מאמר שיטה

FtsZ פלמור מבחני: פרוטוקולים ושיקולים פשוטים

15.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50844

⸱

16 בנובמבר 2013

 , 
1Department of Molecular Microbiology, Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute, University of Groningen

במאמר זה

סיכום

פילמור של FtsZ חיוני לחלוקת תאי חיידקים. בדוח זה, אנו מפרטים פרוטוקולים פשוטים לניטור פעילות פילמור FtsZ ודנים בהשפעת הרכב המאגר. ניתן להשתמש בפרוטוקולים כדי לחקור את האינטראקציה של FtsZ עם חלבונים רגולטוריים או תרופות אנטיבקטריאליות המשפיעות על פילמור FtsZ.

תקציר

במהלך חלוקת תא חיידק, FtsZ החלבון החיוני מרכיב באמצע של התא כדי ליצור את מה שנקרא Z-הטבעת. FtsZ polymerizes לחוטים ארוכים בנוכחות GTP במבחנה, ופילמור מוסדר על ידי מספר חלבוני אבזר. פילמור FtsZ נחקר בהרחבה במבחנה באמצעות שיטות בסיסיות כוללים פיזור אור, שקיעה, מבחני הידרוליזה GTP ומיקרוסקופ אלקטרונים. שני מאפייני השפעת תנאי חיץ פילמור של FtsZ, ואת היכולת של FtsZ לאינטראקציה עם חלבונים רגולטוריים. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים ללימודי פילמור FtsZ ולאמת את התנאים ושולטים באמצעות Escherichia coli וsubtilis Bacillus FtsZ חלבונים דגם. Assay שקיעת מהירות נמוכה הוא הציג שמאפשר הלימוד של האינטראקציה של FtsZ עם חלבונים שחבילה או tubulate פולימרים FtsZ. פרוטוקול assay GTPase השתפר מתואר המאפשר בדיקותשל הידרוליזה GTP לאורך זמן באמצעות תנאים שונים בהתקנת צלחת 96 היטב, עם זמני דגירה סטנדרטיים הלבטל וריאציה בהתפתחות צבע בתגובה לגילוי פוספט. הכנת דגימות ללימודי פיזור אור ומיקרוסקופ אלקטרונים מתוארת. כמה מאגרים המשמשים להקמת ה-pH המתאים חיץ וריכוז מלח ללימודי פילמור FtsZ. ריכוז גבוה של KCl הוא הטוב ביותר עבור רוב הניסויים. השיטות שלנו מספקות נקודה מוצא למבחנת האפיון בשל FtsZ, לא רק מE. coli ו-B subtilis אבל מכל חיידק אחר. ככזה, השיטות יכולות לשמש למחקרים על האינטראקציה של FtsZ עם חלבונים רגולטוריים או הבדיקה של תרופות אנטיבקטריאליות אשר עשוי להשפיע פילמור FtsZ.

מבוא

החלבון החיידקי החיוני FtsZ הוא החלבון המאופיין בצורה הטובה ביותר של מנגנון חלוקת תאי החיידקים. FtsZ הוא ההומולוג הפרוקריוטי של טובולין ומתפלמר במבחנה באופן תלוי GTP. FtsZ הוא יעד אטרקטיבי מאוד לאנטיביוטיקה חדשה בשל אופיו השמור והייחודיות שלו לחיידקים1,2. בתחילת חלוקת התא, FtsZ יוצר טבעת ציטוקינטית באמצע התא, המשמשת כפיגום להרכבה של חלבוני חלוקת תאים אחרים. היווצרות טבעת ה- Z חיונית ללוקליזציה נכונה של מישור החלוקה. דינמיקת ההרכבה של FtsZ מווסתת על ידי מספר חלבונים נלווים, כגון (תלוי במין החיידקים) MinC, SepF, ZapA, UgtP ו-EzrA2. פילמור FtsZ נחקר באופן אינטנסיבי במבחנה ותוארו מבנים רבים ושונים כולל פרוטופילמנטים ישרים, פרוטופילמנטים מעוקלים, יריעות חוטים, צרורות חוטים וצינורות חוטים בהתאם למאגר ההרכבה, הנוקלאוטיד וחלבונים נוספים הכלולים בבדיקה3. הארכיטקטורה של פרוטופילמנטים של FtsZ in vivo עדיין לא מובנת במלואה, אם כי ניסויי קריוטומוגרפיה אלקטרונית ב-Caulobacter crescentus מצביעים על כך שטבעת ה-Z מורכבת מפרופילמנטים בודדים קצרים יחסית ולא רציפים ללא צרור נרחב4.

