מאמר שיטה

שימוש ב-Caenorhabditis elegans כמערכת מודל לחקר הומאוסטזיס חלבון באורגניזם רב-תאי

DOI:

10.3791/50840

⸱

18 בדצמבר 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, National Institute for Biotechnology in the Negev, Ben-Gurion University of the Negev

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לחקור את הקשר בין הומאוסטזיס חלבון, מתח והזדקנות, עקבנו אחר שינויים בקיפול החלבון על ידי מעקב אחר תפקוד לקוי של חלבון, לוקליזציה של חלבון בתא ויציבות החלבון ברמת האורגניזם, התא והחלבון, תוך שימוש במטזואן Caenorhabditis elegans הניתן לטיפול גנטי כמערכת מודל.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קיפול והרכבה של חלבונים חיוניים לתפקוד החלבון, לבריאות התא לטווח הארוך ולאריכות ימים של האורגניזם. מבחינה היסטורית, התפקוד והוויסות של קיפול חלבונים נחקרו במבחנה, בתאי תרבית רקמה מבודדים ובאורגניזמים חד-תאיים. מחקרים אחרונים חשפו קשרים בין הומאוסטזיס חלבון (פרוטאוסטזיס), חילוף חומרים, התפתחות, הזדקנות וחישת טמפרטורה. ממצאים אלה הובילו לפיתוח כלים חדשים לניטור קיפול חלבונים באורגניזם המטזואן המודל Caenorhabditis elegans. במעבדה שלנו, אנו משלבים מבחנים התנהגותיים, הדמיה וגישות ביוכימיות תוך שימוש בחלבונים רגישים לטמפרטורה או מטא-יציבים המופיעים באופן טבעי כחיישנים של הסביבה המתקפלת כדי לנטר קיפול שגוי של חלבונים. מבחנים התנהגותיים הקשורים לקיפול שגוי של חלבון ספציפי מספקים קריאה פשוטה ועוצמתית לקיפול חלבון, ומאפשרים סינון מהיר של גנים ומצבים המווסתים את הקיפול. כמו כן, קיפול שגוי כזה יכול להיות קשור למיקום שגוי של חלבון בתא. ניטור לוקליזציה של חלבונים יכול, אם כן, להדגיש שינויים ביכולת הקיפול התאית המתרחשים ברקמות שונות, בשלבי התפתחות שונים ולנוכח תנאים משתנים. לבסוף, באמצעות כלים ביוכימיים ex vivo, אנו יכולים לנטר ישירות את יציבות החלבון והקונפורמציה. לפיכך, על ידי שילוב של מבחנים התנהגותיים, הדמיה וטכניקות ביוכימיות, אנו מסוגלים לנטר קיפול שגוי של חלבון ברזולוציה של האורגניזם, התא והחלבון, בהתאמה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יחסי הגומלין בין השלבים השונים של ביוסינתזה של חלבונים, כגון שעתוק, עיבוד ותרגום mRNA, כמו גם קיפול חלבונים, טרנסלוקציה והרכבה/פירוק, קובע את העומס של חלבונים יציבים התלויים במנגנוני בקרת איכות החלבון התאיים לתפקודם1. היעדר או תקלה במכונות בקרת איכות חלבון עלול, אם כן, לגרום לירידה תפקודית של סוגים שונים של מכונות תאיות ולהופעת מחלות קיפול חלבונים2-7. כאשר היכולת של מכונות קיפול ופינוי חלבונים מאוזנת עם העומס של חלבונים יציבים, מושג הומאוסטזיס חלבון (פרוטאוסטזיס), מצב שבסופו של דבר מונע הצטברות של חלבונים לא מקופלים והצטברות בתוך תאים6. הצטברות של חלבונים לא מקופלים נחשבת לאות המפעיל גורמי שעתוק המעוררים מתח, כגון גורם הלם חום (HSF-1), ומביא להפעלת תגובות מתח מגן ציטו6,8.

