מאמר שיטה

FtsZ פלמור מבחני: פרוטוקולים ושיקולים פשוטים

DOI:

10.3791/50844

⸱

16 בנובמבר 2013

 , 
1Department of Molecular Microbiology, Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute, University of Groningen

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פילמור של FtsZ חיוני לחלוקת תאי חיידקים. בדוח זה, אנו מפרטים פרוטוקולים פשוטים לניטור פעילות פילמור FtsZ ודנים בהשפעת הרכב המאגר. ניתן להשתמש בפרוטוקולים כדי לחקור את האינטראקציה של FtsZ עם חלבונים רגולטוריים או תרופות אנטיבקטריאליות המשפיעות על פילמור FtsZ.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במהלך חלוקת תא חיידק, FtsZ החלבון החיוני מרכיב באמצע של התא כדי ליצור את מה שנקרא Z-הטבעת. FtsZ polymerizes לחוטים ארוכים בנוכחות GTP במבחנה, ופילמור מוסדר על ידי מספר חלבוני אבזר. פילמור FtsZ נחקר בהרחבה במבחנה באמצעות שיטות בסיסיות כוללים פיזור אור, שקיעה, מבחני הידרוליזה GTP ומיקרוסקופ אלקטרונים. שני מאפייני השפעת תנאי חיץ פילמור של FtsZ, ואת היכולת של FtsZ לאינטראקציה עם חלבונים רגולטוריים. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים ללימודי פילמור FtsZ ולאמת את התנאים ושולטים באמצעות Escherichia coli וsubtilis Bacillus FtsZ חלבונים דגם. Assay שקיעת מהירות נמוכה הוא הציג שמאפשר הלימוד של האינטראקציה של FtsZ עם חלבונים שחבילה או tubulate פולימרים FtsZ. פרוטוקול assay GTPase השתפר מתואר המאפשר בדיקותשל הידרוליזה GTP לאורך זמן באמצעות תנאים שונים בהתקנת צלחת 96 היטב, עם זמני דגירה סטנדרטיים הלבטל וריאציה בהתפתחות צבע בתגובה לגילוי פוספט. הכנת דגימות ללימודי פיזור אור ומיקרוסקופ אלקטרונים מתוארת. כמה מאגרים המשמשים להקמת ה-pH המתאים חיץ וריכוז מלח ללימודי פילמור FtsZ. ריכוז גבוה של KCl הוא הטוב ביותר עבור רוב הניסויים. השיטות שלנו מספקות נקודה מוצא למבחנת האפיון בשל FtsZ, לא רק מE. coli ו-B subtilis אבל מכל חיידק אחר. ככזה, השיטות יכולות לשמש למחקרים על האינטראקציה של FtsZ עם חלבונים רגולטוריים או הבדיקה של תרופות אנטיבקטריאליות אשר עשוי להשפיע פילמור FtsZ.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החלבון החיידקי החיוני FtsZ הוא החלבון המאופיין בצורה הטובה ביותר של מנגנון חלוקת תאי החיידקים. FtsZ הוא ההומולוג הפרוקריוטי של טובולין ומתפלמר במבחנה באופן תלוי GTP. FtsZ הוא יעד אטרקטיבי מאוד לאנטיביוטיקה חדשה בשל אופיו השמור והייחודיות שלו לחיידקים1,2. בתחילת חלוקת התא, FtsZ יוצר טבעת ציטוקינטית באמצע התא, המשמשת כפיגום להרכבה של חלבוני חלוקת תאים אחרים. היווצרות טבעת ה- Z חיונית ללוקליזציה נכונה של מישור החלוקה. דינמיקת ההרכבה של FtsZ מווסתת על ידי מספר חלבונים נלווים, כגון (תלוי במין החיידקים) MinC, SepF, ZapA, UgtP ו-EzrA2. פילמור FtsZ נחקר באופן אינטנסיבי במבחנה ותוארו מבנים רבים ושונים כולל פרוטופילמנטים ישרים, פרוטופילמנטים מעוקלים, יריעות חוטים, צרורות חוטים וצינורות חוטים בהתאם למאגר ההרכבה, הנוקלאוטיד וחלבונים נוספים הכלולים בבדיקה3. הארכיטקטורה של פרוטופילמנטים של FtsZ in vivo עדיין לא מובנת במלואה, אם כי ניסויי קריוטומוגרפיה אלקטרונית ב-Caulobacter crescentus מצביעים על כך שטבעת ה-Z מורכבת מפרופילמנטים בודדים קצרים יחסית ולא רציפים ללא צרור נרחב4.

במבחנה, תכונות הפילמור של FtsZ והאינטראקציה של FtsZ עם חלבונים רגולטוריים רגישות להרכב מאגר התגובה. לדוגמה, תיארנו לאחרונה את אתר האינטראקציה עבור SepF במסוף FtsZ C והראינו כי חיתוך FtsZBs∆16 C-terminal כבר לא נקשר ל-SepF5. במחקר קודם על האינטראקציה בין SepF-FtsZBs, קטום דומה של FtsZBs∆16 עדיין משקע יחד עם SepF, מה שהציע ש-SepF נקשר לאתר משני ב-FtsZ6. ההבדל בין מחקרים אלה היה הרכב חוצצי התגובה - ב-pH 7.5 לא הייתה קו-סקצנציה של SepF עם קטום FtsZ, בעוד שב-pH 6.5 הייתה קו-סקציה. Gündoğdu et al. ציין כי SepF אינו מתפקד ומשקע ב-pH 6.57, מה שמראה כי הקו-שקיעה שנצפתה ב-pH 6.5 עשויה להיגרם על ידי משקעים של SepF ולא על ידי אינטראקציה עם קטום FtsZBs∆16 C-terminal. השפעת ריכוז ה-pH וה-KCl על הפילמור של FtsZ נבדקה בעבר. פולימרים של E. coli FtsZ (FtsZEc) ב-pH 6.5 ארוכים ושופעים יותר מאלה שנוצרו ב-pHניטרלי 8,9. טדרוס ואחרים. חקרו את הפילמור של FtsZEc בנוכחות קטיונים חד-ערכיים, וציינו כי קשירת K+ קשורה לפילמור FtsZEc והיא חיונית לפעילות FtsZ10. ה-pH הוא קריטי יותר כאשר נחקרת האינטראקציה של FtsZ עם חלבונים אחרים, כפי שמוצג בדוגמה הקודמת של SepF, ותלות ה-pH של ההשפעה המעכבת של MinC על FtsZ11. מכיוון שגם pH וגם ריכוז המלח עשויים להשפיע על האינטראקציה של FtsZ עם חלבונים אחרים, חשוב לבחור את התנאים והבקרות הנכונים למחקרי הפילמור של FtsZ.

כאן אנו מתארים פרוטוקולים לחקר פילמור FtsZ ופעילות GTPase על ידי פיזור אור, מיקרוסקופ אלקטרונים, שקיעה ומבחני GTPase. פיזור אור בזווית ישרה הוא שיטה סטנדרטית לחקר פילמור FtsZ בזמן אמת12. הכנסנו כמה שיפורים לבדיקת המשקעים ו-GTPase. אנו מציגים בפירוט כיצד להכין דגימות לפיזור אור ומיקרוסקופ אלקטרונים. נבדקו מספר חוצצים המשמשים בספרות לחקר פילמור FtsZ ואנו מתארים את התנאים הטובים ביותר לכל ניסוי. אנו גם מראים אילו בקרות יש להציג כדי להשיג את הנתונים הטובים ביותר.

