מאמר שיטה

קוולנטיים עקידת BMP-2 על משטחים באמצעות גישה חד שכבתי התאסף עצמית

DOI:

10.3791/50842

⸱

26 באוגוסט 2013

 ,  , 
1Department of Biophysical Chemistry, Institute for Physical Chemistry, University of Heidelberg, 2Max Planck Institute for Intelligent Systems at Stuttgart

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים שיטה לביצוע קיבוע יעיל של BMP-2 על גבי משטחים. הגישה שלנו מבוססת על היווצרות monolayer עצמי התאספו כדי להשיג את הקשר הקוולנטי של BMP-2 באמצעות השאריות האמינים שלה בחינם. שיטה זו היא כלי שימושי כדי ללמוד איתות בקרום התא.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

morphogenetic עצם חלבון 2 (BMP-2) הוא גורם גדילה משובץ במטריצה ​​תאית של רקמת עצם. BMP-2 משמש כהדק של התמיינות תאי mesenchymal לאוסטאובלסטים, וכך מגרה ריפוי והיווצרות עצם נובו דה. השימוש הקליני של אנושי רקומביננטי BMP-2 (rhBMP-2) בשיתוף עם פיגומים העלה מחלוקות האחרונות, המבוסס על המצב של מצגת ואת הסכום כדי להיות מועבר. הפרוטוקול המובא כאן מספק דרך פשוטה ויעילה כדי לספק BMP-2 לבדיקות במבחנה בתאים. אנו מתארים כיצד ליצור monolayer עצמית התאספו בהיקף של מקשר heterobifunctional, ולהראות את הצעד מחייב שלאחר מכן כדי להשיג קיבוע קוולנטי של rhBMP-2. עם גישה זו אפשר להשיג מצגת מתמשכת של BMP-2 תוך שמירה על הפעילות הביולוגית של החלבונים. למעשה, חוסר התנועה של BMP-2 המשטח מאפשרת חקירות ממוקדות על ידי מניעת מודעות נוקבותorption, תוך הפחתת הכמות של גורם גדילה, ובעיקר, פוגע בשחרור מבוקר מהשטח. שני אירועי האיתות לטווח קצר וארוך מופעלים על ידי BMP-2 מתרחשים כאשר תאים נחשפים למשטחי הצגה משותקים קוולנטית rhBMP-2, מה שהופך את הגישה הזאת מתאימה למחקרים במבחנה בתגובות תא לBMP-2 גירוי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חלבון morphogenetic עצם 2 (BMP-2) הוא חבר של גורם הפיכת צמיחת משפחה (TGF-β) ופועל כמשדל של דה נובו היווצרות עצם כמו גם רגולטור של כמה רקמות במהלך התפתחות עוברית ובוגר הומאוסטזיס 1-3. כל מונומר של BMP-2 החלבון homodimeric הפעיל הביולוגית מכיל מוטיב "קשר ציסטאין", שזה שמור ביותר בכל 4 BMPs. שש משאריות ציסטאין שבע ליצור קשרי דיסולפיד intramolecular כי לייצב מונומר אחד, ואילו ציסטאין השביעי מעורבים בdimerization, ויצר אג"ח מולקולאריים בין שני מונומרים 5,6. קשר ציסטאין השמור ביותר זה מגדיר את המבנה התל הממדי של חלבון BMP-2 וקובע את המאפיינים הייחודיים שלה, כגון עמידות מפני חום, denaturants וחומצי pH 7-9. BMP-2 נקשר לקולטנים הטרנסממברני קינאז סרין / תראונין, וכך גרימת הולכות אותות 10-12. בהתאם למצב של oligomerization קולט, מסלולי איתות שונים מופעלים: מפל איתות הסמאד עצמאי מוביל לאינדוקצית phosphatase אלקליין באמצעות איתות p38, ואילו מסלול הסמאד תלוי מופעל על ידי תוצאות זרחון הקולטן בטרנסלוקציה הסמאד המורכבת גרעינית והפעלה של שעתוק של גנים ספציפיים יעד, כגון המעכב של התמיינות (Id) 12-14.