במבחנה, תכונות הפילמור של FtsZ והאינטראקציה של FtsZ עם חלבונים רגולטוריים רגישות להרכב מאגר התגובה. לדוגמה, תיארנו לאחרונה את אתר האינטראקציה עבור SepF במסוף FtsZ C והראינו כי חיתוך FtsZBs∆16 C-terminal כבר לא נקשר ל-SepF5. במחקר קודם על האינטראקציה בין SepF-FtsZBs, קטום דומה של FtsZBs∆16 עדיין משקע יחד עם SepF, מה שהציע ש-SepF נקשר לאתר משני ב-FtsZ6. ההבדל בין מחקרים אלה היה הרכב חוצצי התגובה - ב-pH 7.5 לא הייתה קו-סקצנציה של SepF עם קטום FtsZ, בעוד שב-pH 6.5 הייתה קו-סקציה. Gündoğdu et al. ציין כי SepF אינו מתפקד ומשקע ב-pH 6.57, מה שמראה כי הקו-שקיעה שנצפתה ב-pH 6.5 עשויה להיגרם על ידי משקעים של SepF ולא על ידי אינטראקציה עם קטום FtsZBs∆16 C-terminal. השפעת ריכוז ה-pH וה-KCl על הפילמור של FtsZ נבדקה בעבר. פולימרים של E. coli FtsZ (FtsZEc) ב-pH 6.5 ארוכים ושופעים יותר מאלה שנוצרו ב-pHניטרלי 8,9. טדרוס ואחרים. חקרו את הפילמור של FtsZEc בנוכחות קטיונים חד-ערכיים, וציינו כי קשירת K+ קשורה לפילמור FtsZEc והיא חיונית לפעילות FtsZ10. ה-pH הוא קריטי יותר כאשר נחקרת האינטראקציה של FtsZ עם חלבונים אחרים, כפי שמוצג בדוגמה הקודמת של SepF, ותלות ה-pH של ההשפעה המעכבת של MinC על FtsZ11. מכיוון שגם pH וגם ריכוז המלח עשויים להשפיע על האינטראקציה של FtsZ עם חלבונים אחרים, חשוב לבחור את התנאים והבקרות הנכונים למחקרי הפילמור של FtsZ.

כאן אנו מתארים פרוטוקולים לחקר פילמור FtsZ ופעילות GTPase על ידי פיזור אור, מיקרוסקופ אלקטרונים, שקיעה ומבחני GTPase. פיזור אור בזווית ישרה הוא שיטה סטנדרטית לחקר פילמור FtsZ בזמן אמת12. הכנסנו כמה שיפורים לבדיקת המשקעים ו-GTPase. אנו מציגים בפירוט כיצד להכין דגימות לפיזור אור ומיקרוסקופ אלקטרונים. נבדקו מספר חוצצים המשמשים בספרות לחקר פילמור FtsZ ואנו מתארים את התנאים הטובים ביותר לכל ניסוי. אנו גם מראים אילו בקרות יש להציג כדי להשיג את הנתונים הטובים ביותר.

שיטות אלו מאפשרות מחקר מהיר של פילמור, פעילות ואינטראקציה עם חלבונים אחרים באמצעות שיטות וציוד פשוטים הזמינים ברוב המעבדות. קיימות שיטות מתוחכמות יותר לחקר פילמור FtsZ אך לעתים קרובות דורשות גישה לציוד מיוחד יותר, ו/או שינוי של FtsZ עם תוויות פלואורסצנטיות8,13,14. השיטות הפשוטות המתוארות במאמר זה מודגמות באמצעות FtsZ מ-B. subtilis ו-E. coli, האורגניזמים הנפוצים ביותר במודל Gram+ ו-Gram-. ניתן להתאים את הפרוטוקולים לכל חלבון FtsZ אחר. בהתבסס על בדיקות ראשוניות עם FtsZs חדשים אלה, ייתכן שיהיה צורך בשינויים קלים לגבי זמן, חיץ או טמפרטורת הדגירה לתוצאה אופטימלית. הניסויים המתוארים כאן אמורים לסייע במציאת התנאים האופטימליים הללו.

פרוטוקול

חלבוני FtsZ לא מתויגים טוהרו כמתואר קודם לכן11,15, עברו דיאליזה כנגד 20 מ"מ Tris/HCl (pH 7.9), 50 מ"מ KCl, 1 מ"מ EGTA, 2.5 מ"מ MgAc ו-10% גליצרול ואוחסנו ב-80 מעלות צלזיוס. בתנאים אלה ניתן לאחסן את החלבון מעל שנתיים ללא אובדן משמעותי של פעילות. יש לאחסן את החלבון ב-100 מיקרוליטר כדי למנוע הפשרה והקפאה של הדגימה. לאחר ההפשרה, ניתן לשמור את הדגימה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שבוע לכל היותר. FtsZ מסיס בריכוזים גבוהים וניתן לאחסן אותו במינון של 7-10 מ"ג/מ"ל. חשוב לשמור על ריכוז חלבון גבוה כדי למנוע השפעות לא רצויות של רכיבי חיץ אחסון בניסויים מאוחרים יותר. לפיכך, ריכוז האחסון אמור לאפשר דילול של FtsZ של לפחות פי 10 כדי להוריד את ריכוז הגליצרול מתחת ל-1% ולמזער את ריכוז המרכיבים האחרים של מאגר הדיאליזה בתערובת התגובה. פילמור FtsZ עשוי להיות מושפע גם מנוכחות של ריכוזי נתרן9 או אימידזול גבוהים ולכן יש להסיר רכיבים אלה ממאגר הפילמור. SepF טוהר כמתואר7 ואוחסנו במאגר פליטה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. נהלים חלופיים שפורסמו לטיהור FtsZ מ-E. coli ו-B. subtilis וכן הפניות לנהלים לטיהור FtsZ ממקורות שונים מסוכמים בטבלה 1 (ראה סעיף תוצאות מייצגות).

1. הכנת מדגם

  1. הכן מאגרי פילמור: <גבול טבלה="1"> 1 50 מ"מ Hepes / NaOH, pH 7.5 2 25 מ"מ צנרת/NaOH, pH 6.8 3 50 מ"מ MES/NaOH, pH 6.5 4 50 מ"מ Hepes/NaOH, pH 7.5; 50 מ"מ KCl 5 25 מ"מ צנרת/NaOH, pH 6.8; 50 מ"מ KCl 6 50 מ"מ MES/NaOH, pH 6.5; 50 מ"מ KCl 7 50 מ"מ Hepes/NaOH, pH 7.5; 300 מ"מ KCl 8 25 מ"מ צנרת/NaOH, pH 6.8; 300 מ"מ KCl 9 50 מ"מ MES/NaOH, pH 6.5; 300 מ"מ KCl
  2. מסנן לעקר את כל המאגרים באמצעות מסנן ממברנה של 22 מיקרומטר.
  3. הכן תמיסות מלאי של 100 מ"מ GTP, GDP ו-MgCl2 בכל מאגר פילמור מ-(1).
  4. קליר את החלבונים על ידי סיבוב ב-100,000 x g במשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס עבור כל הניסויים.