שיטות אלו מאפשרות מחקר מהיר של פילמור, פעילות ואינטראקציה עם חלבונים אחרים באמצעות שיטות וציוד פשוטים הזמינים ברוב המעבדות. קיימות שיטות מתוחכמות יותר לחקר פילמור FtsZ אך לעתים קרובות דורשות גישה לציוד מיוחד יותר, ו/או שינוי של FtsZ עם תוויות פלואורסצנטיות8,13,14. השיטות הפשוטות המתוארות במאמר זה מודגמות באמצעות FtsZ מ-B. subtilis ו-E. coli, האורגניזמים הנפוצים ביותר במודל Gram+ ו-Gram-. ניתן להתאים את הפרוטוקולים לכל חלבון FtsZ אחר. בהתבסס על בדיקות ראשוניות עם FtsZs חדשים אלה, ייתכן שיהיה צורך בשינויים קלים לגבי זמן, חיץ או טמפרטורת הדגירה לתוצאה אופטימלית. הניסויים המתוארים כאן אמורים לסייע במציאת התנאים האופטימליים הללו.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חלבוני FtsZ לא מתויגים טוהרו כמתואר קודם לכן11,15, עברו דיאליזה כנגד 20 מ"מ Tris/HCl (pH 7.9), 50 מ"מ KCl, 1 מ"מ EGTA, 2.5 מ"מ MgAc ו-10% גליצרול ואוחסנו ב-80 מעלות צלזיוס. בתנאים אלה ניתן לאחסן את החלבון מעל שנתיים ללא אובדן משמעותי של פעילות. יש לאחסן את החלבון ב-100 מיקרוליטר כדי למנוע הפשרה והקפאה של הדגימה. לאחר ההפשרה, ניתן לשמור את הדגימה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שבוע לכל היותר. FtsZ מסיס בריכוזים גבוהים וניתן לאחסן אותו במינון של 7-10 מ"ג/מ"ל. חשוב לשמור על ריכוז חלבון גבוה כדי למנוע השפעות לא רצויות של רכיבי חיץ אחסון בניסויים מאוחרים יותר. לפיכך, ריכוז האחסון אמור לאפשר דילול של FtsZ של לפחות פי 10 כדי להוריד את ריכוז הגליצרול מתחת ל-1% ולמזער את ריכוז המרכיבים האחרים של מאגר הדיאליזה בתערובת התגובה. פילמור FtsZ עשוי להיות מושפע גם מנוכחות של ריכוזי נתרן9 או אימידזול גבוהים ולכן יש להסיר רכיבים אלה ממאגר הפילמור. SepF טוהר כמתואר7 ואוחסנו במאגר פליטה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. נהלים חלופיים שפורסמו לטיהור FtsZ מ-E. coli ו-B. subtilis וכן הפניות לנהלים לטיהור FtsZ ממקורות שונים מסוכמים בטבלה 1 (ראה סעיף תוצאות מייצגות).

1. הכנת מדגם

  1. הכן מאגרי פילמור: <גבול טבלה="1"> 1 50 מ"מ Hepes / NaOH, pH 7.5 2 25 מ"מ צנרת/NaOH, pH 6.8 3 50 מ"מ MES/NaOH, pH 6.5 4 50 מ"מ Hepes/NaOH, pH 7.5; 50 מ"מ KCl 5 25 מ"מ צנרת/NaOH, pH 6.8; 50 מ"מ KCl 6 50 מ"מ MES/NaOH, pH 6.5; 50 מ"מ KCl 7 50 מ"מ Hepes/NaOH, pH 7.5; 300 מ"מ KCl 8 25 מ"מ צנרת/NaOH, pH 6.8; 300 מ"מ KCl 9 50 מ"מ MES/NaOH, pH 6.5; 300 מ"מ KCl
  2. מסנן לעקר את כל המאגרים באמצעות מסנן ממברנה של 22 מיקרומטר.
  3. הכן תמיסות מלאי של 100 מ"מ GTP, GDP ו-MgCl2 בכל מאגר פילמור מ-(1).
  4. קליר את החלבונים על ידי סיבוב ב-100,000 x g במשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס עבור כל הניסויים.

2. בדיקת שקיעה FtsZ

  1. הכן את תערובת התגובה על ידי הוספת MgCl2 ו-FtsZ לאחד ממאגרי הפילמור (ראה נקודת הכנת דגימה 1) בצינורות התואמים לצנטריפוגה במהירות גבוהה. הנפח הכולל צריך להיות 49 מיקרוליטר, כאשר MgCl2 ב-10 מ"מ ו-FtsZ ב-12 מיקרומטר בנפח סופי של 50 מיקרוליטר.
  2. הנח את הצינור באינקובטור עם פונקציית ניעור, דגר למשך 2 דקות ב-30 מעלות צלזיוס ב-300 סל"ד (לחלופין ניתן להחליק את הדגימה בעדינות ומיקרו-פוזה קצרה ולאחר מכן לחמם מראש ב-30 מעלות צלזיוס).
  3. התחל פילמור על ידי הוספת 1 מיקרוליטר של תמיסת מלאי GTP או GDP באותו מאגר ששימש בניסוי (ריכוז סופי של 2 מ"מ). דגירה למשך 10 או 2 דקות (עבור חוצצים עם 50 מ"מ KCl ו-300 מ"מ KCl, בהתאמה) ב-30 מעלות צלזיוס ב-300 סל"ד (או בחממה עם פונקציית טלטול).
  4. העבירו את הצינורות לרוטור אולטרה-צנטריפוגה וסובבו כלפי מטה למשך 10 דקות ב-350,000 x g (89,700 סל"ד עבור רוטור TLA 120.1) ב-25 מעלות צלזיוס.
  5. לאחר הסיבוב, הסר בזהירות את הצינורות מהרוטור והעביר מיד את הסופרנטנט לצינור נקי. הכן דגימות עבור SDS-PAGE על ידי הוספת 20 מיקרוליטר של סופרנטנט ל-20 מיקרוליטר של מאגר דגימה פי 2. מרתיחים 10 דקות בחום של 98 מעלות צלזיוס.
  6. הוסף 50 מיקרוליטר של מאגר דגימה פי 2 לשבר הגלולה המכיל פולימרים FtsZ. הנח את צינור האולטרה-צנטריפוגה בשפופרת של 2 מ"ל. השעו מחדש את הגלולה על ידי רתיחה למשך 10 דקות בטמפרטורה של 98 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן הוסיפו 50 מיקרוליטר של H2O דה-מינרלי כדי להפוך את הדגימה לאותו דילול פי 2 כמו דגימת העל.
  7. הפוך את צינור האולטרה-צנטריפוגה הפוך בצינור 2 מ"ל וסובב כלפי מטה במשך 5 דקות בצנטריפוגה אפנדורף ב-18,000 x גרם. הסר את צינור האולטרה-צנטריפוגה מצינור ה-2 מ"ל.
  8. טען 10 מיקרוליטר מכל דגימת סופרנטנט וגלולה זו לצד זו על ג'ל SDS-PAGE 10%. הפעל את הג'ל ב -150 וולט.
  9. צבעו את הג'ל עם Coomassie Brilliant Blue G-250 ושמרו לכימות.