הבנתנו את הפונקציות של רשתות פרוטאוסטזיס במטזואנים נגזרה בעיקר ממחקרי בנייה מחדש במבחנה ומתצפיות שנעשו עם תאי תרבית רקמות ואורגניזמים חד-תאיים9. לדוגמה, מחקר על מלווים מולקולריים המונעים ופותרים נזק לחלבון התמקד במחקרים ביוכימיים וביולוגיים תאיים של מנגנוני קיפול חלבון בתיווך צ'פרון, פירוק וטרנסלוקציה10-13. לשם השוואה, רק מידע מוגבל זמין על התפקוד המשולב של רכיבי פרוטאוסטזיס שונים בתאים וברקמות השונות של מטזואנים בתנאי גידול "נורמליים" ובתגובה למתח11. התגלית כי ב-C. elegans, בקרת איכות חלבון תאית יכולה להיות מווסתת גם באופן לא אוטונומי, כפי שבא לידי ביטוי בניסויים המראים כי מוטציות בשני הנוירונים התופסים טמפרטורה יכולות לחסום את הפעלת תגובת הלם החום ולהפחית את הסבילות לחום, הדגימה את הצורך לחקור ויסות פרוטאוסטזיס באורגניזם רב-תאי14-17. מה שחסר, עם זאת, הוא תמונה מגובשת של האופן שבו רשתות פרוטאוסטזיס, כגון משפחות המלווים המולקולריות השונות, מתפקדות ברקמות של מטזואן שלם ועד כמה דינמיות רשתות אלה במהלך ההתפתחות וההזדקנות. כדי לעמוד ביעד זה, יש צורך בחיישנים אמינים לניטור תחזוקת פרוטאום בבעלי חיים כדי לקבוע את הקיבולת הפרוטאוסטטית של תאים שונים באורגניזם רב-תאי במהלך ההתפתחות וההזדקנות.

כדי שחלבון נתון יתפקד כחיישן של פרוטאוסטזיס תאי, עליו להגיב לשינויים בסביבת הקיפול התאית, תוך הפרעה מינימלית בלבד לקיפול של חלבונים לא קשורים בתא. כדי לחקור את התחזוקה וההתאוששות של פרוטאוסטזיס תאי באורגניזם חי, ניתן לנקוט בשתי גישות משלימות התלויות בחיישנים מתקפלים. הראשון מסתמך על חיישנים מתקפלים מתוכננים, המבוססים על חלבונים מטה-יציבים שזוהו בניסוי וידועים כתלויים במכונות פרוטאוסטזיס, כגון גחלילית לוציפראז18-20 או GFP המתויג עם דגרון21-24. בגישה השנייה, חלבונים אנדוגניים מטה-יציבים, כגון חלבונים רגישים לטמפרטורה או חלבונים מצטברים תלויי גיל המגיבים לשינויים מצטברים בסביבה התאית, עוקבים25-27. חיישנים מתקפלים מעוצבים אינם משרתים פונקציה ביולוגית חיונית אך מציעים את היתרון בכך שהם ניתנים לזיהוי על ידי מבחני דיווח רבי עוצמה, כגון חלבונים מתויגים GFP, וניתן להשתמש בהם עם מודלים תאיים ובעלי חיים רבים ושונים18. עם זאת, מכיוון שהכנסת חלבון זר בודד יכולה להשפיע על סביבת הקיפול27, פוליפפטידים כאלה יכולים להעמיס על מנגנון הפרוטאוסטזיס התאי. לחלופין, חיישני קיפול מעוצבים שאינם מקוריים בתא עליו הם מדווחים עשויים שלא להיות מושפעים משינויים ביכולת הפרוטאאוסטזיס של התא. לדוגמה, מצע מדווח פרוטאזום אחד מתויג GFP דרש עיכוב של ~90% מהפרוטאזום לפני שניתן היה לזהות פנוטיפ23. לעומת זאת, חלבונים אנדוגניים מטה-יציבים המסתמכים על מנגנוני הפרוטאוסטזיס של התא מציעים את היתרון של היותם בטווח הרגישות התאית. עם זאת, אובדן התפקוד הקשור לקיפול שגוי של חלבונים כאלה יכול גם להשפיע על תפקוד התאים ועל כדאיות האורגניזם. כאן, נתמקד בשימוש בחיישני קיפול אנדוגניים של C. elegans.

C. elegans הוא מודל מטזואן מבוסס היטב לחקר התפתחות והזדקנות כאחד, המשתמש במסלולים ביולוגיים שמורים רבים וניתן להשתמש בו כדי לעקוב אחר קיפול חלבונים בתא, תוך שימוש בשילוב של ביולוגיה של התא, גישות ביוכימיות וגנטיות. השתמשנו בחלבונים מטה-יציבים כבדיקות של יכולת פרוטאוסטטית על ידי ניטור שינויים בפנוטיפ, בלוקליזציה וביציבות שלהם. יתר על כן, ניתן לחקור מגוון פונקציות חלבון על ידי ניתוח התנהגותי פשוט. כמו כן, מיקום שגוי משמעותי של חלבונים מתרחש כאשר רשתות בקרת איכות חלבון תאיות אינן מצליחות להתאים את עצמן לדרישות התאים. ניתן לדמיין בקלות חלבונים בתאים של בעלי חיים באמצעות חלבונים מתויגים פלואורסצנטיים או באמצעות צביעה חיסונית. לבסוף, באמצעות שיטות ex vivo, ניתן לעקוב אחר ביטוי החלבון ויציבותו. זה מאפשר סינון מהיר ופשוט של שינויים התנהגותיים ופיזיולוגיים, יחד עם ניתוח מעמיק של לוקליזציה ויציבות של חלבון, המאפשר ניטור של משנים פרוטאוסטזיס. על ידי שילוב שיטות שונות אלה, ניתן לקבל מבט רחב על סביבת קיפול החלבון של התא. ואכן, אסטרטגיה זו שימשה בהצלחה לניטור הפרעות פרוטאוסטזיס ב- C. elegans, שמרים, תרבית רקמות וחיידקים15,25-35.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שימוש במבחנים התנהגותיים לניטור קיפול חלבון באורגניזם חי