2. בדיקת שקיעה FtsZ

  1. הכן את תערובת התגובה על ידי הוספת MgCl2 ו-FtsZ לאחד ממאגרי הפילמור (ראה נקודת הכנת דגימה 1) בצינורות התואמים לצנטריפוגה במהירות גבוהה. הנפח הכולל צריך להיות 49 מיקרוליטר, כאשר MgCl2 ב-10 מ"מ ו-FtsZ ב-12 מיקרומטר בנפח סופי של 50 מיקרוליטר.
  2. הנח את הצינור באינקובטור עם פונקציית ניעור, דגר למשך 2 דקות ב-30 מעלות צלזיוס ב-300 סל"ד (לחלופין ניתן להחליק את הדגימה בעדינות ומיקרו-פוזה קצרה ולאחר מכן לחמם מראש ב-30 מעלות צלזיוס).
  3. התחל פילמור על ידי הוספת 1 מיקרוליטר של תמיסת מלאי GTP או GDP באותו מאגר ששימש בניסוי (ריכוז סופי של 2 מ"מ). דגירה למשך 10 או 2 דקות (עבור חוצצים עם 50 מ"מ KCl ו-300 מ"מ KCl, בהתאמה) ב-30 מעלות צלזיוס ב-300 סל"ד (או בחממה עם פונקציית טלטול).
  4. העבירו את הצינורות לרוטור אולטרה-צנטריפוגה וסובבו כלפי מטה למשך 10 דקות ב-350,000 x g (89,700 סל"ד עבור רוטור TLA 120.1) ב-25 מעלות צלזיוס.
  5. לאחר הסיבוב, הסר בזהירות את הצינורות מהרוטור והעביר מיד את הסופרנטנט לצינור נקי. הכן דגימות עבור SDS-PAGE על ידי הוספת 20 מיקרוליטר של סופרנטנט ל-20 מיקרוליטר של מאגר דגימה פי 2. מרתיחים 10 דקות בחום של 98 מעלות צלזיוס.
  6. הוסף 50 מיקרוליטר של מאגר דגימה פי 2 לשבר הגלולה המכיל פולימרים FtsZ. הנח את צינור האולטרה-צנטריפוגה בשפופרת של 2 מ"ל. השעו מחדש את הגלולה על ידי רתיחה למשך 10 דקות בטמפרטורה של 98 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן הוסיפו 50 מיקרוליטר של H2O דה-מינרלי כדי להפוך את הדגימה לאותו דילול פי 2 כמו דגימת העל.
  7. הפוך את צינור האולטרה-צנטריפוגה הפוך בצינור 2 מ"ל וסובב כלפי מטה במשך 5 דקות בצנטריפוגה אפנדורף ב-18,000 x גרם. הסר את צינור האולטרה-צנטריפוגה מצינור ה-2 מ"ל.
  8. טען 10 מיקרוליטר מכל דגימת סופרנטנט וגלולה זו לצד זו על ג'ל SDS-PAGE 10%. הפעל את הג'ל ב -150 וולט.
  9. צבעו את הג'ל עם Coomassie Brilliant Blue G-250 ושמרו לכימות.

3. בדיקת שקיעה FtsZ בסיבוב איטי

  1. הכן תמיסת פילמור כמו בשלב 2, הוסף SepF ו/או FtsZ (ריכוז סופי 12 מיקרומטר). ניתן לבצע ניסויים אלה בשפופרות חד פעמיות של בקמן בנפח 1.5 מ"ל בשילוב עם רוטור TLA-55.
  2. הנח את הצינור באינקובטור עם פונקציית ניעור ודגר למשך 2 דקות ב-30 מעלות צלזיוס ב-300 סל"ד.
  3. התחל פילמור על ידי הוספת 1 מיקרוליטר של GTP או תמ"ג מתמיסת מלאי (ריכוז סופי 2 מ"מ), דגירה למשך 20 דקות ב-30 מעלות צלזיוס ב-300 סל"ד.
  4. הסתובב למשך 15 דקות ב-24,600 x g (20,000 סל"ד עבור רוטור TLA 55) ב-25 מעלות צלזיוס.
  5. הסר את הסופרנטנט והעביר לצינור נקי, קח 20 מיקרוליטר והעביר ל-20 מיקרוליטר של מאגר דגימה פי 2. מרתיחים 10 דקות בחום של 98 מעלות צלזיוס.
  6. הוסף 50 מיקרוליטר של מאגר דגימה פי 2 לשבר גלולה המכיל פולימרים והשהה מחדש על ידי רתיחה למשך 10 דקות ב-98 מעלות צלזיוס, הוסף 50 מיקרוליטר של H2O דה-מינרלי.
  7. טען 10 מיקרוליטר מכל דגימת סופרנטנט וגלולה זו לצד זו על ג'ל SDS-PAGE 10%. הפעל את הג'ל ב -150 וולט.
  8. צבעו את הג'ל עם Coomassie Brilliant Blue G-250 ושמרו לכימות.