3. בדיקת שקיעה FtsZ בסיבוב איטי

  1. הכן תמיסת פילמור כמו בשלב 2, הוסף SepF ו/או FtsZ (ריכוז סופי 12 מיקרומטר). ניתן לבצע ניסויים אלה בשפופרות חד פעמיות של בקמן בנפח 1.5 מ"ל בשילוב עם רוטור TLA-55.
  2. הנח את הצינור באינקובטור עם פונקציית ניעור ודגר למשך 2 דקות ב-30 מעלות צלזיוס ב-300 סל"ד.
  3. התחל פילמור על ידי הוספת 1 מיקרוליטר של GTP או תמ"ג מתמיסת מלאי (ריכוז סופי 2 מ"מ), דגירה למשך 20 דקות ב-30 מעלות צלזיוס ב-300 סל"ד.
  4. הסתובב למשך 15 דקות ב-24,600 x g (20,000 סל"ד עבור רוטור TLA 55) ב-25 מעלות צלזיוס.
  5. הסר את הסופרנטנט והעביר לצינור נקי, קח 20 מיקרוליטר והעביר ל-20 מיקרוליטר של מאגר דגימה פי 2. מרתיחים 10 דקות בחום של 98 מעלות צלזיוס.
  6. הוסף 50 מיקרוליטר של מאגר דגימה פי 2 לשבר גלולה המכיל פולימרים והשהה מחדש על ידי רתיחה למשך 10 דקות ב-98 מעלות צלזיוס, הוסף 50 מיקרוליטר של H2O דה-מינרלי.
  7. טען 10 מיקרוליטר מכל דגימת סופרנטנט וגלולה זו לצד זו על ג'ל SDS-PAGE 10%. הפעל את הג'ל ב -150 וולט.
  8. צבעו את הג'ל עם Coomassie Brilliant Blue G-250 ושמרו לכימות.

4. כימות מבחני המשקעים של FtsZ

  1. צלם תמונה של הג'ל המוכתם של Coomassie באמצעות מערכת תיעוד ג'ל (למשל LAS-4000, Fujifilm).
  2. פתח את תמונת הג'ל בתוכנית המתאימה לניתוח צפיפות של ג'לים (למשל תוכנית מנתח תמונות AIDA (Raytest)) ותאר ניתוח בתוכנית זו להלן.
  3. לחץ על כפתור "הערכה" בסרגל הכלים.
  4. בחר את "צפיפות דו-ממדית" מהרשימה ולחץ על אישור.
  5. בתפריט הראשי, לחץ על "הערכה" ובחר את הערך "קביעת אזור".
  6. כדי ליצור אזור על הג'ל, לחץ על הסמל של הכלי Auto-contour בארגז הכלים Region Setting.
  7. לחץ בפינה השמאלית העליונה של רצועת החלבון בג'ל, החזק את לחצן העכבר לחוץ וגרור אותו לקצה הימני התחתון הרצוי של הרצועה ושחרר את לחצן העכבר.
  8. סמן כל פס FtsZ/SepF באותו אופן.
  9. ניתן למצוא את כל המידע אודות הערכת האזורים שהוקצו בדוח האזור. כדי לקבל את דוח האזור, לחץ על הלחצן "הצג דוח אזור" בארגז הכלים של קביעת אזור.
  10. כדי לייצא את הדוח, בתפריט הראשי, לחץ על קובץ ובחר ערך "ייצוא à דוח אזור דו-ממדי".
  11. בדוח האזור יש למצוא את העוצמה של כל אזור שנוצר. חשב את אחוז החלבון (FtsZ, חלבון רגולטורי) בגלולה באמצעות ערכי העוצמה מהדוח.

5. פיזור אור 90°

  1. הפעל ספקטרומטר פלואורסצנטי (למשל AMINCO-Bowman Series 2), אפשר למנורה להתחמם במשך מספר דקות כדי למנוע תנודות תרמיות והפעל אמבט מים במחזור כדי לשמור על טמפרטורת תא הקובט על 30 מעלות צלזיוס.
  2. הגדירו את פרמטרי ההפעלה של הספקטרומטר: גלאי מתח גבוה 300 וולט, אורך גל פליטה ועירור: 350 ננומטר, רוחב חריץ: 4 ננומטר. שימו לב שספקטרומטרים רבים מכוונים אוטומטית את האות בתחילת הניסוי לאחוז מסוים (למשל 60%) מהמקסימום. זה גורם לאות פיזור לצאת מהטווח ברגע שמוסיפים GTP כדי לפלמר את FtsZ. זה חכם לקבוע תחילה את הגברת האות הנכונה - גלאי מתח גבוה - לפילמור מקסימלי לפני תחילת סדרת ניסויים.
  3. תכנת פרוטוקול רכישת נתונים. בחר רכישה מבוססת זמן, עם משך של 3,600 שניות.
  4. נקו בזהירות קובטה פלואורסצנטית עם מים ואתנול, במידת הצורך - סוניקט באמבט מים בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. בפרוטוקול זה נעשה שימוש בקובטות באורך נתיב של 1 ס"מ ונפח של 200 מיקרוליטר ואוחסנו בתמיסת אחסון (0.5-1% Hellmanex). כחלופה, ניתן להשתמש בקובטות פלסטיק תואמות UV לשימוש חד פעמי (UVette, Eppendorf).
  5. הכן 294 מיקרוליטר של תערובת מאסטר של מאגר הפילמור (ראה נקודת הכנת דגימה 1) עם 10 מ"מ MgCl2 ו-12 מיקרומטר FtsZ כריכוז סופי המחושב עבור 300 מיקרוליטר ומערבולת.
  6. העבירו 196 מיקרוליטר ממאגר הפילמור לקובט והניחו אותו בספקטרומטר. יש לדגור למשך 2 דקות בחום של 30 מעלות צלזיוס.
  7. התחל את רכישת הנתונים והמתן 90 שניות כדי לוודא שהאות יציב.
  8. הוסף 4 מיקרוליטר של 100 מ"מ GTP או תמ"ג (ריכוז סופי: 2 מ"מ) כדי להשיג נפח תגובה סופי של 200 מיקרוליטר, פיפטה למעלה ולמטה עם פיפטה בנפח גדול יותר כדי לערבב ולחדש את הרכישה.

6. מיקרוסקופ אלקטרונים שידור

  1. הכן דגימות כמו לבדיקת השקיעה של FtsZ (ניתן להפחית את הנפח ל-10 מיקרוליטר נפח סופי כדי לחסוך בחומר).
  2. לאחר זמן הדגירה, יש למרוח 2 מיקרוליטר מהדגימה על רשת נחושת מצופה פחמן 400 רשת זוהרת, לדגור למשך 15 שניות.
  3. כתם את הרשת יבשה על ידי נגיעה או גרירה עדינה של הרשת במקביל או בניצב לפיסת נייר פילטר.
  4. צבעו את הרשת באמצעות 4 מיקרוליטר של תמיסת אורניל-אצטט 2%. כתם את הרשת יבשה כמתואר בשלב 6.3.
  5. צפה ברשת במיקרוסקופ אלקטרונים CM120 של פיליפס הפועל ב-120 קילו וולט בהגדלה של פי 39,200.

7. בדיקת הידרוליזה GTP

הגדרת הניסוי מתוכננת בצורה כזו שהידרוליזה GTP של FtsZ נעצרת לאחר זמני תגובה שונים על ידי ערבוב התגובה עם ירוק מלכיט. באופן זה, זמן התפתחות הצבע של ירוק מלכיט זהה לכל דגימה.