1. סנכרון בעלי חיים לבדיקות התנהגותיות

  1. עקוב אחר השיטות הסטנדרטיות לתחזוקה של C. elegans36, כולל הכנת מדיה וצלחות, הכנת מזון ותנאי גידול בעלי חיים. שליטה קפדנית בתנאי הגידול, כולל טמפרטורה (15-25 מעלות צלזיוס), גודל האוכלוסייה וזמינות המזון. השליכו כל צלחת שמראה זיהום חיידקי או פטרייתי.
  2. בוחרים 15-30 עוברים, מעבירים אותם לצלחות חדשות וגדלים בטמפרטורה הרצויה (15-25 מעלות צלזיוס) למשך הניסוי. לחלופין, הניחו 10-20 מבוגרים על צלחת, הניחו להם להטיל ביצים במשך 30-60 דקות ואז הוציאו אותם מהצלחת. גם קטיף ישיר של עוברים וגם קביעת בוגרים גרבידיים יתנו שונות מסוימת בגיל (±6 שעות). כדי להפחית את השונות הזו, בחר עוברים בשלב מסוים, למשל שלב פסיק, או קבע 10-20 בוגרים שרק מתחילים להטיל ביצים (יום 2 לבגרות). הימנע מסנכרון על ידי הלבנה במידת האפשר, בהתחשב בכך שטיפול זה מלחיץ ויכול להשפיע על פרוטאוסטזיס.
  3. בחרו בעלי חיים מסונכרנים, העבירו ללוחית בדיקה לניקוד ואז זרקו.

2. בדיקת תנועה

בחר בעלי חיים מסונכרנים והעביר לצלחת נקייה בטמפרטורת הרצון לניקוד תנועה (15-25 מעלות צלזיוס). עבור כל שכפול ביולוגי, ציין >20 בעלי חיים וחזור על הבדיקה לפחות פי 3 לכל תנאי ניסוי. השתמש במבחן סכום הדירוג של Wilcoxon Mann-Whitney כדי להשוות בין שני תנאי ניסוי בלתי תלויים.

  1. כדי לבדוק ליקוי תנועה קל, הצב 5-7 בעלי חיים במרכז מדשאה חיידקית נקייה ואפשר לבעלי החיים לנוע על הצלחת למשך 2 דקות. מרווח זמן זה נקבע על סמך הזמן שלקח ל-90% מחיות הבר לפנות עיגול של 1 ס"מ.
  2. ספרו את מספר בעלי החיים שלא פינו עיגול של 1 ס"מ (למשל שנשארו ברדיוס של 1 ס"מ מהנקודה שבה הם נקבעו) תוך 2 דקות כלא מתואמים.
  3. כדי לבדוק אם יש ליקוי תנועה חמור, הניחו את בעלי החיים על מדשאה חיידקית נקייה.
  4. צלמו כמה בעלי חיים בזמן אפס (t=0) ושוב כעבור 5 דקות (t=5). ציון בעלי חיים שלא זזו אורך גוף אחד לאחר 5 דקות כמשותקים.

3. התנגדות תרמית

  1. בחרו >20 בעלי חיים מסונכרנים והעבירו לצלחת של 24 בארות המכילה מאגר הלם חום (HS) של 450 מיקרוליטר (טבלה 1). עבור כל שכפול ביולוגי, ציין >20 בעלי חיים וחזור על הבדיקה לפחות פי 4 לכל תנאי ניסוי.
  2. מעבירים צלחת 24 באר לאמבטיה מחוממת. טמפרטורת HS ומשך הזמן תלויים מאוד בתנאי הגידול, בפרט בטמפרטורת הגידול.
  3. השלם את מאגר ה-HS עם 9 מיקרוליטר SYTOX כתום.
  4. ציון הישרדות בעלי חיים על ידי ניטור ספיגת הצבע, באמצעות סטריאוסקופ פלואורסצנטי עם מסנן TXR. בעלי חיים שלקחו את הצבע מתים. השתמש במבחן סכום הדירוג של Wilcoxon Mann-Whitney כדי להשוות בין שני תנאי ניסוי בלתי תלויים.

