP-Cy5.5BD Biosciences560585
נגד עכבר Nanog-PEBD Biosciences560585
2-מתילבוטןסיגמא-אולדריץ'M32631
X100-טריטוןסיגמא-אולדריץ'X100-500 מ"ל
סרום עיזיםSigma-AldrichG9023
BSASigmaA2153
ארנב pAb אנטי-OCT4Abcamab19857לשימוש בריכוז של 3 μ גרם/מ"ל
ארנב pAb anti-SOX2Abcamab97959לשימוש בריכוז של 1 μ גרם/מ"ל
ארנב pAb אנטי-NanogAbcamab80892לשימוש בריכוז של 1 μ גרם/מ"ל
עכבר mAb anti-SSEA1Abcamab16285לשימוש בריכוז של 20 μ גרם/מ"ל
עיזים pAb נגד ארנב IgG מסומן ב-Cy3Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.111-165-003-JIRהשתמש בריכוז של 1/250
עז pAb נגד עכבר IgG המסומן ב-Cy3Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.115-165-003-JIRהשתמש בריכוז של 1/250
מדיום הרכבה VECTASHIELD עם DAPIVector LaboratoriesH-1200
BCIP/NBT מערכת מצע נוזליSigmaB1911
אמצעי הרכבה מימיSigma
16% ParaformaldehydeFisherAA433689MStock הוא 16%, השתמש בו ב-4%
המטוקסילין ו eosinSigmaGH53/HT110216
PAS צביעהSigma395B
רצף רצף רצף רצף רצף רצף רצף רצף 560585