בעצמות, BMP-2 גורם להתמיינות של תאי גזע mesenchymal לאוסטאובלסטים, וכך מגרה את הריפוי והיווצרות דה נובו של עצם. נכון לעכשיו, recombinantly הביע BMP-2 מוחל קליני כדי לשפר את הריפוי של אתרים שבורים. אסטרטגיה נפוצה בהנדסת רקמות עצם היא השימוש בגורמי גדילה בזריקות, שהוא פחות פולשני בהשוואה למערכות אספקה ​​מקומיות. עם זאת, במחקרי vivo ויישומים קליניים הראו כי זמן מחצית החיים הביולוגיים קצרים, loc הנוקבalization וסליקה מקומית מהירה של BMP-2 עשויים להוביל למספר בעיות מקומיות, מחוץ לרחם ומערכתית 15. לפיכך, כדי להשיג מצגת יעילה, המלכוד או חוסר תנועה של BMP-2 בתוך או על גבי חומרים הכרחי למסירה באתר היעד מתמשכת והמקומית שלה. משלוח מתמשך ניתן להשיג עם גישות שימור שאינו קוולנטיים, כגון הילכדות פיזית, ספיחה או complexation יון 16. עם זאת, ידוע כי ספיחה לא ספציפית של חלבונים על משטחים עשויות תוצאות בdenaturation של המולקולות 17. לקוולנטיים המחייב של גורמי גדילה, סוגים שונים של תומך פותחו בעשור האחרון. השימוש במולקולות מקשרים bifunctional כי יעד קבוצות אמינו או carboxyl של החלבון לדוגמא, הוא סוג אחד גישה שלא בהכרח דורש שינוי חלבון כדי להשיג קיבועה של. למעשה, בעוד שינוי החלבון מציע את היתרון של השליטה נטייה חלבון,המבוא של תחומים מלאכותיים, תגי פפטיד ורשתות באתר ספציפי עשוי לשנות את הפעילות הביולוגית של גידול גורמי 17. לכן, כדי לעקוף denaturation עקב אינטראקציה עם חומר התמיכה, יכולים להיות פונקציונליות משטחים מראש, למשל, עם monolayer עצמי התאספו (SAM) של מולקולה המקשרת, ואחריו צימוד של הגורם הרצוי 18. יש לנו בשימוש בגישה מבוססת SAM כדי לשתק קוולנטית BMP-2 על גבי משטח על ידי מיקוד השאריות האמינים בחינם והראינו כי החלבון המשותק שומר גם הפעילות הביולוגית לטווח קצר והארוך שלה 19. פרוטוקול זה מספק דרך פשוטה ויעילה כדי לספק BMP-2 לתאים לבדיקות במבחנה על המנגנונים שמתרחשים בקרום התא ומווסתים את האיתות תאית אחראית לאיתות osteogenic.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. סינתזה של 11-Mercaptoundecanoyl-N-hydroxysuccinimide אסתר (MU-NHS)

  1. הוספת dropwise פתרון של 500 מ"ג N-hydroxysuccinimide ו30 מ"ג 4 - פירידין (dimethylamino) ב10 מיליליטר אצטון (PA) עד 1 גרם חומצת 11-mercaptoundecanoic ב40 מיליליטר dichloromethane (PA) בטמפרטורת חדר (RT).
  2. מגניב התגובה ל0 מעלות צלזיוס ולהוסיף N 1.1 גרם dropwise, N '-dicyclohexylcarbodiimide ב10 מיליליטר dichloromethane (תחת אווירת חנקן). שמור את התגובה בטמפרטורה נמוכה במשך שעה 1 ולאחר מכן מערבבים ב RT הלילה.
  3. סנן את המשקע ולייבש אותו תחת לחץ מופחת. לטהר את המוצר על ידי הבזק כרומטוגרפיה עם בנזין נפט ואתיל אצטט (PA) ביחס של 1:1.