שימוש בצביעה חיסונית וחלבונים מתויגים לניטור קיפול חלבונים בתאים ספציפיים

4. עקוב אחר לוקליזציה של חלבונים על ידי צביעה חיסונית

  1. בשלב הנדרש, העבירו לפחות 30 בעלי חיים לצינור אפנדורף המכיל מאגר M936.
  2. שטפו את בעלי החיים מספר פעמים עם מאגר M9 על ידי ביצוע שלב צנטריפוגה קצר במהירות נמוכה (3,000 סל"ד/900 x גרם, 2 דקות) והשעיה מחדש.
  3. הניחו את הצינורות על קרח למשך מספר דקות להתקררות.
  4. הסר עודפי נוזלים ודגר עם תמיסת פרפורמלדהיד 4% קרה כקרח של 500 מיקרוליטר (טבלה 2). יש לכייל את זמן הדגירה עבור כל חלבון שנבדק וצריך להיות בסביבות 5-30 דקות בטמפרטורת החדר. ניתן לבצע גם דגירה ממושכת ב-4 מעלות צלזיוס, אך הדבר עלול לפגוע בחדירות הדגימה.
  5. שטפו בעלי חיים קבועים פי 3 עם מאגר PBS-Tween (pH 7.2) על ידי צנטריפוגה (3,000 סל"ד, 1-2 דקות). ניתן לאחסן את בעלי החיים בשלב זה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.
  6. אוספים את החיות בצנטריפוגה (3,000 סל"ד, 1-2 דקות).
  7. במכסה המנוע, הסר את רוב הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה בתמיסת β-מרקפטואתנול (β-ME) של 1 מ"ל (טבלה 2).
  8. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה עם נדנוד עדין על נוטר.
  9. במכסה המנוע, שטפו בעלי חיים פי 3 עם מאגר PBS-Tween (pH 7.2).
  10. השעו מחדש את בעלי החיים ב-50-100 מיקרוליטר של PBS-Tween (pH 7.2). ניתן לאחסן את בעלי החיים בשלב זה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.
  11. אסוף את החיות בצנטריפוגה (3,000 סל"ד, 1-2 דקות) והסר את רוב מאגר PBS-Tween.
  12. מוסיפים 100-150 מיקרוליטר תמיסת קולגנאז לכל צינור ודוגרים ב-37 מעלות צלזיוס בערבול חזק (באמצעות תרמו-מיקסר או אינקובטור רועד).
  13. בדוק את בעלי החיים לעתים קרובות תחת סטריאומיקרוסקופ, החל מ-5 דקות של דגירה. כאשר 20% מבעלי החיים נשברים, עצרו את התגובה על ידי הנחת הצינור על קרח. שלב זה רגיש ביותר! משך הטיפול תלוי בתנאי הקיבוע ויכול להשתנות מאוד בין הזנים. דגירה ממושכת עלולה לגרום להשפלה מוחלטת של בעלי החיים. יש לכייל את התנאים עבור כל אצווה אנזימטית המשמשת ולעקוב בקפידה אחר הפירוק
    14. .
  14. שטפו את החיות פעמיים ב-PBS-Tween (pH 7.2) ולאחר מכן אספו את החיות על ידי צנטריפוגה (3,000 סל"ד, 1-2 דקות) והסירו את רוב המאגר PBS-Tween.
  15. יש להוסיף 1 מ"ל תמיסת AbA (טבלה 2) ולדגור עם נדנדה עדינה למשך שעה בטמפרטורת החדר. ניתן לאחסן את בעלי החיים בשלב זה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.
  16. אוספים את החיות על ידי צנטריפוגה (3,000 סל"ד, 1-2 דקות) ומשהים מחדש ב-200 מיקרוליטר AbA.
  17. הוסיפו את הנוגדן העיקרי המדולל ל-1:100-1:1,000 בתמיסת AbA ודגרו עם נדנוד עדין. הטמפרטורה ומשך הדגירה יכולים להשתנות בין נוגדנים ויש לכייל אותם עבור כל חלבון שנבדק. אנו מתחילים בדגירה של לילה בטמפרטורת החדר.
  18. שוטפים את בעלי החיים בצנטריפוגה (3,000 סל"ד, 1-2 דקות).
  19. יש להוסיף חוצץ AbA (1 מ"ל) ולדגור בערבוב עדין למשך 15-60 דקות בטמפרטורת החדר. ניתן לאחסן את בעלי החיים בשלב זה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.
  20. אופציונלי: ניתן להכתים את הדגימה גם בצבעי פלורסנט. לשם כך, הוסיפו את הצבע (למשל DAPI (2 מ"ג/מ"ל) או פלואידין (1:100)) ל-200 מיקרוליטר AbA ודגרו עם נדנוד עדין עד שעה. ניתן לבצע שלב זה במהלך אחד השלבים לשטיפת הנוגדן המשני.
  21. שטפו את בעלי החיים פי 3 על ידי חזרה על שלבים 4.18-4.19.
  22. הוסף 100 מיקרוליטר AbA עם הנוגדן המשני המתאים המתויג פלואורסצנטי, מדולל 1:100.
  23. שמרו על הדגימות מכוסות (או בצינור כהה) ודגרו עם נדנדה במשך מספר שעות בטמפרטורת החדר.
  24. שטפו את בעלי החיים 3 פעמים על ידי דגירה במאגר AbA (1 מ"ל) עם ערבוב עדין במשך 15-60 דקות בטמפרטורת החדר ואחריו צנטריפוגה (3,000 סל"ד, 1-2 דקות). ניתן לאחסן את בעלי החיים בשלב זה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות.
  25. כדי להרכיב בעלי חיים על מגלשות, הסר את כל הנוזלים והשהה מחדש ב-10 מיקרוליטר מאותו מאגר.
  26. חותכים את קצה קצה הפיפטה כדי למנוע שיפוע של בעלי החיים ומעבירים 1-2 מיקרוליטר מהדגימה לשקופית.
  27. הוסף אמצעי הרכבה ביחס של 1:1.
  28. מכסים את השקופית בעדינות עם כיסוי ואוטמים עם לק. אם השקופית אינה מנוטרת באופן מיידי, ניתן לאחסן את השקופיות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לפרק זמן ממושך.