4. כימות מבחני המשקעים של FtsZ

  1. צלם תמונה של הג'ל המוכתם של Coomassie באמצעות מערכת תיעוד ג'ל (למשל LAS-4000, Fujifilm).
  2. פתח את תמונת הג'ל בתוכנית המתאימה לניתוח צפיפות של ג'לים (למשל תוכנית מנתח תמונות AIDA (Raytest)) ותאר ניתוח בתוכנית זו להלן.
  3. לחץ על כפתור "הערכה" בסרגל הכלים.
  4. בחר את "צפיפות דו-ממדית" מהרשימה ולחץ על אישור.
  5. בתפריט הראשי, לחץ על "הערכה" ובחר את הערך "קביעת אזור".
  6. כדי ליצור אזור על הג'ל, לחץ על הסמל של הכלי Auto-contour בארגז הכלים Region Setting.
  7. לחץ בפינה השמאלית העליונה של רצועת החלבון בג'ל, החזק את לחצן העכבר לחוץ וגרור אותו לקצה הימני התחתון הרצוי של הרצועה ושחרר את לחצן העכבר.
  8. סמן כל פס FtsZ/SepF באותו אופן.
  9. ניתן למצוא את כל המידע אודות הערכת האזורים שהוקצו בדוח האזור. כדי לקבל את דוח האזור, לחץ על הלחצן "הצג דוח אזור" בארגז הכלים של קביעת אזור.
  10. כדי לייצא את הדוח, בתפריט הראשי, לחץ על קובץ ובחר ערך "ייצוא à דוח אזור דו-ממדי".
  11. בדוח האזור יש למצוא את העוצמה של כל אזור שנוצר. חשב את אחוז החלבון (FtsZ, חלבון רגולטורי) בגלולה באמצעות ערכי העוצמה מהדוח.

5. פיזור אור 90°

  1. הפעל ספקטרומטר פלואורסצנטי (למשל AMINCO-Bowman Series 2), אפשר למנורה להתחמם במשך מספר דקות כדי למנוע תנודות תרמיות והפעל אמבט מים במחזור כדי לשמור על טמפרטורת תא הקובט על 30 מעלות צלזיוס.
  2. הגדירו את פרמטרי ההפעלה של הספקטרומטר: גלאי מתח גבוה 300 וולט, אורך גל פליטה ועירור: 350 ננומטר, רוחב חריץ: 4 ננומטר. שימו לב שספקטרומטרים רבים מכוונים אוטומטית את האות בתחילת הניסוי לאחוז מסוים (למשל 60%) מהמקסימום. זה גורם לאות פיזור לצאת מהטווח ברגע שמוסיפים GTP כדי לפלמר את FtsZ. זה חכם לקבוע תחילה את הגברת האות הנכונה - גלאי מתח גבוה - לפילמור מקסימלי לפני תחילת סדרת ניסויים.
  3. תכנת פרוטוקול רכישת נתונים. בחר רכישה מבוססת זמן, עם משך של 3,600 שניות.
  4. נקו בזהירות קובטה פלואורסצנטית עם מים ואתנול, במידת הצורך - סוניקט באמבט מים בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. בפרוטוקול זה נעשה שימוש בקובטות באורך נתיב של 1 ס"מ ונפח של 200 מיקרוליטר ואוחסנו בתמיסת אחסון (0.5-1% Hellmanex). כחלופה, ניתן להשתמש בקובטות פלסטיק תואמות UV לשימוש חד פעמי (UVette, Eppendorf).
  5. הכן 294 מיקרוליטר של תערובת מאסטר של מאגר הפילמור (ראה נקודת הכנת דגימה 1) עם 10 מ"מ MgCl2 ו-12 מיקרומטר FtsZ כריכוז סופי המחושב עבור 300 מיקרוליטר ומערבולת.
  6. העבירו 196 מיקרוליטר ממאגר הפילמור לקובט והניחו אותו בספקטרומטר. יש לדגור למשך 2 דקות בחום של 30 מעלות צלזיוס.
  7. התחל את רכישת הנתונים והמתן 90 שניות כדי לוודא שהאות יציב.
  8. הוסף 4 מיקרוליטר של 100 מ"מ GTP או תמ"ג (ריכוז סופי: 2 מ"מ) כדי להשיג נפח תגובה סופי של 200 מיקרוליטר, פיפטה למעלה ולמטה עם פיפטה בנפח גדול יותר כדי לערבב ולחדש את הרכישה.

6. מיקרוסקופ אלקטרונים שידור

  1. הכן דגימות כמו לבדיקת השקיעה של FtsZ (ניתן להפחית את הנפח ל-10 מיקרוליטר נפח סופי כדי לחסוך בחומר).
  2. לאחר זמן הדגירה, יש למרוח 2 מיקרוליטר מהדגימה על רשת נחושת מצופה פחמן 400 רשת זוהרת, לדגור למשך 15 שניות.
  3. כתם את הרשת יבשה על ידי נגיעה או גרירה עדינה של הרשת במקביל או בניצב לפיסת נייר פילטר.
  4. צבעו את הרשת באמצעות 4 מיקרוליטר של תמיסת אורניל-אצטט 2%. כתם את הרשת יבשה כמתואר בשלב 6.3.
  5. צפה ברשת במיקרוסקופ אלקטרונים CM120 של פיליפס הפועל ב-120 קילו וולט בהגדלה של פי 39,200.

7. בדיקת הידרוליזה GTP

הגדרת הניסוי מתוכננת בצורה כזו שהידרוליזה GTP של FtsZ נעצרת לאחר זמני תגובה שונים על ידי ערבוב התגובה עם ירוק מלכיט. באופן זה, זמן התפתחות הצבע של ירוק מלכיט זהה לכל דגימה.