  1. הכן 1.5 מ"ל 2 מ"מ GTP באחד ממאגרי הפילמור (ראה הכנת מדגם, נקודה 1).
    הכן דילול סטנדרטי של פוספט 0-40 מיקרומטר במאגר פילמור, והכן מגיב עבודה ירוק מלכיט כמתואר בערכת POMG-25H (בדיקות ביו). לחלופין, ניתן להכין ריאגנטים עובדים בתוך הבית על פי פרוטוקולים שתוארו על ידי Lanzetta et al.16
  2. הכן תערובות מאסטר בנפח כולל 360 מיקרוליטר: <גבול טבלה="1"> אני 24 μM FtsZBs, 20 mM MgCl2, חוצץ פילמור השני 12 μM FtsZEc, 20 mM MgCl2, חוצץ פילמור III (בקרה 1) 24 μM FtsZBs, 2 mM EDTA, חוצץ פילמור IV (בקרה 2) 12 μM FtsZEc, 2 mM EDTA, חוצץ פילמור
  3. פיפטה 20 מיקרוליטר של תערובות המאסטר, תקני פוספט של 100 מיקרוליטר ו-180 מיקרוליטר של 2 מ"מ GTP בצלחת qPCR של 96 בארות בסדר הבא: <גבול טבלה="1"> א ב ג ד ה פ ז ח 1 השלישי השלישי אני אני הרביעי הרביעי השני השני 2 השלישי השלישי אני אני הרביעי הרביעי השני השני 3 השלישי השלישי אני אני הרביעי הרביעי השני השני 4 השלישי השלישי אני אני הרביעי הרביעי השני השני 5 השלישי השלישי אני אני הרביעי הרביעי השני השני 6 השלישי השלישי אני אני הרביעי הרביעי השני השני 7 השלישי השלישי אני אני הרביעי הרביעי השני השני 8 השלישי השלישי אני אני הרביעי הרביעי השני השני 9 נ.ב. נ.ב. נ.ב. נ.ב. נ.ב. נ.ב. נ.ב. נ.ב. 10 נ.ב. נ.ב. נ.ב. נ.ב. נ.ב. נ.ב. נ.ב. נ.ב. 11 12 GTP GTP GTP GTP GTP GTP GTP GTP
    PS - תקן פוספט
  4. הנח את לוחית ה-qPCR במכונת PCR כשהתוכנית מוגדרת למחזור של 40 דקות ב-30 מעלות צלזיוס.
  5. הכן 20 מיקרוליטר של מגיב עבודה ירוק מלכיט בצלחת של 96 בארות. הוסף 60 מיקרוליטר של מאגר הפילמור מהניסוי לנתיבים 1'-8'. הדגימה תדולל פי 4 בהשוואה לתקן הפוספט, אנא קחו בחשבון עובדה זו במהלך החישובים הסופיים. . . . . . . . . . . . . . . . .
    אבגדהפזח
    1'השלישיהשלישיאניאניהרביעיהרביעיהשניהשני
    2'השלישיהשלישיאניאניהרביעיהרביעיהשניהשני
    3'השלישיהשלישיאניאניהרביעיהרביעיהשניהשני
    4'השלישיהשלישיאניאניהרביעיהרביעיהשניהשני
    5'השלישיהשלישיאניאניהרביעיהרביעיהשניהשני
    6'השלישיהשלישיאניאניהרביעיהרביעיהשניהשני
    7'השלישיהשלישיאניאניהרביעיהרביעיהשניהשני
    8'השלישיהשלישיאניאניהרביעיהרביעיהשניהשני
    9'נ.בנ.בנ.בנ.בנ.בנ.בנ.בנ.ב
    10'נ.בנ.בנ.בנ.בנ.בנ.בנ.בנ.ב
  6. הוסף 20 מיקרוליטר GTP לנתיב 1, פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב, טיימר התחלה (זוהי נקודת זמן ההתחלה לתגובה של 30 דקות).
  7. לאחר 10 דקות, 30 שניות הוסף GTP לנתיב 2, פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב (תגובה של 20 דקות).
  8. לאחר 16 דקות הוסף GTP לנתיב 3, פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב (תגובה של 15 דקות).
  9. לאחר 21 דקות, 30 שניות הוסף GTP לנתיב 4, פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב (תגובה של 10 דקות).
  10. לאחר 25 דקות הוסף GTP לנתיב 5, פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב (תגובה של 7 דקות).
  11. לאחר 27 דקות, 30 שניות הוסף GTP לנתיב 6, פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב (תגובה של 5 דקות).
  12. לאחר 29 דקות הוסף GTP לנתיב 7, פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב (תגובה של 4 דקות)..
  13. לאחר 30 דקות העבירו 20 מיקרוליטר מנתיב 1 לנתיב 1', פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב (נקודת התחלה של התפתחות צבע ירוק מלכיט לתגובה של 30 דקות).
  14. לאחר 30 דקות, 30 שניות העבירו 20 מיקרוליטר מנתיב 2 ל-2', פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב (נקודת התחלה של התפתחות צבע ירוק מלכיט לתגובה של 20 דקות).
  15. חזור על השלב עבור נתיבים 3-7 כל 30 שניות.
  16. לאחר 33 דקות, 30 שניות הוסף 20 מיקרוליטר של GTP לנתיב 8, פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב ולהעביר 20 מיקרוליטר לנתיב 8', פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב (0 דקות תגובה ונקודת זמן התחלה לפיתוח צבע ירוק מלכיט לתגובה).
  17. לאחר 34 דקות הוסף 80 מיקרוליטר מנתיב 9 עד 9', פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב (נקודת זמן ההתחלה לפיתוח צבע ירוק מלכיט עבור תקן הפוספט 1).
  18. לאחר העברת 80 מיקרוליטר מנתיב 10 ל-10 דקות ו-30 שניות, פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב (נקודת הזמן ההתחלתית לפיתוח צבע ירוק מלכיט עבור תקן הפוספט 2).
  19. הסר את כל בועות האוויר מהדגימות ודגר את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 25 דקות ו-30 שניות נוספות.
  20. הנח את הצלחת בקורא צלחות 96 בארות.
  21. לאחר 60 דקות מדוד את הצלחת פי 10 כל 30 שניות באורך גל 630 ננומטר (התפתחות הצבע הירוק מלכיט היא כעת 30 דקות לתגובה הראשונה). כל מדידה מתאימה לכל נקודת זמן משלבים 7.6-7.12 ו-7.16 ויש לחשב אותה בנפרד במהלך ניתוח נתונים.
  22. חשב את הפוספט החופשי בכל דגימה באמצעות עקומת הכיול הסטנדרטית של הפוספט.
  23. שרטט את הנתונים כשחרור פוספט לאורך זמן, וחשב את פעילות ההידרוליזה של FtsZ GTP מהטווח הליניארי של העקומה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיהור FtsZ ממקורות חיידקים שונים תואר בספרות ומסוכם בטבלה 1.

<גבול טבלה="1"> מקור שיטת שינוי התשואה המתקבלת [מ"ג/ליטר תרבית]> הפניות ב. סבטיליס 1) משקעים של אמוניום גופרתי/כרומטוגרפיה של חילופי יונים לא 40 עבודה זו, 11,15 2) כרומטוגרפיה של זיקה התג שלו נ.ד 17 אי קולי 1) משקעים של אמוניום גופרתי/כרומטוגרפיה של חילופי יונים לא 35 עבודה זו, 11,15 2) משקעי סידן, כרומטוגרפיה של חילופי יונים לא 40 18 Methanococcus jannaschii 1) כרומטוגרפיה של זיקה בתנאי דנטורציה/קיפול מחדש/משקעי אמוניום גופרתי/סינון ג'ל התג שלו 1.3 19 2) כרומטוגרפיה / סינון ג'ל התג שלו נ.ד 20 תרמוטוגה ימית כרומטוגרפיה של חילופי יונים/סינון ג'ל לא 6.7 19 Pseudomonas aeruginosa כרומטוגרפיה / סינון ג'ל תג סטרפטוק, תג שלו נ.ד 21 מיקובקטריום טוברקולוזיס 1) כרומטוגרפיה של זיקה/חילופי יונים לא נ.ד 22 2) כרומטוגרפיה / סינון ג'ל לא 30 23 אקוויפקס אאוליקוס כרומטוגרפיה / סינון ג'ל His-tag, חיתוך מסוף C (331-367) נ.ד 24 Caulobacter crescentus כרומטוגרפיה של חילופי יונים/משקעים של אמוניום גופרתי/סינון ג'ל לא נ.ד 25

טבלה 1. פרוטוקולי טיהור FtsZ מתוארים. נ.ד.: לא נחוש.