5. עקוב אחר לוקליזציה של חלבונים מתויגים

  1. בשלב הנדרש, אספו לפחות 15 בעלי חיים לטיפה של 10 מ"ל של מאגר M9 על מגלשה.
  2. בעזרת "קיסם תולעים", העבירו את החיות לטיפה של 10 מ"ל של תמיסת פרפורמלדהיד (4%) (טבלה 2) והמתינו עד שכל החיות יפסיקו לזוז (כ-5 דקות).
  3. בעזרת "קיסם תולעים", העבירו את החיות לטיפה של 2 מ"ל של מאגר M9 ומדיום הרכבה (1:1) (טבלה 2).
  4. מכסים בעדינות את בעלי החיים בכיסוי ואוטמים בלק.

שימוש במבחני ex vivo לניטור קיפול ויציבות החלבון

6. עיכול חלקי

  1. שטפו בעלי חיים מ-15 צלחות (60 מ"מ) באמצעות מאגר M9 של 1-2 מ"ל בצינור מיקרופוגה. שימו לב שבעלי חיים לא צריכים להיות צפופים וצריך להיות מספיק מזון זמין לאורך כל הניסוי.
  2. שטפו את החיות כמה פעמים עם חיץ M9 על ידי צנטריפוגה (3,000 סל"ד, 2 דקות) והשעיית בעלי חיים.
  3. לאחר הסיבוב האחרון, השעו מחדש בעלי חיים במאגר M9 של 100 מיקרוליטר.
  4. הקפאת בזק בנוזל N2. ניתן לאחסן דגימות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
  5. בעזרת עלי צונן ומקדחה ממונעת (ניתן להשתמש גם במקדחה ידנית לתרבית רקמות), טוחנים את הדגימה. שמור את הדגימה על קרח והימנע מהתחממות יתר.
  6. בדוק את בעלי החיים לעתים קרובות תחת מיקרוסקופ סטריאומיקרוסקופ כדי לקבוע אם הטחינה הושלמה. אם נותרו בעלי חיים שלמים, חזור על ההליך.
  7. הערך את הנפח על ידי פיפטינג של תמצית התולעת.
  8. הוסף יחס של 1:1 של תמיסת ליזיס תולעים (פי 2) (טבלה 3). אין להשתמש במעכבי פרוטאז מכל סוג שהוא.
  9. דגירה על קרח למשך 15 דקות.
  10. הסר פסולת על ידי צנטריפוגה (1,000 x גרם למשך 2 דקות) בצנטריפוגה מקוררת מראש (4 מעלות צלזיוס).
  11. העבירו את הסופרנטנט לצינור מיקרופוגה נקי. ניתן להשתמש בדגימות ישירות או לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
  12. הכן תמיסת כימוטריפסין (טבלה 3) ושמור על קרח עד לשימוש.
  13. קבע את ריכוז החלבון הכולל באמצעות מבחן ברדפורד.
  14. יש לדלל את הדגימה במידת הצורך כך שריכוז החלבון הכולל יהיה 3-3.5 מ"ג/מ"ל.
  15. הוסף תמיסת כימוטריפסין לליזאט החלבון הכולל (1:1,200).
  16. כדי לקבוע את זמן הדגירה, דגרו את הדגימה עם כימוטריפסין למשך 60 דקות. הסירו 20 מיקרוליטר מהדגימה בנקודות זמן שונות (למשל 0, 5, 20, 40 ו-60 דקות), ערבבו מיד עם מאגר דגימת SDS והרתיחו במשך 5 דקות ב-96 מעלות צלזיוס. *לחלופין, דגרו את הדגימה בריכוזים שונים של כימוטריפסין והפסקו את התגובה לאחר זמן מסוים על ידי הוספת מאגר דגימת SDS והרתחה למשך 5 דקות ב-96 מעלות צלזיוס.
  17. הפעל דוגמאות על ג'ל SDS-PAGE.
  18. בצע ניתוח כתמים מערביים באמצעות נוגדנים מתאימים כדי לקבוע את היציבות היחסית של החלבון.
  19. לקבוע את התנאים האופטימליים (ריכוז כימוטריפסין וזמן עיכול) המראים שינוי משמעותי בין הדגימות ולהשתמש בתנאים אלה לניסויים עתידיים.