2. הכנת שכבות זהב אחידה

  1. coverslips זכוכית נקי עם מגבוני דיוק וsonicate למשך 5 דקות בתמיסה המכילה תערובת 1:1 של אתיל אצטט (הרשות) ומתנול (PA). Rinsמצעי דואר עם מתנול ולהתנגב תחת זרם חנקן.
  2. מניחים את מצעים נקיים במכשיר ציפוי גמגום. לפנות את החדר. הסר את שכבת תחמוצת כרום העליונה מהיעד כרום ידי מקרטעת ל60 שניות. מניחים את הדגימות מתחת לקורת המתכת ומעיילם עם שכבת כרום 10 ננומטר, ואחריו על ידי ציפוי בשכבת זהב 40 ננומטר.

3. קיבוע פני השטח של BMP-2

  1. ממיסים MU-NHS בN, N-dimethlyformamide (DMF) לריכוז סופי של כ 1 מ"מ ודגירת מצעי זהב בפתרון MU-NHS ב RT במשך 4 שעות תחת אווירת חנקן.
  2. משטחי Sonicate בDMF למשך 2 דקות, לשטוף עם DMF וMeOH ולהתנגב תחת זרם חנקן.
  3. הכן פתרון מניות של rhBMP-2 בסטרילית 4 מ"מ HCl בריכוז של 100 מיקרוגרם / מיליליטר (aliquots חנות ב -80 מעלות צלזיוס). לדילולים עובדים (3.5 מיקרוגרם / מיליליטר), לדלל את פתרון המניות ב-PBS / NaCl (PBS המכיל 1 M NaCl) וdjust ל-pH 8.5 מייד לפני השימוש.
  4. דגירה משטחים פונקציונליות MU-NHS בפתרון עובד rhBMP-2 על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הסר supernatant דגירה. משטחי Sonicate ב-PBS / NaCl למשך 2 דקות ולשטוף 3x עם PBS סטרילי / NaCl.

4. אפיון פני השטח

  1. כדי לחסום ספיחה לא ספציפית של נוגדן, דגירה משטחים עם BSA 5% (w / v) בפתרון PBS עבור שעה 1 ב RT, ואחריו דגירה עם נוגדן אנטי BMP-2 (1:100 ב1% (w / v ) פתרון BSA / PBS) במשך שעה 1 ב RT. שטוף משטחים פעמיים עם PBS sonicate במשך 30 שניות.
  2. דגירה מצעים עם נוגדן HRP-מצומדות המשני (1:1,000 ב1% (w / v) פתרון BSA / PBS) במשך 30 דקות ב RT, ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם PBS.
  3. השתמש assay האדום Ampliflu כדי למדוד את הפעילות האנזימטית HRP ב 570 ננומטר עם קורא צלחת.

5. ניתוח של פעילות ביולוגית

  1. הזרעים 1 x 10 myoblasts C2C12 5 עכבר לכל טוב ב6 גם plאטס במדיום גידול, בהיקף של DMEM גלוקוז גבוהה המכיל פירובט בתוספת 10% FBS, 1% פניצילין / סטרפטומיצין ומדגיר אותן 24 שעות על 37 ° C / 5% CO 2.
  2. להרעיב את התאים בסרום ללא DMEM ל3-5 שעות לפני זריעה על גבי המשטחים מעוצבים עם BMP-2 המשותק.
  3. לחקירה של אינדוקציה איתות לטווח קצר, להחליף את המדיום בסרום ללא DMEM הטרי 200 μl ולמקם את BMP-2 משטחים משותקים מעל התאים. המשטח צריך להיות מטופלים עם פינצטה קצה קנס כדי להימנע מגירוד.
  4. הסר בעדינות משטחים ולשאוב את המדיום עם טפטפת, לשטוף את התאים פעמיים עם PBS. המשך לניתוח של תגובות תא.
  5. לניתוח של פעילות ביולוגית ארוך טווח, תאי צלחת על גבי משטחים ותרבותם על 37 ° C / 5% CO 2 בתנאים נמוכים בסרום (2% FBS) במשך שישה ימים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בהתקנה שלנו, זהב נבחר כחומר לא פעיל מאז שהיא מספקת מערכת ביולוגית נוקבת אבל כימי מתכונן. יתר על כן, היישום של monolayers הרכבה העצמית כרוך יתרונות רבים: סאמס לספוג באופן ספונטני באמצעות "ראש הקבוצות" שלהם על מתכות וmonolayers טופס עם כמה פגמים, ואילו ניתן לשנות קצה הקבוצות הפונקציונלית שלהם עוד יותר. כך שהם מספקים פלטפורמה ללהתאים את המאפיינים של הממשק בצורה עדיין ישימה מאוד מבוקרת 20.