שקיעה של פולימרים FtsZ

בתחילה, השתמשנו בשתי מהירויות שונות כדי לסובב פולימרים FtsZ. מצאנו שרק במהירות של 350,000 x g פולימרים בודדים של FtsZEc מסובבים כלפי מטה (איור 1) בעוד שב-190,000 x g רק צרורות של FtsZBs נמצאים בשבר הגלולה (הנתונים לא מוצגים). לכן נעשה שימוש ב-350,000 x g בניסויים הבאים שלנו. אחוז הפולימרים FtsZEc ו-FtsZBs דומה ב-50 מ"מ KCl למרות שניסויי פיזור האור חשפו אות פיזור גבוה בהרבה עבור FtsZBs. זאת בשל צרורות שנוצרו על ידי FtsZBs המפזרים יותר אור מאשר פולימרים בודדים של FtsZEc. לא ניתן היה להשיג כמות גבוהה של פולימרי FtsZ בשבר הגלולה בניסוי עם 300 מ"מ KCl הן עבור FtsZEc והן עבור FtsZBs (איור 1). אנו מייחסים זאת לשילוב של פירוק מהיר של מבני ה-FtsZ וירידה בחבילה של החוטים.

שקיעה של צינורות FtsZ-SepF

כדי לנתח את האינטראקציה של FtsZ עם מפעילים מסוימים, ניתן לבצע בדיקות שקיעה במהירויות צנטריפוגה נמוכות יותר. במהירות זו ניתן לגלול רק מבנים גדולים של FtsZ, למשל הצינורות הגדולים שנוצרו על ידי טבעות SepF וחוטי FtsZBs 5, או הצרורות שנוצרו על ידי FtsZ ו-ZapA. השתמשנו בצנטריפוגה נמוכה יותר (24,600 x גרם) כדי להדגים את ההיתכנות של גישה זו עבור הצינוריות שנוצרו על ידי FtsZ ו-SepF. FtsZ התגלה בכדור מעל רמות הרקע רק כאשר גם SepF וגם GTP היו נוכחים בדגימה (איור 2), ונוכחות SepF אינה משפיעה על פעילות FtsZ GTPase7 מה שמראה ש-FtsZ פעיל לחלוטין בנוכחות SepF. שקיעה ספציפית של SepF ו-FtsZ היא בערך 45% מסך ה-SepF ו-15% מסך ה-FtsZ (בהשוואה למשקעים חומריים כאשר מוסיפים תמ"ג). זה מראה שצינורות SepF-FtsZ מכילים יותר SepF מאשר FtsZ. ייתכן שהסיבה לכך היא שטבעות SepF רבות מארגנות את צינורות FtsZ-SepF5,7. הסטוכיומטריה המדויקת של SepF-FtsZ בצינורות אלה אינה ידועה, אך התוצאות שלנו מצביעות על כך שיש יותר SepF מאשר FtsZ.

FtsZEc ו- FtsZBs תכונות פילמור וחבילה

כדי לאפיין את יעילות הפילמור של FtsZBs ו-FtsZEc במאגרים שונים, ניתחנו את שני החלבונים על ידי פיזור אור בזווית של 90°. ב-50 mM KCl, FtsZBs נותן אות פיזור אור גבוה פי 20-40 מ-FtsZEc בהתאם ל-pH של המאגר (איורים 3A ו-B) המאשרים את התוצאות של Buske et al. 26 הגדלת ריכוז ה-KCl במאגר לא השפיעה באופן משמעותי על אות פיזור האור של FtsZEc (איור 3D) אך האות של FtsZBs ירד פי 80~ ב-pH 7.5, פי 30~ ב-pH 6.8 ופי 45~ ב-pH 6.5 ב-300 מ"מ KCl (איור 3C) בהשוואה למאגרים עם 50 מ"מ KCl (איור 3A). פירוק של פולימרי FtsZ מהיר יותר בריכוז KCl גבוה יותר עבור שני החלבונים (איורים 3C ו-D). מחקרים של Pacheco-Gómez et al. מראים כי פילמור וחבילה של E. coli FtsZ תלויים ב-pH. מחברים אלה מצאו כי במאגר עם 50 מ"מ KCl אות פיזור האור של פילמור FtsZ היה גבוה יותר, ופירוק FtsZ לקח זמן רב יותר ב-pH 6.0 בהשוואה ל-pH 7.0 8. תוצאות אלה אינן תואמות את הנתונים שלנו מפילמור של FtsZEc ב-50 מ"מ KCl (איור 3B), אך יש לציין שהשתמשנו בשלושה מאגרים שונים (HEPES, MES ו-PIPES) כאשר Pacheco-Gómez et al. השתמשו רק ב-MES. לפיכך, לא רק ה-pH, אלא גם הרכב החיץ (חוזק יוני) משפיע על הקינטיקה של פולימרי FtsZ ב-50 מ"מ KCl. עם זאת, ב-300 מ"מ KCl לא הרכב המאגר ולא ה-pH השפיעו על הרכבת FtsZEc בצורה ניתנת לזיהוי.

ניסוי פיזור אור של FtsZBs במאגרים ללא KCl לא התאפשר עקב משקעים של החלבון בתנאים אלה. כאשר ריכוז FtsZBs ירד ל-3 מיקרומטר, לא התרחשו משקעים. עם זאת, 3 מיקרומטר אינו הריכוז הפיזיולוגי של FtsZ בתא. בקובטות פלסטיק, FtsZBs לא שקע ב-12 מיקרומטר ב-pH 7.5, אך ב-pH 6.8 ו-6.5 FtsZ עדיין שקע בהיעדר KCl.

מורפולוגיות של מבני FtsZ מ-E. coli ו-B. subtilis

המבנים שנוצרו על ידי FtsZ נבדקו על ידי TEM. FtsZBs הורכבו לפולימרים דחוסים היטב שכיסו את כל הרשת בכל המאגרים במלח נמוך (איורים 4A-C). FtsZEc יצר חוטים ארוכים, כבלים וצרורות בכל המאגרים במלח נמוך (איורים 4D-F). עם זאת, הכמות הנצפית של פולימרים שנוצרו על ידי FtsZEc הייתה נמוכה מהכמות שנוצרה על ידי FtsZBs. במאגרי מלח גבוהים, FtsZBs יצרו פרוטופילמנטים חד-גדיליים ארוכים יותר שלא התחברו לצרורות (איורים 4G-I). בעוד שפרוטופילמנטים של FtsZBs שינו מבנה בריכוז מלח גבוה יותר, FtsZEc יצרו מבנים שלא ניתן להבחין בינם לבין אלה של מאגר מלח נמוך (איורים 4J-L). לא הייתה השפעה נצפית של pH על פילמור של FtsZEc אך FtsZBs יוצר יותר צרורות ב-pH 6.5 הנראים כפולימרים ויריעות דחוסים היטב (איור 4B). תוצאות אלה תואמות את ניסויי פיזור האור שלנו ועבודת TEM שפורסמה בעבר8,11,26.