  20. קבע את העוצמה של תוצרי עיכול שונים (שברי משקל מולקולרי נמוכים יותר) באמצעות תוכנת דנסיטומטריה, כגון מודול ג'ל התמונה של NIH.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סביבת קיפול פגומה עלולה להוביל לקיפול שגוי וצבירת חלבונים. קיפול שגוי של חלבון קשור לשינוי בקונפורמציה וגורם לאובדן תפקוד החלבון. אנו משתמשים בגישות משלימות כדי לנטר את קיפול החלבון ותפקודו בבעלי חיים שלמים, תאים ספציפיים ותמציות חלבון. בחירה מושכלת של חיישן מתקפל, המבוססת על פנוטיפים התנהגותיים ותאיים חזקים הקשורים למוטציה מערערת יציבות ידועה, יכולה לשמש לניטור שינויים בסביבת קיפול החלבונים. דוגמה לחלבון מוטנטי אנדוגני רגיש לטמפרטורה הוא מוטציית L799F בחלבון חוט השריר העבה, פרמיוזין (C. elegans UNC-15)37

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדיקות של יכולת הפרוטאוסטזיס התאית חייבות להיות רגישות מאוד לשינויים בסביבת הקיפול ולהיות מנוטרות בקלות כדי לספק הערכה בזמן אמת של יכולות בקרת איכות קיפול החלבון. באמצעות חלבונים יציבים כבדיקות של יכולת פרוטאוסטזיס, עקבנו אחר שינויים בפנוטיפ, לוקליזציה של חלבון תת-תאי וקונפורמציה של חלבון. הפרוטוקולים המוצגים כאן מתמקדים בפנוטיפים הקשורים לחלבון השריר, כולל תנועתיות, ארגון חוטי שריר ויציבות מיוזין. עם זאת, ניתן לשנות פרוטוקולים אלה לניטור חיישנים מתקפלים אחרים. עבור פנוטיפים התנהגותיים, חשוב לתכנן בדיקה פשוטה וחזקה לקביע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל זני הנמטודות ששימשו בעבודה זו סופקו על ידי המרכז לגנטיקה של Caenorhabditis, הממומן על ידי המרכז הלאומי למשאבי מחקר של ה-NIH (NCRR). הנוגדנים החד-שבטיים שפותחו על ידי ה.פ. אפשטיין התקבלו מבנק ההיברידומה למחקרים התפתחותיים שפותח בחסות ה-NICHD ומתוחזק על ידי המחלקה לביולוגיה באוניברסיטת איווה. נ. שמש נתמך על ידי פרס פיי וברט הארבור. א.ב.-ז. נתמך על ידי מלגת אלון של המועצה הישראלית להשכלה גבוהה, על ידי מענק מארי קירי בינלאומי לשילוב מחדש, ועל ידי מענקים מהקרן הדו-לאומית למדע והקרן הלאומית למדע (מענק מס' 91/11).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
סטנינג נוגדנים ופיאקסטיוןפרפורמלדהידMerc8187151000
Tween-20 Bio-Rad1706531
קולגנאזסיגמאC5138-100MG
DABCOMerc8034560100
Triton X-100AlfaAesar A16046
β -MESigma8057400250
BSADi Cam000-40-100
  תקציר חלקי כימוטריפסיןסיגמאC4129-250MG
עמידות תרמיתSYTOX כתוםInvitrogenS11368
כולסטרולאמרסקו0433-250G
ציוד
M165 FC סטריאוסקופ פלואורסצנטיLeicaTXR מסנן
EXi כחול פלואורסצנטי מיקרוסקופיה מצלמהQImagingEXI-BLU-R-F-M-14-C
ConfoCor 3/510 META מיקרוסקופ קונפוקליZeiss
עלי גלולהSigmaZ359947-100EA
גלולה עלי מנוע אלחוטיKontesK749540-0000
MicroCL 17 Microcentrifuge סדרתתרמו75002455קירור, 230 וולט 50/60 הרץ, כולל רוטור 24x 1.5/2.0 מ"ל עם מכסה ClickSeal Biocontainment