  1. הכן 1.5 מ"ל 2 מ"מ GTP באחד ממאגרי הפילמור (ראה הכנת מדגם, נקודה 1).
    הכן דילול סטנדרטי של פוספט 0-40 מיקרומטר במאגר פילמור, והכן מגיב עבודה ירוק מלכיט כמתואר בערכת POMG-25H (בדיקות ביו). לחלופין, ניתן להכין ריאגנטים עובדים בתוך הבית על פי פרוטוקולים שתוארו על ידי Lanzetta et al.16
  2. הכן תערובות מאסטר בנפח כולל 360 מיקרוליטר: <גבול טבלה="1"> אני 24 μM FtsZBs, 20 mM MgCl2, חוצץ פילמור השני 12 μM FtsZEc, 20 mM MgCl2, חוצץ פילמור III (בקרה 1) 24 μM FtsZBs, 2 mM EDTA, חוצץ פילמור IV (בקרה 2) 12 μM FtsZEc, 2 mM EDTA, חוצץ פילמור
  3. פיפטה 20 מיקרוליטר של תערובות המאסטר, תקני פוספט של 100 מיקרוליטר ו-180 מיקרוליטר של 2 מ"מ GTP בצלחת qPCR של 96 בארות בסדר הבא: <גבול טבלה="1"> א ב ג ד ה פ ז ח 1 השלישי השלישי אני אני הרביעי הרביעי השני השני 2 השלישי השלישי אני אני הרביעי הרביעי השני השני 3 השלישי השלישי אני אני הרביעי הרביעי השני השני 4 השלישי השלישי אני אני הרביעי הרביעי השני השני 5 השלישי השלישי אני אני הרביעי הרביעי השני השני 6 השלישי השלישי אני אני הרביעי הרביעי השני השני 7 השלישי השלישי אני אני הרביעי הרביעי השני השני 8 השלישי השלישי אני אני הרביעי הרביעי השני השני 9 נ.ב. נ.ב. נ.ב. נ.ב. נ.ב. נ.ב. נ.ב. נ.ב. 10 נ.ב. נ.ב. נ.ב. נ.ב. נ.ב. נ.ב. נ.ב. נ.ב. 11 12 GTP GTP GTP GTP GTP GTP GTP GTP
    PS - תקן פוספט
  4. הנח את לוחית ה-qPCR במכונת PCR כשהתוכנית מוגדרת למחזור של 40 דקות ב-30 מעלות צלזיוס.
  5. הכן 20 מיקרוליטר של מגיב עבודה ירוק מלכיט בצלחת של 96 בארות. הוסף 60 מיקרוליטר של מאגר הפילמור מהניסוי לנתיבים 1'-8'. הדגימה תדולל פי 4 בהשוואה לתקן הפוספט, אנא קחו בחשבון עובדה זו במהלך החישובים הסופיים. . . . . . . . . . . . . . . . .
    אבגדהפזח
    1'השלישיהשלישיאניאניהרביעיהרביעיהשניהשני
    2'השלישיהשלישיאניאניהרביעיהרביעיהשניהשני
    3'השלישיהשלישיאניאניהרביעיהרביעיהשניהשני
    4'השלישיהשלישיאניאניהרביעיהרביעיהשניהשני
    5'השלישיהשלישיאניאניהרביעיהרביעיהשניהשני
    6'השלישיהשלישיאניאניהרביעיהרביעיהשניהשני
    7'השלישיהשלישיאניאניהרביעיהרביעיהשניהשני
    8'השלישיהשלישיאניאניהרביעיהרביעיהשניהשני
    9'נ.בנ.בנ.בנ.בנ.בנ.בנ.בנ.ב
    10'נ.בנ.בנ.בנ.בנ.בנ.בנ.בנ.ב
  6. הוסף 20 מיקרוליטר GTP לנתיב 1, פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב, טיימר התחלה (זוהי נקודת זמן ההתחלה לתגובה של 30 דקות).
  7. לאחר 10 דקות, 30 שניות הוסף GTP לנתיב 2, פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב (תגובה של 20 דקות).
  8. לאחר 16 דקות הוסף GTP לנתיב 3, פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב (תגובה של 15 דקות).
  9. לאחר 21 דקות, 30 שניות הוסף GTP לנתיב 4, פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב (תגובה של 10 דקות).
  10. לאחר 25 דקות הוסף GTP לנתיב 5, פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב (תגובה של 7 דקות).
  11. לאחר 27 דקות, 30 שניות הוסף GTP לנתיב 6, פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב (תגובה של 5 דקות).
  12. לאחר 29 דקות הוסף GTP לנתיב 7, פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב (תגובה של 4 דקות)..
  13. לאחר 30 דקות העבירו 20 מיקרוליטר מנתיב 1 לנתיב 1', פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב (נקודת התחלה של התפתחות צבע ירוק מלכיט לתגובה של 30 דקות).
  14. לאחר 30 דקות, 30 שניות העבירו 20 מיקרוליטר מנתיב 2 ל-2', פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב (נקודת התחלה של התפתחות צבע ירוק מלכיט לתגובה של 20 דקות).
  15. חזור על השלב עבור נתיבים 3-7 כל 30 שניות.
  16. לאחר 33 דקות, 30 שניות הוסף 20 מיקרוליטר של GTP לנתיב 8, פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב ולהעביר 20 מיקרוליטר לנתיב 8', פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב (0 דקות תגובה ונקודת זמן התחלה לפיתוח צבע ירוק מלכיט לתגובה).
  17. לאחר 34 דקות הוסף 80 מיקרוליטר מנתיב 9 עד 9', פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב (נקודת זמן ההתחלה לפיתוח צבע ירוק מלכיט עבור תקן הפוספט 1).
  18. לאחר העברת 80 מיקרוליטר מנתיב 10 ל-10 דקות ו-30 שניות, פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב (נקודת הזמן ההתחלתית לפיתוח צבע ירוק מלכיט עבור תקן הפוספט 2).
  19. הסר את כל בועות האוויר מהדגימות ודגר את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 25 דקות ו-30 שניות נוספות.
  20. הנח את הצלחת בקורא צלחות 96 בארות.
  21. לאחר 60 דקות מדוד את הצלחת פי 10 כל 30 שניות באורך גל 630 ננומטר (התפתחות הצבע הירוק מלכיט היא כעת 30 דקות לתגובה הראשונה). כל מדידה מתאימה לכל נקודת זמן משלבים 7.6-7.12 ו-7.16 ויש לחשב אותה בנפרד במהלך ניתוח נתונים.
  22. חשב את הפוספט החופשי בכל דגימה באמצעות עקומת הכיול הסטנדרטית של הפוספט.
  23. שרטט את הנתונים כשחרור פוספט לאורך זמן, וחשב את פעילות ההידרוליזה של FtsZ GTP מהטווח הליניארי של העקומה.