פעילות GTPase של FtsZ בריכוזי KCl גבוהים ונמוכים

פעילות ההידרוליזה GTP של FtsZ נמדדה בתנאים שונים באמצעות מבחן קולורימטרי לפוספט חופשי. כפי שדווח קודם לכן15 פעילות ה-GTPase של FtsZ גדלה עם הגדלת ריכוז KCl: תלוי במאגר המשמש FtsZBs. הראה עלייה של פי 3-7, ו-FtsZEc הראה עלייה של פי 1.5-2.5 בפעילות GTPase ב-300 מ"מ KCl בהשוואה ל-50 מ"מ KCl. פעילות ה-GTPase המופחתת ב-50 מ"מ KCl נובעת מחבילה של חוטי FtsZBs. ב-50 מ"מ ל-KCl FtsZEc הייתה פעילות GTPase גבוהה פי 3-6 מאשר ל-FtsZBs עקב פירוק מהיר יותר של פולימרי FtsZEc. ההבדל בפעילות ההידרוליזה של GTP בין FtsZBs ל-FtsZEc הצטמצם ב-300 מ"מ KCl, אולי בגלל צרור מופחת של חוטי FtsZBs (איור 5).

figure-results-1
איור 1. כימות פילמור FtsZ על ידי שקיעה. (A) 12 מיקרומטר FtsZ עבר פולימור בנוכחות 2 מ"מ GTP או תמ"ג ב-pH 7.5 (פסים שחורים), 6.8 (פסים אפורים) או 6.5 (פסים לבנים). כמות החלבון הגלולה נקבעה על ידי ניתוח צפוף של ג'לים מוכתמים של Coomassie. התמ"ג שימש כבקרה למשקעים ספציפיים ואחוז ה-FtsZ המשקע עם התמ"ג הופחת מאחוז ה-FtsZ המשקע עם GTP כדי לקבל את הערכים המשורטטים בגרף. משמאל: FtsZ משקע ב-50 מ"מ KCl, מימין: FtsZ משקע ב-300 מ"מ KCl. (B) תוצאות מייצגות מג'לים מוכתמים של Coomassie. פילמור של FtsZBs (ג'ל עליון) ו-FtsZEc (ג'ל תחתון) ב-50 מ"מ KCl. (S) supernatant, (P) שברי כדורים מהניסוי. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

figure-results-2
איור 2. שקיעה של צינורות SepF/FtsZ במהירות נמוכה. (A) 12 מיקרומטר FtsZBs עבר פולימור עם תמ"ג של 2 מילימטר (פסים לבנים) או GTP (פסים שחורים). כמות החלבון הגלולה נקבעה על ידי ניתוח צפוף של ג'לים מוכתמים של Coomassie. הסימנים + ו- מתחת לציר ה- x מצביעים על נוכחות או היעדר של FtsZ ו- SepF בתגובה. (B) תוצאות מייצגות מג'ל מוכתם של Coomassie. פילמור של FtsZBs בנוכחות ובהיעדר SepF. כבקרה נעשה שימוש ב-SepF ללא FtsZ. הפילמור בוצע עם GTP ותמ"ג. (S) סופרנטנט, (P) שברי כדורים מהניסוי. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

figure-results-3
איור 3. פיזור אור של 12 μM FtsZEc ו-12 μM FtsZBs. FtsZs הורכבו בנוכחות 2 מ"מ GTP והפילמור נוטר על ידי פיזור אור בזווית של 90 מעלות. פילמור של FtsZBs (A) ו-FtsZEc (B) ב-50 מ"מ KCl ב-pH 7.5, pH 6.8, pH 6.5. פילמור של FtsZBs (C) ו-FtsZEc (D) ב-300 מ"מ KCl ב-pH 7.5, pH 6.8 ו-pH 6.5. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

figure-results-4
איור 4. מבנים של פולימרים FtsZBs ו-FtsZEc המודגמים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים. (א-ל) תמונות של 12 μM FtsZBs (A-C ו-G-I) ו-FtsZ Ec (D-F) ו-(J-L) מפולימרים עם 2 mM GTP. (א-ג) FtsZBs במאגר עם 50 מ"מ KCl ו-pH 7.5, 6.8 ו-6.5 בהתאמה. (ד-ו) FtsZEc במאגר עם 50 מ"מ KCl ו-pH 7.5, 6.8 ו-6.5 בהתאמה. (ג-י) FtsZBs במאגר עם 300 מ"מ KCl ו-pH 7.5, 6.8 ו-6.5 בהתאמה. (י-ל) FtsZEc במאגר עם 300 מ"מ KCl ו-pH 7.5, 6.8 ו-6.5 בהתאמה. סרגל קנה מידה: 100 ננומטר. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

figure-results-5
איור 5. הידרוליזה של GTP במהלך פילמור FtsZ ב-6 חוצצים שונים. בכל הניסויים נעשה שימוש ב-2 מ"מ GTP. כדגימת ביקורת ללא MgClנעשה שימוש ב-2. הפעילות של FtsZ ללא MgCl2 הופחתה מהפעילות של FtsZ בנוכחות MgCl2. משמאל: פעילות GTPase של FtsZ ב-50 מ"מ KCl, מימין: פעילות GTPase של FtsZ ב-300 מ"מ KCl. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים סט של שיטות המאפשרות ניתוח מהיר של פעילות FtsZ והאינטראקציה שלה עם חלבונים אחרים. פיזור אור, שקיעה ומבחני GTPase כמו גם מיקרוסקופ אלקטרונים היו בשימוש נרחב לחקר פילמור FtsZ. ביצענו כמה שיפורים בפרוטוקולים הקיימים, הראינו את ההשפעה של תנאים שונים על הרכבת FtsZ, ואנו מציעים בקרות שיש לכלול במחקרי FtsZ.

אנו מציגים צנטריפוגה במהירות נמוכה כדי להבחין בין מבנים גדולים שנוצרו על ידי הקשר בין FtsZ וחלבוני האינטראקציה שלו מפולימרים FtsZ. שיטה זו מציגה שני יתרונות על פני מבחן השיקוע הסטנדרטי. ראשית, לא נוצר רקע על ידי פולימרי FtsZ בשבר הגלולה מכיוון שהם אינם מסובבים כלפי מטה ב-24,600 x גרם. שנית, ניתן לחשב את כמות ה-FtsZ הקיימת במבנה שנוצר עם חלבון מקיים אינטראקציה מהג'ל. שני שלבים קריטיים בשיטה זו הם זמן הדגירה וריכוז ה-GTP. חשוב לצנטריפוגה את מבנה החלבון הגדול כשהוא הושלם, אך לפני שהוא מתפרק כאשר כל ה-GTP עובר הידרוליזה. הבקרה הטובה ביותר למחקר זה היא פילמור של FtsZ עם תמ"ג. יש מגבלה פוטנציאלית אחת של הבדיקה. FtsZ יוצר קומפלקס יציב עם SepF, שניתן לסובב בקלות ב-24,600 x גרם. אם מתבצעת שקיעה עם מפעיל אחר או תרופה המאגדת פולימרים FtsZ, ייתכן שיהיה צורך להתאים את הבדיקה. ניתן לעשות זאת על ידי שינוי זמן הדגירה, או הגדלת מהירות הצנטריפוגה.

הכנה נכונה של הדגימה היא החשובה ביותר לניסויי פיזור אור. יש לנקות חלבונים מראש על ידי סיבוב ויש לסנן את כל המאגרים לפני השימוש. אם קיימים אגרגטים כלשהם בדגימה, הם ישבשו אות יציב המתקבל מפולימרים FtsZ. לניתוח מבני FtsZ על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים, הכנת רשת היא הצעד העיקרי. זמן הדגירה של הדגימה על הרשת ישפיע על ייצור פולימרים דחוסים פחות או יותר. עבור צרורות של FtsZBs, זמן הדגירה חייב להיות קצר יותר מאשר עבור FtsZEc ו-FtsZBs בריכוז KCl גבוה. השתמשנו בריכוז של 12 מיקרומטר עבור כל דגימה כדי שנוכל להשוות את התוצאות. עם זאת, עבור FtsZBs ב-50 מ"מ KCl יש להשתמש בריכוז FtsZ נמוך יותר, מכיוון ש-12 מיקרומטר הביא לרוויה מלאה של הרשת. זה הופך את הפולימרים לדחוסים מאוד וקשים לזיהוי. עדיף לזהות פולימרים פחות דחוסים ב- EM.