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319, 916-919 (2008).
  2. Arias, E., Cuervo, A. M. Chaperone-mediated autophagy in protein quality control. Curr. Opin. Cell. Biol. 23, 184-189 (2011).
  3. Tyedmers, J., Mogk, A., Bukau, B. Cellular strategies for controlling protein aggregation. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 11, 777-788 (2010).
  4. Walter, P., Ron, D. The unfolded protein response: from stress pathway to homeostatic regulation. Science. 334, 1081-1086 (2011).
  5. Finley, D. Recognition and processing of ubiquitin-protein conjugates by the proteasome. Annu. Rev. Biochem. 78, 477-513 (2009).
  6. Gidalevitz, T., Prahlad, V., Morimoto, R. I. The stress of protein misfolding: from single cells to multicellular organisms. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (2011).
  7. Haynes, C. M., Ron, D. The mitochondrial UPR - protecting organelle protein homeostasis. J. Cell. Sci. 123, 3849-3855 (2010).
  8. Akerfelt, M., Morimoto, R. I., Sistonen, L. Heat shock factors: integrators of cell stress, development and lifespan. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol.. 11, 545-555 (2010).
  9. Prahlad, V., Morimoto, R. I. Integrating the stress response: lessons for neurodegenerative diseases from C. elegans. Trends Cell. Biol. 19, 52-61 (2009).
  10. Li, J., Soroka, J., Buchner, J. The Hsp90 chaperone machinery: conformational dynamics and regulation by co-chaperones. Biochim. Biophys. Acta. 1823, 624-635 (2012).
  11. Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
  12. Winkler, J., Tyedmers, J., Bukau, B., Mogk, A. Chaperone networks in protein disaggregation and prion propagation. J. Struct. Biol. 179, 152-160 (2012).
  13. Mayer, M. P. Gymnastics of molecular chaperones. Mol. Cell. 39, 321-331 (2010).
  14. Durieux, J., Wolff, S., Dillin, A. The cell-non-autonomous nature of electron transport chain-mediated longevity. Cell. 144, 79-91 (2011).
  15. Garcia, S. M., Casanueva, M. O., Silva, M. C., Amaral, M. D., Morimoto, R. I. Neuronal signaling modulates protein homeostasis in Caenorhabditis elegans post-synaptic muscle cells. Genes Dev. 21, 3006-3016 (2007).
  16. Prahlad, V., Cornelius, T., Morimoto, R. I. Regulation of the cellular heat shock response in Caenorhabditis elegans by thermosensory neurons. Science. 320, 811-814 (2008).
  17. Bar-Lavan, Y., Kosolapov, L., Frumkin, A., Ben-Zvi, A. Regulation of cellular protein quality control networks in a multicellular organism. FEBS J. 279, 526-531 (2012).
  18. Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nat. Methods. 8, 879-884 (2011).
  19. Rampelt, H., et al. Metazoan Hsp70 machines use Hsp110 to power protein disaggregation. EMBO J. 31, 4221-4235 (2012).
  20. Winkler, J., Tyedmers, J., Bukau, B., Mogk, A. Hsp70 targets Hsp100 chaperones to substrates for protein disaggregation and prion fragmentation. J. Cell. Biol. 198, 387-404 (2012).
  21. Kim, Y. I., Burton, R. E., Burton, B. M., Sauer, R. T., Baker, T. A. Dynamics of substrate denaturation and translocation by the ClpXP degradation machine. Mol. Cell. 5, 639-648 (2000).
  22. Hamer, G., Matilainen, O., Holmberg, C. I. A photoconvertible reporter of the ubiquitin-proteasome system in vivo. Nat. Methods. 7, 473-478 (2010).
  23. Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation. Science. 292, 1552-1555 (2001).
  24. Dantuma, N. P., Lindsten, K., Glas, R., Jellne, M., Masucci, M. G. Short-lived green fluorescent proteins for quantifying ubiquitin/proteasome-dependent proteolysis in living cells. Nat. Biotechnol. 18, 538-543 (2000).
  25. Brown, C. R., Hong-Brown, L. Q., Welch, W. J. Correcting temperature-sensitive protein folding defects. J. Clin. Invest. 99, 1432-1444 (1997).
  26. Van Dyk, T. K., Gatenby, A. A., LaRossa, R. A. Demonstration by genetic suppression of interaction of GroE products with many proteins. Nature. 342, 451-453 (1989).
  27. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311, 1471-1474 (2006).
  28. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 14914-14919 (2009).