תוצאות

ניקוי של FtsZ ממקורות חיידקיים שונים תואר בספרות ומסוכם בטבלה 1.

מקורשיטהמודיפיקציהניצול שהתקבל [mg/L של תרבית]>מקורות
B. subtilis1) שקיעה באמון סולפט/כרומטוגרפיית חילוף יוניםאין40עבודה זו, 11,15
2) כרומטוגרפיית זיקהHis-tagND17
E. coli1) שקיעה באמון סולפט/כרומטוגרפיית חילוף יוניםאין35עבודה זו, 11,15
2) שקיעה בסידן, כרומטוגרפיית חילוף יוניםאין4018
Methanococcus jannaschii1) כרומטוגרפיית זיקה בתנאים דנטורטיים/קיפול מחדש/שקיעה באמון סולפט/סינון ג'לHis-tag1.319
2) כרומטוגרפיית זיקה/ סינון ג'לHis-tagND20
Thermotoga maritimaכרומטוגרפיית חילוף יונים/סינון ג'לאין6.719
Pseudomonas aeruginosaכרומטוגרפיית זיקה/סינון ג'לStrep-tag, His-tagND21
Mycobacterium tuberculosis1) כרומטוגרפיית זיקה/חילוף יוניםאיןND22
2) כרומטוגרפיית זיקה/ סינון ג'לאין3023
Aquifex aeolicusכרומטוגרפיית זיקה/סינון ג'לHis-tag, קיטוע קצה-C (331-367)ND24
Caulobacter crescentusכרומטוגרפיית חילוף יונים/שקיעה באמון סולפט/סינון ג'לאיןND25

טבלה 1. פרוטוקולים לטיהור FtsZ המתוארים. ND: לא נקבע.

שיקוע של פולימרי FtsZ

בתחילה, השתמשנו בשתי מהירויות שונות כדי לשקע פולימרים של FtsZ. מצאנו שרק במהירות של 350,000 x g שוקעים פולימרים בודדים של FtsZEc (איור 1), בעוד שבמהירות של 190,000 x g קיימים רק צרורים של FtsZBs בפרקציית המשקע (הנתונים לא מוצגים). לפיכך, נעשה שימוש ב-350,000 x g בניסויים הבאים. אחוז ה-FtsZEc וה-FtsZBs הפולימריים דומה בריכוז של 50 mM KCl, למרות שניסויי פיזור האור חשפו אות פיזור גבוה בהרבה עבור FtsZBs. הדבר נובע מצbundles שנוצרו על ידי FtsZBs, אשר מפיצים יותר אור מאשר פולימרים בודדים של FtsZEc. לא ניתן היה להשיג כמות גבוהה של פולימרים של FtsZ בפרקציית המשקע בניסוי עם 300 mM KCl עבור FtsZEc ו-FtsZBs (איור 1). אנו מייחסים זאת לשילוב של פירוק מהיר של מבני ה-FtsZ וירידה במידת הצרוריות של הפילמנטים.

שיקוע של צינוריות FtsZ-SepF

כדי לנתח את האינטראקציה של FtsZ עם מפעילים מסוימים, ניתן לבצע בדיקות שקיעה במהירויות צנטריפוגה נמוכות יותר. במהירות זו, רק מבנים גדולים של FtsZ עשויים לשקוע, למשל, הצינורות הגדולים הנוצרים על ידי טבעים של SepF וסיבי FtsZBs5, או הצבורים הנוצרים על ידי FtsZ ו-ZapA. השתמשנו בצנטריפוגה במהירות נמוכה יותר (24,600 x g) כדי להדגים את היתכנות גישה זו עבור הצינורות הנוצרים על ידי FtsZ ו-SepF. FtsZ התאושש במשקע מעל רמות הרקע רק כאשר גם SepF וגם GTP היו נוכחים בדגימה (איור 2), ונוכחותו של SepF אינה משפיעה על פעילות ה-GTPase של FtsZ7, מה שמעיד על כך ש-FtsZ פעיל באופן מלא בנוכחות SepF. השקיעה הספציפית של SepF ו-FtsZ היא בקירוב 45% מכלל ה-SepF ו-15% מכלל ה-FtsZ (בהשוואה לחומר השוקע כאשר מתווסף GDP). דבר זה מראה כי צינורות ה-SepF-FtsZ מכילים יותר SepF מאשר FtsZ. ייתכן שהדבר נובע מכך שטבעי SepF רבים מארגנים את צינורות ה-FtsZ-SepF5,7. הסטוכיומטריה המדויקת של SepF-FtsZ בצינורות אלו אינה ידועה, אך תוצאותינו מרמזות כי קיים יותר SepF מאשר FtsZ.