מקורות

  1. Blelloch, R., Venere, M., Yen, J., Ramalho-Santos, M. Generation Of Induced Pluripotent Stem Cells In The Absence Of Drug Selection. Cell Stem Cell. 1, 245-247 (2007).
  2. Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. Induced Pluripotent Stem Cells Generated Without Viral Integration. Science. 322, 945-949 (2008).
  3. Takahashi, K., et al. Induction Of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblasts By Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  4. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction Of Pluripotent Stem Cells From Mouse Embryonic And Adult Fibroblast Cultures By Defined Factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  5. Yu, J., et al. Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived From Human Somatic Cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
  6. Gonzalez, F., et al. Generation Of Mouse-Induced Pluripotent Stem Cells By Transient Expression Of A Single Nonviral Polycistronic Vector. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 8918-8922 (2009).
  7. Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation Of Mouse Induced Pluripotent Stem Cells Without Viral Vectors. Science. 322, 949-953 (2008).
  8. Woltjen, K., et al. Piggybac Transposition Reprograms Fibroblasts To Induced Pluripotent Stem Cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
  9. Yusa, K., Rad, R., Takeda, J., Bradley, A. Generation Of Transgene-Free Induced Pluripotent Mouse Stem Cells By The Piggybac Transposon. Nat. Meth. 6, 363-369 (2009).
  10. Warren, L., et al. Highly Efficient Reprogramming To Pluripotency And Directed Differentiation Of Human Cells With Synthetic Modified Mrna. Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).
  11. Kim, D., et al. Generation Of Human Induced Pluripotent Stem Cells By Direct Delivery Of Reprogramming Proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
  12. Zhou, H., et al. Generation Of Induced Pluripotent Stem Cells Using Recombinant Proteins. Cell Stem Cell. 4, 381-384 (2009).
  13. Anokye-Danso, F., et al. Highly Efficient Mirna-Mediated Reprogramming Of Mouse And Human Somatic Cells To Pluripotency. Cell Stem Cell. 8, 376-388 (2011).
  14. Lin, S. -L., et al. Regulation Of Somatic Cell Reprogramming Through Inducible Mir-302 Expression. Nucleic Acids Res. , (2011).
  15. Miyoshi, N., et al. Reprogramming Of Mouse And Human Cells To Pluripotency Using Mature Micrornas. Cell Stem Cell. 8, 633-638 (2011).
  16. Subramanyam, D., et al. Multiple Targets Of Mir-302 And Mir-372 Promote Reprogramming Of Human Fibroblasts To Induced Pluripotent Stem Cells. Nat. Biotechnol. 29, 443-448 (2011).
  17. Dolgin, E. Flaw In Induced-Stem-Cell Model. Nature. 470, 13 (2011).
  18. Miura, K., et al. Variation In The Safety Of Induced Pluripotent Stem Cell Lines. Nat. Biotech. 27, 743-745 (2009).
  19. Pera, M. The Dark Side Of Pluripotency. Nature. 471, 46-47 (2011).
  20. Saha, K., Jaenisch, R. Technical Challenges In Using Human Induced Pluripotent Stem Cells To Model Disease. Cell Stem Cell. 5, 584-595 (2009).
  21. Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation Of Germline-Competent Induced Pluripotent Stem Cells. Nature. 448, 313-317 (2007).
  22. Varas, F., et al. Fibroblast-Derived Induced Pluripotent Stem Cells Show No Common Retroviral Vector Insertions. Stem Cells. 27, 300-306 (2009).
  23. Jia, F., et al. A Nonviral Minicircle Vector For Deriving Human Ips Cells. Nat. Meth. 7, 197-199 (2010).
  24. Gonzalez, F., Boue, S., Belmonte, J. C. I. Methods For Making Induced Pluripotent Stem Cells: Reprogramming A La. Nat. Rev. Genet. 12, 231-242 (2011).
  25. Stadtfeld, M., Hochedlinger, K. Induced Pluripotency: History, Mechanisms, And Applications. Genes Dev. 24, 2239-2263 (2011).
  26. Gore, A., et al. Somatic Coding Mutations In Human Induced Pluripotent Stem Cells. Nature. 471, 63-67 (2011).
  27. Hussein, S. M., et al. Copy Number Variation And Selection During Reprogramming To Pluripotency. Nature. 471, 58-62 (2011).
  28. Lister, R., et al. Hotspots Of Aberrant Epigenomic Reprogramming In Human Induced Pluripotent Stem Cells. Nature. 471, 68-73 (2011).
  29. Yilmazer, A., De Lázaro, I., Bussy, C., Kostarelos, K. In Vivo Cell Reprogramming Towards Pluripotency By Virus-Free Overexpression Of Defined Factors. Plos One. 8, (2013).
  30. Liu, F., Song, Y. K., Liu, D. Hydrodynamics-Based Transfection In Animals By Systemic Administration Of Plasmid Dna. Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).
  31. Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High Levels Of Foreign Gene Expression In Hepatocytes After Tail Vein Injections Of Naked Plasmid Dna. Hum. Gene. Ther. 10, 1735-1737 (1999).
  32. Yamanaka, S. Induced Pluripotent Stem Cells: Past, Present, And Future. Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).
  33. Therapy Giacca, M. G. ene , Springer. (2010).
  34. Colella, P., Auricchio, A. Aav-Mediated Gene Supply For Treatment Of Degenerative And Neovascular Retinal Diseases. Curr. Gene Ther. 10, 371-380 (2010).
  35. Dayton, R. D., Wang, D. B., Klein, R. L. The Advent Of Aav9 Expands Applications For Brain And Spinal Cord Gene Delivery. Expert Opin. Biol. Ther. 12, 757-766 (2012).
  36. Mccown, T. J. Adeno-Associated Virus (Aav) Vectors In The Cns. Curr. Gene Ther. 11, 181-188 (2011).
  37. Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. Novel Adeno-Associated Viral Vectors For Retinal Gene Therapy. Gene Ther. 19, 162-168 (2012).
  38. Herweijer, H., Wolff, J. A. Progress And Prospects: Naked Dna Gene Transfer And Therapy. Gene Ther. 10, 453-458 (2003).
  39. Wolff, J. A., Budker, V. The Mechanism Of Naked Dna Uptake And Expression. Adv. Genet. 54, 3-20 (2005).

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

השראת פלוריפוטנטיותהזרקה הידרודינמית לווריד הזנבבידוד הפטוציטים ראשונייםאנליזה של ציטומטריית זרימהביטוי גנים ב-Q-RT-PCRצביעה אימונוהיסטוכימיתחיתוך רקמת כבדהערכת היווצרות טרטומה
בתכנות מחדש vivo של תאים סומטיים למבוגרים לpluripotency ידי ביטוי יתר של גורמי יאמאנאקה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.