  29. Burkewitz, K., Choe, K., Strange, K. Hypertonic stress induces rapid and widespread protein damage in. C. elegans. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 301, 566-576 (2011).
  30. Alavez, S., Vantipalli, M. C., Zucker, D. J., Klang, I. M., Lithgow, G. J. Amyloid-binding compounds maintain protein homeostasis during ageing and extend lifespan. Nature. 472, 226-229 (2011).
  31. David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans. PLoS Biol. 8, (2010).
  32. Eremenko, E., Ben-Zvi, A., Morozova-Roche, L. A., Raveh, D. Aggregation of human S100A8 and S100A9 amyloidogenic proteins perturbs proteostasis in a yeast model. PLoS One. In press, (2013).
  33. Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S. M., Morimoto, R. I. Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity. PLoS Genet. 5, (2009).
  34. Silva, M. C., et al. A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network. PLoS Genet.. 7, (2011).
  35. Prahlad, V., Morimoto, R. I. Neuronal circuitry regulates the response of Caenorhabditis elegans to misfolded proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 14204-14209 (2011).
  36. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  37. Gengyo-Ando, K., Kagawa, H. Single charge change on the helical surface of the paramyosin rod dramatically disrupts thick filament assembly in Caenorhabditis elegans. J. Mol. Biol. 219, 429-441 (1991).
  38. Clark, S. G., Shurland, D. L., Meyerowitz, E. M., Bargmann, C. I., vander Bliek, A. M. A dynamin GTPase mutation causes a rapid and reversible temperature-inducible locomotion defect in C. elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 94, 10438-10443 (1997).
  39. Hsu, A. L., Murphy, C. T., Kenyon, C. Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor. Science. 300, 1142-1145 (2003).
  40. Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Mol. Biol. Cell. 15, 657-664 (2004).
  41. Morimoto, R. I. Proteotoxic stress and inducible chaperone networks in neurodegenerative disease and aging. Genes Dev. 22, 1427-1438 (2008).
  42. Taylor, R. C., Dillin, A. Aging as an event of proteostasis collapse. Cold Spring Harb. Perspect. Biol.. 3, (2011).
  43. Tissenbaum, H. A. Genetics, Life Span, Health Span, and the Aging Process in Caenorhabditis elegans. J. Gerontol. A. Biological Sci. Med. Sci. 67, 503-510 (2012).
  44. Hosono, R., Mitsui, Y., Sato, Y., Aizawa, S., Miwa, J. Life span of the wild and mutant nematode Caenorhabditis elegans. Effects of sex, sterilization, and temperature. Exp. Gerontol. 17, 163-172 (1982).
  45. Madi, A., et al. Mass spectrometric proteome analysis for profiling temperature-dependent changes of protein expression in wild-type Caenorhabditis elegans. Proteomics. 3, 1526-1534 (2003).
  46. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419, 808-814 (2002).
  47. Barral, J. M., Hutagalung, A. H., Brinker, A., Hartl, F. U., Epstein, H. F. Role of the myosin assembly protein UNC-45 as a molecular chaperone for myosin. Science. 295, 669-671 (2002).
  48. Melkani, G. C., Bodmer, R., Ocorr, K., Bernstein, S. I. The UNC-45 chaperone is critical for establishing myosin-based myofibrillar organization and cardiac contractility in the Drosophila heart model. PLoS One. 6, (2011).
  49. Gosai, S. J., et al. Automated high-content live animal drug screening using C. elegans expressing the aggregation prone serpin alpha1-antitrypsin Z. PLoS One. 5, (2010).
  50. Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity. Science. (313), 1604-1610 (2006).
  51. Cohen, E., et al. Reduced IGF-1 signaling delays age-associated proteotoxicity in mice. Cell. 139, 1157-1169 (2009).
  52. Shemesh, N., Shai, N. Ben-Zvi A (2013) Germline stem cell arrest inhibits the collapse of somatic proteostasis early in Caenorhabditis elegans adulthood. Aging Cell. 12 (2013), 814-822 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Behavioral AssaysImmunofluorescence MicroscopyWestern Blot AnalysisTemperature Sensitivity AssayProtein MisfoldingProteostasis MonitoringAnimal SynchronizationCollagenase Digestion

מאמרים קשורים