תכונות הפולימריזציה והאגודה (bundling) של FtsZEc ו-FtsZBs

לאפיון יעילות הפולימריזציה של FtsZבס ו-FtsZEc בבפרוטוקולים שונים ניתחנו את שני החלבונים באמצעות 90° פיזור אור בזווית. בריכוז של 50 mM KCl, חלבון ה-FtsZבשתי (Bs) נותן אות פיזור אור הגבוה פי 20-40 מזה של FtsZEc בהתאם ל-pH של התמיס (איורים 3A ו- B) אישור של תוצאותיו של Buske ואחרים.26 העלאת ריכוז ה-KCl בבופר לא השפיעה באופן מובהק על אות פיזור האור של FtsZEc (איור 3D) אך האות של FtsZBs פחת בערך פי 80 ב-pH 7.5, בערך פי 30 ב-pH 6.8 ובערך פי 45 ב-pH 6.5 ב-300 mM KCl (איור 3C) בהשוואה לתמיסות עיכוב (buffers) עם 50 mM KCl (איור 3A). פירוק פולימרים של FtsZ מהיר יותר בריכוזי KCl גבוהים יותר עבור שני החלבונים (איור 3C ו- ד). מחקרים של Pacheco-Gómez ואחריםהוכיחו ש *E. coli* פולימריזציה ואגדגוד (bundling) של FtsZ תלויים ב-pH. מחברים אלה מצאו שבבופר עם 50 mM KCl, אות פיזור האור של פולימריזציית FtsZ היה גבוה יותר, והפירוק של FtsZ ארך זמן רב יותר ב-pH 6.0 בהשוואה ל-pH 7.0. 8תוצאות אלו אינן תואמות את הנתונים שלנו מפולימריזציה של FtsZ.Ec בריכוז של 50 mM KCl (איור 3B), אך יש לציין כי השתמשנו בשלושה באפרים שונים (HEPES, MES ו-PIPES), בעוד ש-Pacheco-Gómez ואח'השתמשו ב-MES בלבד. לכן, לא רק ה-pH, אלא גם הרכב התמיסה הבופרית (החוזק היוני) משפיע על קינטיקת הפולימרים של FtsZ בריכוז של 50 mM KCl. עם זאת, בריכוז של 300 mM KCl, לא הרכב התמיסה הבופרית ולא ה-pH השפיעו על FtsZ.Ec הרכבה באופן ניתן לזיהוי.

ניסוי פיזור אור של FtsZBs בתמיסות חוצץ ללא KCl לא היה אפשרי עקב שקיעה של החלבון בתנאים אלה. כאשר ריכוז ה-FtsZBs הופחת ל-3 µM, לא התרחשה שקיעה. עם זאת, 3 µM אינו הריכוז הפיזיולוגי של FtsZ בתא. בקיובטות פלסטיק, FtsZBs לא שקע בריכוז של 12 µM ב-pH 7.5, אך ב-pH 6.8 ו-6.5 ה-FtsZ עדיין שקע בהיעדרו של KCl.

מורפולוגיות של מבני FtsZ מ-E. coli ו-B. subtilis

המבנים שנוצרו על ידי FtsZ נבחנו באמצעות TEM. FtsZBs התרכב לפולימרים דחוסים שכיסו את כל הרשת בכל סוגי התמיסות בריכוז מלח נמוך (איורים 4A-C). FtsZEc יצר פילמנטים ארוכים, כבלים ואגודות בכל התמיסות בריכוז מלח נמוך (איורים 4D-F). עם זאת, כמות הפולימריםB הנצפית שנוצרה על ידי FtsZEc הייתה נמוכה מזו שנוצרה על ידי FtsZBs. בתמיסות בעלות ריכוז מלח גבוה, FtsZBs יצר פרוטו-פילמנטים ארוכים בעלי גדיל יחיד שלא התאגדו לאגודות (איורים 4G-I). בעוד שהפרוטו-פילמנטים של FtsZBs שינו את מבנם בריכוז מלח גבוה יותר, FtsZEc יצר מבנים שאינם ניתנים להבחנה מאלה של תמיסת מלח בריכוז נמוך (איורים 4J-L). לא נצפתה השפעה של pH על הפולימריזציה של FtsZEc, אך FtsZBs יוצר יותר אגודות ב-pH 6.5, הנראות כפולימרים ודפים דחוסים (איור 4B). תוצאות אלו תואמות את ניסויי פיזור האור שלנו ואת עבודות TEM שפורסמו בעבר8,11,26.