בדיקת GTPase היא הניסוי היחיד המשמש לחקר הפעילות ולא המבנים של FtsZ. Mg2+ נחוץ לתחלופת GTP בפולימרים FtsZ. לפיכך, בהיעדר Mg2+, FtsZ אינו מבצע הידרוליזה של GTP. לכן, דגימה ללא Mg2+ היא הבקרה הנכונה בבדיקה זו, אך קטיונים של Mg קיימים במאגר האחסון של FtsZ. ניתן להסיר אותם על ידי תוספת של 1 מ"מ EDTA לדגימת הבקרה. השלב הקריטי בבדיקה זו הוא זמן הדגירה. חשוב להפסיק את פעילות ה-FtsZ לאחר זמן נתון. זה מושג על ידי העברת דגימת ה-FtsZ לתמיסה ירוקה מלכיט בצלחת של 96 בארות. עם זאת, התפתחות הצבע הירוק של המלכיט היא תהליך מתמשך. לפיכך, יש לבצע את המדידות בו זמנית עבור כל דגימה. באמצעות פרוטוקול תוספת GTP מתוכנן היטב עם מדידות שנלקחו כל 30 שניות זו מזו בסדר קבוע, ניתן לקבל את אותו זמן דגירה וטיפול בדגימה עבור כל נקודת זמן. שלב קריטי נוסף הוא בחירת ריכוז החלבון לניסוי. בניסוי השתמשנו בשני ריכוזים שונים עבור FtsZEc ו-FtsZBs. הידרוליזה של GTP מהירה בהרבה עבור FtsZEc בהשוואה ל-FtsZBs. פעילות ה-GTPase של FtsZEc בתנאים נבחרים וב-12 מיקרומטר היא ליניארית רק למשך 5 דקות לכל היותר ולאחר זמן זה קצב ההידרוליזה מתייצב. לפיכך, קשה לפרש נתונים מהניסוי כאשר הם מבוצעים בתנאים אלה. במקרה זה יש להשתמש ב-FtsZEc בריכוז נמוך יותר מ-FtsZBs כדי להיות מסוגל להשוות את הפעילויות של שני החלבונים. פעילות GTPase של FtsZs ממקורות שונים עשויה להשתנות. לפיכך, יש לבחור את הריכוז הנכון. הריכוז לפילמור FtsZ צריך להיות הרבה מעל הריכוז הקריטי (באופן כללי בין 2.5-10 מיקרומטר). הדינמיקה של הרכבה ופירוק של FtsZ חשובה גם היא. חלק מהחלבונים מראים פיגור משמעותי בפילמור לאחר הוספת GTP, כפי שמוצג עבור FtsZBs ב-50 מ"מ KCl. כדאי לבצע את בדיקת פיזור האור לפני בדיקת GTPase כדי להעריך את זמן ההרכבה והפירוק של פולימרי FtsZ. לאחר מכן, ניתן לבחור את זמן הדגירה וריכוז החלבון. מכיוון שהתנאים שנבחרו לפילמור FtsZ הם קריטיים, חשוב להשתמש בריכוז ה-pH וה-KCl הנכונים בכל שיטה. בעבודה זו חקרנו 9 חוצצים שונים עם pH שנע בין 6.5-7.5 וריכוזי KCl מ-0 מ' עד 300 מ"מ. שמנו לב שהמצב הטוב ביותר לניתוח FtsZs מ-B. subtilis ו-E.coli והפעילות הביולוגית שלהם הוא ב-pH הקרוב לרמה הפיזיולוגית (7.5) יחד עם ריכוז KCl גבוה. בריכוז KCl גבוה, ל-FtsZ יש פעילות GTPase גבוהה יותר ומייצר פולימרים הניתנים לזיהוי טוב יותר על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים. אישרנו גם כי ה-pH הפיזיולוגי וריכוז KCl גבוה טובים יותר לחקר האינטראקציה בין FtsZ לחלבונים רגולטוריים מאשר כל חוצץ אחר המשמש בעיקר לחקר הרכבת FtsZ. FtsZBs מראה פעילות דומה ל-FtsZEc כאשר נחקר בריכוז KCl גבוה. בנוסף, בריכוז מלח נמוך השפעת ה-pH ניכרת יותר מאשר במאגרים עם ריכוז מלח גבוה. FtsZ לפעמים משקע בעת שימוש במאגרים ללא KCl, כתוצאה מכך יש להימנע ממאגרים ללא מלח. שקיעה של פולימרים FtsZ נמוכה בעת שימוש במאגרים עם ריכוזי KCl גבוהים. זה עשוי להיות יתרון כאשר חוקרים אינטראקציות בין FtsZ לחלבונים המרכיבים חוטי FtsZ כגון SepF ו-ZapA מכיוון שקל לזהות מבנים מסדר גבוה יותר אלה באמצעות צנטריפוגה. בכל הניסויים שלנו השתמשנו ב-MgCl2 בריכוז של 10 מילימטר. הוכח כי ריכוז גבוה יחסית של Mg2+ מייצב פולימרים FtsZ ומפחית את פעילות ה-GTPase של FtsZ. בטבלה 2 מסכמים תוצאות ממחקרים שונים המתארות פילמור FtsZ ופעילות GTPase בריכוזים שונים של Mg2+ תוך שימוש בתנאי חיץ זהים אחרת 27. הריכוז הנמדד של Mg2+ ציטופלזמי חופשי הוא 0.9 מ"מ3. יש לשים לב ש-GTP יבצע כמות שווה ערך של Mg2+. לפיכך, הריכוז האופטימלי של Mg2+ לניסויי GTPase הוא בסביבות 2-2.5 מ"מ, שהוא קרוב לרמה פיזיולוגית3. עם זאת, בניסויים שלנו השתמשנו ב-MgCl2 בריכוז של 10 מ"מ כדי להשיג אות פיזור אור הניתן לזיהוי בקלות ולייצב פולימרים של FtsZ במהלך בדיקת השיקוע.

אף על פי שהחלנו את הפרוטוקולים שלנו על FtsZ מאורגניזמי המודל E. coli ו-B. subtilis, הם יכולים להיות מותאמים ל-FtsZ מכל אורגניזם אחר. יש לציין כי ה-pH הפיזיולוגי, והריכוזים של קטיונים חד-ערכיים ודו-ערכיים שונים בין אורגניזמים. לפיכך, התנאים האופטימליים לפילמור FtsZ עשויים להשתנות. הבדלים בזמן ההכפלה ובתנאי הגידול של חיידקים שונים עשויים לגרום לקינטיקה שונה של הרכבה של FtsZ ולתנאים אופטימליים של הניסויים. אולם הפרוטוקול שלנו מספק נקודת התחלה טובה לניסויים עם FtsZs מאורגניזמים אחרים. הפרוטוקולים צריכים להיות שימושיים לחקר FtsZ עם חלבונים רגולטוריים או לחקר ההשפעות של תרכובות ותרופות קטנות על FtsZ.