לחוסר התנועה של ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בפרוטוקול זה אנו מתארים את הכנת המשטחים פונקציונליות עם rhBMP-2 ביו. גישה זו כוללת שני שלבים: 1) היווצרות הראשונית של monolayer הרכבה עצמית (SAM) של מקשר bifunctional על משטח הזהב, 2) קיבוע קוולנטי של חלבון rhBMP-2. בעבודה קודמת, שתוקפים יעיל מחייב של מקשר bifunctional וגורם הגדילה, והוכחתי כי משותק משטח rhBMP-2 שומר על הפעילות הביולוגית שלו 19. הפעילות הביולוגית של גורמי גדילה המוצגים בצורה משותקת גם הוכח במחקרים אחרים, מצביעה על כך ששחרורו של החלבונים וההפנמה הבאה שלה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש מחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לפרופ 'JP פאץ (מחלקה לכימית Biophysical, אוניברסיטת היידלברג ומחלקת לחומרים חדשים וBiosystems, מכון מקס פלאנק למערכות נבונות, שטוטגרט) לתמיכה מהסוג שלו. התמיכה הכספית ממכון מקס פלנק-Gesellschaft וForschungsgemeinschaft דויטשה (DFG SFB/TR79 לEAC-.) גם הם הכירו באופן משמעותי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
N-hydroxysuccinimideSigma-Aldrich130672 
4-(דימתיל-אמינו)פירידין, סיגמא-אולדריץ'522805 
אצטוןAppliChemA2282 
11-חומצה מרקפטונדקנואיתסיגמא-אולדריץ'674427 
דיכלורמתאןMerck106050 
N,N'-dicyclohexylcarbodiimideSigma-AldrichD80002 
נפט בנזןMerck 
כיסויי זכוכיתCarl RothM 875 
אתילאצטטAppliChemA3550 
מתנולקארל רוט4627 
N,N-dimethylformamideCarl RothT921 
rhBMP-2מו"פ D Systems355-BMללא ספק; מבוטא ב-E.coli
PBSPAAH15-002 
NaClקארל רות'HN00.2 
פולי (דימתיל סילוקסן) (PDMS)דאו קורנינג 
ערכת אלסטומר סיליקון Sylgard 184Dow Corning 
אנטי-rhBMP-2סיגמאB9553 
עיזים נגד עכבר IgG-HRPסנטה קרוזsc-2005נוגדן משני
Ampliflu מבחן אדוםסיגמא90101 
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1x), נוזליGibco41966עם גלוקוז גבוה
(FBS)SigmaF7524מסונן סטרילי, נבדק בתרבית תאים
טריפסין 0.05% (פי 1) עם EDTA 4NaGibco25300 
גליצין (0.1 מ')Riedel-de Haë n33226 
IGEPAL CA-630 (1%)SigmaI8896מאגר ליזה (בדיקת ALP)19
מגנזיום כלוריד (MgCl2)(1 מ"מ)Carl RothHNO3.2 
אבץ כלורי (ZnCl2) (1 מ"מ)Carl Roth3533.1 
p-nitrophenylphosphate (pNPP)SigmaS0942מצע פוספטאז
אנטי-מיזין שרשרת כבדה (MHC)מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה, אוניברסיטת איווהMF20נוגדן חד-שבטי
Alexa Fluor 488 עז נגד עכבר IgGInvitrogenA11001 
DAPIסיגמאD9542 
<חזק>ציוד
אמבט אולטרסוניק (Sonorex Super RK 102H), תדר 35 קילו-הרץBANDELIN אלקטרוני GmbH Co. KG 
MED 020 מערכת ציפוימקרטע BAL-TEC AGתנאי ציפוי
Cr: 120 mA, 1.3 x 10-2 mbar, 30 שניות
Au: 60 mA, 5.0 x 10-2 mbar, 45 שניות
Tecan Infinite M200 קורא צלחותTecan 
סרום בקר עוברי עט/סטרפטוקוס Gibco 15140