מקורפילמור [% מ-FtsZ משוקע]GTPase [Pi/FtsZ/min]ריכוז מ"ג2+ [מ"מ]ריכוז FtsZ [μM]הפניות
FtsZEC~ 28%~ 2.11012עבודה זו
~ 50%~ 2.41012.527
~ 43%~ 3.5512.527
~ 27%~ 4.62.512.527
נ.ד~ 5.42.5526
FtsZBs~ 30%~ 0.812עבודה זו
~ 52% (עם דקסטרן DEAE)~ 0.5101011
נ.ד~ 2.252.5526

טבלה 2. השפעה על Mg2+ על פילמור FtsZ ו-GTPase. תוצאות מעבודה זו בהשוואה לנתונים שפורסמו. כל הניסויים בוצעו ב-50 מ"מ MES/NaOH, pH=6.5, 50 מ"מ KCl.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העבודה במעבדה שלנו ממומנת על ידי מענק VIDI מהארגון ההולנדי למחקר מדעי (ל-DJS). אנו מודים למארק סטיוארט ולמחלקה למיקרוסקופיה אלקטרונית באוניברסיטה שלנו, על הסיוע והגישה למיקרוסקופ אלקטרוני השידור.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
GTPRoche10106399001חלק 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7
צינורות פוליקרבונט עבי דופןבקמן קולטר343776חלק 2
אופטימה MAX-XP אולטרה-צנטריפוגהבקמן קולטר393315 חלק 2, 3
צינור פוליאלומר עם כובע הצמדהבקמן קולטר357448חלק 3
חבילה ביולוגית AIDA, 1D, 2D,FL Raytest Isotopenmessgerä te GmbH15000001חלק 4
מנתח תמונות זוהר LAS-4000Fujifilmחלק 4
ספקטרומטר תרמו-ספקטרוני AMINCO-Bowman ספקטרומטר זוהרמכשיריםחלק 5
תא פלואורסצנטיHellma Analytics105-250-15-40חלק 5
ריבוע 400 רשת, נחושת, 100/בקבוקוןמיקרוסקופ אלקטרונים מדעיG400-Cuחלק 6
מיקרוסקופ אלקטרונים CM120 הפועל ב-120 קילו וולטפיליפסחלק 6
96 מ"ל x 0.2 מ"ל צלחתBIOplasticsB70501חלק 7
ערכת בדיקת פוספט ירוק מלכיטמערכת בדיקה ביולוגיתPOMG-25Hחלק 7
PowerWave HT ספקטרופוטומטר מיקרופלייטBioTekחלק 7
ספקטרוניים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Haydon, D. J., Stokes, N. R., et al. An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcal activity. Science. 321 (5896), 1673-1675 (2008).
  2. Adams, D. W., Errington, J. Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring. Nat. Rev. Microbiol. 7 (9), 642-653 (2009).
  3. Erickson, H. P., Anderson, D. E., Osawa, M. FtsZ in bacterial cytokinesis: cytoskeleton and force generator all in one. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (4), 504-528 (2010).
  4. Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division. EMBO J. 26 (22), 4694-4708 (2007).
  5. Król, E., van Kessel, S. P., van Bezouwen, L. S., Kumar, N., Boekema, E. J., Scheffers, D. J. Bacillus subtilis SepF binds to the C-terminus of FtsZ. PLoS One. 7 (8), e43293(2012).
  6. Singh, J. K., Makde, R. D., Kumar, V., Panda, D. SepF increases the assembly and bundling of FtsZ polymers and stabilizes FtsZ protofilaments by binding along its length. J. Biol. Chem. 283 (45), 31116-31124 (2008).
  7. Gündoğdu, M. E., Kawai, Y., et al. Large ring polymers align FtsZ polymers for normal septum formation. EMBO J. 30 (3), 617-626 (2011).
  8. Pacheco-Gomez, R., Roper, D. I., Dafforn, T. R., Rodger, A. The pH dependence of polymerization and bundling by the essential bacterial cytoskeletal protein FtsZ. PLoS One. 6 (6), e19369(2011).
  9. Mendieta, J., Rico, A. I., Lopez-Vinas, E., Vicente, M., Mingorance, J., Gomez-Puertas, P. Structural and functional model for ionic (K(+)/Na(+)) and pH dependence of GTPase activity and polymerization of FtsZ, the prokaryotic ortholog of tubulin. J. Mol. Biol. 390 (1), 17-25 (2009).
  10. Tadros, M., Gonzalez, J. M., Rivas, G., Vicente, M., Mingorance, J. Activation of the Escherichia coli cell division protein FtsZ by a low-affinity interaction with monovalent cations. FEBS Lett. 580 (20), 4941-4946 (2006).
  11. Scheffers, D. J. The effect of MinC on FtsZ polymerization is pH dependent and can be counteracted by ZapA. FEBS Lett. 582 (17), 2601-2608 (2008).
  12. Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. Analysis of FtsZ assembly by light scattering and determination of the role of divalent metal cations. J. Bacteriol. 181 (3), 823-832 (1999).
  13. Chen, Y., Erickson, H. P. Rapid in vitro assembly dynamics and subunit turnover of FtsZ demonstrated by fluorescence resonance energy transfer. J. Biol. Chem. 280 (23), 22549-22554 (2005).
  14. Hou, S., Wieczorek, S. A., et al. Characterization of Caulobacter crescentus FtsZ protein using dynamic light scattering. J. Biol. Chem. 287 (28), 23878-23886 (2012).
  15. Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. Dynamic assembly of FtsZ regulated by GTP hydrolysis. EMBO J. 17 (2), 462-469 (1998).
  16. Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate. Anal. Biochem. 100 (1), 95-97 (1979).
  17. Ray, S., Kumar, A., Panda, D. GTP regulates the interaction between MciZ and FtsZ: a possible role of MciZ in bacterial cell division. Biochemistry. 52 (2), 392-401 (2013).
  18. Rivas, G., Lopez, A., et al. Magnesium-induced linear self-association of the FtsZ bacterial cell division protein monomer. The primary steps for FtsZ assembly. J. Biol. Chem. 275 (16), 11740-11749 (2000).
  19. Oliva, M. A., Cordell, S. C., Lowe, J. Structural insights into FtsZ protofilament formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (12), 1243-1250 (2004).
  20. Lowe, J., Amos, L. A. Crystal structure of the bacterial cell-division protein FtsZ. Nature. 391 (6663), 203-206 (1998).
  21. Cordell, S. C., Robinson, E. J., Lowe, J. Crystal structure of the SOS cell division inhibitor SulA and in complex with FtsZ. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (13), 7889-7894 (2003).
  22. Chen, Y., Anderson, D. E., Rajagopalan, M., Erickson, H. P. Assembly dynamics of Mycobacterium tuberculosis FtsZ. J. Biol. Chem. 282 (38), 27736-27743 (2007).
  23. White, E. L., Ross, L. J., Reynolds, R. C., Seitz, L. E., Moore, G. D., Borhani, D. W. Slow polymerization of Mycobacterium tuberculosis FtsZ. J. Bacteriol. 182 (14), 4028-4034 (2000).
  24. Oliva, M. A., Trambaiolo, D., Lowe, J. Structural insights into the conformational variability of FtsZ. J. Mol. Biol. 373 (5), 1229-1242 (2007).
  25. Thanbichler, M., Shapiro, L. M. ipZ. a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter. Cell. 126 (1), 147-162 (2006).
  26. Buske, P. J., Levin, P. A. Extreme C terminus of bacterial cytoskeletal protein FtsZ plays fundamental role in assembly independent of modulatory proteins. J. Biol. Chem. 287 (14), 10945-10957 (2012).
  27. Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. Analysis of FtsZ assembly by light scattering and determination of the role of divalent metal cations. J. Bacteriol. 181 (3), 823-832 (1999).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

FtsZ PolymerizationLight Scattering AssaySedimentation AssayGTP Hydrolysis AssayElectron MicroscopyBuffer ConditionsPotassium ChlorideEscherichia coliBacillus subtilisProtein Interaction

מאמרים קשורים