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Helm, G., Andersson, D., et al. Summary statement: Bone morphogenetic proteins: Basic science. Spine. 27 (16S), S9(2002).
  2. Hogan, B. Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development. Genes Dev. 10 (13), 1580-1594 (1996).
  3. Reddi, A. BMPs: from bone morphogenetic proteins to body morphogenetic proteins. Cytokine Growth Factor Rev. 16, 249-250 (2005).
  4. Rengachary, S. Bone morphogenetic proteins: basic concepts. Neurosurg Focus. 13 (6), 1-6 (2002).
  5. Schlunegger, M., Grütter, M. An unusual feature revealed by the crystal structure at 2.2 Å; resolution of human transforming growth factor-β2. Nature. 358, 430-434 (1992).
  6. Scheufler, C., Sebald, W., Hülsmeyer, M. Crystal structure of human bone morphogenetic protein-2 at 2.7 Å resolution. J. Mol. Biol. 287 (1), 103-115 (1999).
  7. Nimni, M. Polypeptide growth factors: targeted delivery systems. Biomaterials. 18 (18), 1201-1225 (1997).
  8. Wozney, J., Rosen, V. Bone morphogenetic protein and bone morphogenetic protein gene family in bone formation and repair. Clin. Orthop. Related Res. 346, 26(1998).
  9. Rosen, V. BMP and BMP inhibitors in bone. Annals of the New York Academy of Sciences. 1068, 19-25 (2006).
  10. Kirsch, T., Sebald, W., Dreyer, M. K. Crystal structure of the BMP-2-BRIA ectodomain complex. Nat. Struct. Biol. 7 (6), 492-496 (2000).
  11. Keller, S., Nickel, J., et al. Molecular recognition of BMP-2 and BMP receptor IA. Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (5), 481-488 (2004).
  12. Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T. BMP receptor signaling: transcriptional targets, regulation of signals, and signaling cross-talk. Cytokine Growth Factor Rev. 16 (3), 251-263 (2005).
  13. Nohe, A., Hassel, S., et al. The mode of bone morphogenetic protein (BMP) receptor oligomerization determines different BMP-2 signaling pathways. J. Biol. Chem. 277 (7), 5330-5338 (2002).
  14. Sieber, C., Kopf, J., et al. Recent advances in BMP receptor signaling. Cytokine Growth Factor Rev. 20 (5-6), 343-355 (2009).
  15. Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned. Spine J. 11, 471-491 (2011).
  16. Luginbuehl, V., Meinel, L., et al. Localized delivery of growth factors for bone repair. Eur. J. Pharm. Biopharm. 58 (2), 197-208 (2004).
  17. Nakaji-Hirabayashi, T., Kato, K., et al. Oriented immobilization of epidermal growth factor onto culture substrates for the selective expansion of neural stem cells. Biomaterials. 28 (24), 3517-3529 (2007).
  18. Gonçalves, R., Martins, M., et al. Bioactivity of immobilized EGF on self-assembled monolayers: Optimization of the immobilization process. J. Biomed. Mater. Res. Part A. 94A. 2 (2), 576-585 (2010).
  19. Pohl, T. L. M., Boergermann, J. H., et al. Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation. Acta Biomater. 8 (2), 772-780 (2012).
  20. Love, J., Estroff, L., et al. Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology. Chem. Rev. 105 (4), 1103-1169 (2005).
  21. Katagiri, T., Yamaguchi, A., et al. Bone morphogenetic protein-2 converts the differentiation pathway of C2C12 myoblasts into the osteoblast lineage. J. Cell Biol. 127 (6), 1755-1766 (1994).
  22. Whitaker, M. J., Quirk, R. A., et al. Growth factor release from tissue engineering scaffolds. J. Pharm. Pharmacol. 53 (11), 1427-1437 (2001).
  23. Uludag, H., D'Augusta, D., et al. Implantation of recombinant human bone morphogenetic proteins with biomaterial carriers: a correlation between protein pharmacokinetics and osteoinduction in the rat ectopic model. J. Biomed. Mater. Res. 50 (2), 227-238 (2000).
  24. Kashiwagi, K., Tsuji, T., et al. Directional BMP-2 for functionalization of titanium surfaces. Biomaterials. 30 (6), 1166-1175 (2008).
  25. Karageorgiou, V., Meinel, V. L., et al. Bone morphogenetic protein-2 decorated silk fibroin films induce osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells. J. Biomed. Mater. Res. 71 (3), 528-573 (2004).
  26. Rose, F. R. A. J., Hou, Q., et al. Delivery systems for bone growth factors - the new players in skeletal regeneration. J. Pharm. Pharmacol. 56 (4), 415-427 (2004).
  27. Masters, K. S. Covalent growth factor immobilization strategies for tissue repair and regeneration. Macromol. Biosci. 11 (9), 1149-1163 (2011).
  28. Crouzier, T., Fourel, L., et al. Presentation of BMP-2 from a soft biopolymeric film unveils its activity on cell adhesion and migration. Adv. Mater. 23 (12), H111-H118 (2011).
  29. Ruppert, R., Hoffmann, E., et al. Human bone morphogenetic protein 2 contains a heparin-binding site which modifies its biological activity. European Journal of Biochemistry. 237 (1), 295-302 (1996).
  30. Love, J., Estroff, L., et al. Self-assembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology. Chem. Rev. 105 (4), 1103-1169 (2005).
  31. Kato, K., Sato, H., Iwata, H. Immobilization of histidine-tagged recombinant proteins onto micropatterned surfaces for cell-based functional assays. Langmuir. 21 (16), 7071-7075 (2005).
  32. Martins, M., Curtin, S., et al. Molecularly designed surfaces for blood deheparinization using an immobilized heparin-binding peptide. J. Biomed. Mater. Res. 88 (1), 162-173 (2009).
  33. Limbut, W., Kanatharana, P., et al. A comparative study of capacitive immunosensors based on self-assembled monolayers formed from thiourea, thioctic acid, and 3- mercaptopropionic acid. Biosens. Bioelectron. 22 (2), 233-240 (2006).
  34. Patel, N., Davies, M., et al. Immobilization of protein molecules onto homogeneous and mixed carboxylate-terminated self-assembled monolayers. Langmuir. 13 (24), 6485-6490 (1997).
  35. Hu, J., Duppatla, V., et al. Site-specific PEGylation of bone morphogenetic protein-2 cysteine analogues. Bioconjug. Chem. 21 (10), 1762-1772 (2010).
  36. Hersel, U., Dahmen, C., Kessler, H. RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond. Biomaterials. 24 (24), 4385-4415 (2003).
  37. Cao, T., Wang, A., et al. Investigation of spacer length effect on immobilized Escherichia coli pili-antibody molecular recognition by AFM. Biotechnol. Bioeng. 98 (6), 1109-1122 (2007).
  38. Puleo, D., Kissling, R., Sheu, M. A technique to immobilize bioactive proteins, including bone morphogenetic protein-4 (BMP-4), on titanium alloy. Biomaterials. 23 (9), 2079-2087 (2002).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

BMP 2 Covalent BindingSelf assembled MonolayerGold Substrate PreparationM U N H S LinkerBMP 2 ImmobilizationAntibody Binding AssaySMAD 1 5 8 PhosphorylationAlkaline Phosphatase ActivityMyosin Heavy Chain StainingFluorescence Microscopy

מאמרים קשורים