פעילות ה-GTPase של FtsZ בריכוזי KCl גבוהים ונמוכים

פעילות הידרוליזת ה-GTP של FtsZ נמדדה בתנאים שונים באמצעות בדיקה קולורימטרית לפוספט חופשי. כפי שדווח בעבר15 פעילות ה-GTPase של FtsZ עלתה עם עליית ריכוז ה-KCl: בהתאם לבפר שהיה בשימוש, FtsZBs הראתה עלייה של 3-7 מ'; ו-FtsZEc הראתה עלייה של 1.5-2.5 מ' בפעילות ה-GTPase בריכוז של 300 mM KCl בהשוואה ל-50 mM KCl. הפעילות המופחתת של ה-GTPase ב-50 mM KCl נובעת מהצמדה (bundling) של סיבי FtsZBs. ב-50 mM KCl, ל-FtsZEc הייתה פעילות GTPase גבוהה פי 3-6 מזו של FtsZBs עקב פירוק מהיר יותר של פולימרים של FtsZEc. ההבדל בפעילות הידרוליזת ה-GTP בין FtsZBs ל-FtsZEc פחת ב-300 mM KCl, ייתכן בשל הפחתה בהצמדה של סיבי FtsZBs (איור 5).

פולימריזציה של FtsZ, ניתוח % של המשקע, גרף עמודות, אלקטרופורזה של ג'ל, השוואת השפעת GTP/GDP.
איור 1. כימות של פולימריזציה של FtsZ באמצעות שיקוע. (A) 12 µM FtsZ עברו פולימריזציה בנוכחות 2 mM GTP או GDP ב-pH 7.5 (עמודות שחורות), 6.8 (עמודות אפורות) או 6.5 (עמודות לבנות). כמות החלבון שהשקיעה נקבעה באמצעות ניתוח דנסיטומטרי של ג'לים שנצבעו ב-Coomassie. GDP שימש כביקורת לשקיעה ספציפית, ואחוז ה-FtsZ שהשקיע עם GDP הופחת מאחוז ה-FtsZ שהשקיע עם GTP כדי לקבל את הערכים המוצגים בגרף. משמאל: FtsZ שהשקיע ב-50 mM KCl, מימין: FtsZ שהשקיע ב-300 mM KCl. (B) תוצאות מייצגות מג'לים שנצבעו ב-Coomassie. פולימריזציה של FtsZBs (הג'ל העליון) ו-FtsZEc (הג'ל התחתון) ב-50 mM KCl. (S) עלה, (P) פракציות של משקע מהניסוי. לחצו כאן להצגת תמונה גדולה יותר.

גרף אינטראקציה בין FtsZ ל-SepF וג'ל המראה את השפעת GTP/GDP על אחוז חלבון המשקע.
איור 2. שקיעה של צינוריות SepF/FtsZ במהירות נמוכה. (A) 12 µM FtsZBs עבר פולימריזציה עם 2 mM GDP (פסים לבנים) או GTP (פסים שחורים). כמות החלבון שהשקיע נקבעה באמצעות אנליזה דנסיטומטרית של ג'לים שנצבעו ב-Coomassie. הסימנים + ו- - מתחת לציר ה-x מצביעים על נוכחות או היעדר של FtsZ ו-SepF בתגובה. (B) תוצאות מייצגות מג'ל שנצבע ב-Coomassie. פולימריזציה של FtsZBs בנוכחות ובהיעדר SepF. כביקורת נעשה שימוש ב-SepF ללא FtsZ. הפולימריזציה בוצעה עם GTP ו-GDP. (S) עלילון, (P) פראקציות משקע מהניסוי. לחצו כאן להצגת תמונה גדולה יותר.

גרפים של פיזור אור של FtsZ בריכוזי KCl שונים; מראה השפעות של pH 6.5, 6.8, 7.5.
איור 3. פיזור אור של 12 μM FtsZEc ו-12 μM FtsZBs. חלבוני FtsZ הורכבו בנוכחות 2 mM GTP והפולימריזציה נוטרה באמצעות פיזור אור בזווית של 90°. פולימריזציה של FtsZBs (A) ו-FtsZEc (B) בריכוז 50 mM KCl ב-pH 7.5, pH 6.8, pH 6.5. פולימריזציה של FtsZBs (C) ו-FtsZEc (D) בריכוז 300 mM KCl ב-pH 7.5, pH 6.8 ו-pH 6.5. לחצו כאן להצגת תמונה גדולה יותר.

מיקרוסקופיה אלקטרונית של פולימרים של FtsZ בריכוזי pH ו-KCl משתנים; ניתוח מבני.
איור 4. מבנים של פולימרים של FtsZBs ו-FtsZEc כפי שנצפו במיקרוסקופיה אלקטרונית. (A-L) תמונות של 12 µM FtsZBs (A-C ו-G-I) ו-FtsZEc (D-F) ו-(J-L) שעברו פולימריזציה עם 2 mM GTP. (A-C) FtsZBs בבופר עם 50 mM KCl ו-pH 7.5, 6.8, ו-6.5 בהתאמה. (D-F) FtsZEc בבופר עם 50 mM KCl ו-pH 7.5, 6.8, ו-6.5 בהתאמה. (G-I) FtsZBs בבופר עם 300 mM KCl ו-pH 7.5, 6.8, ו-6.5 בהתאמה. (J-L) FtsZEc בבופר עם 300 mM KCl ו-pH 7.5, 6.8, ו-6.5 בהתאמה. סרגל קנה מידה: 100 nm. לחצו כאן להצגת תמונה גדולה יותר.

גרף פעילות GTPase; תרשים עמודות של FtsZ בריכוז 50mM לעומת 300mM KCl, וריאציות של pH בערכים 7.5, 6.8, 6.5.
איור 5. הידרוליזה של GTP במהלך פולימריזציה של FtsZ ב-6 חוצצים שונים.בכל הניסויים נעשה שימוש ב-2 mM GTP. כביקורת, נעשה שימוש בדגימה ללא MgCl2. הפעילות של FtsZ ללא MgCl2 הופחתה מהפעילות של FtsZ בנוכחות MgCl2. משמאל: פעילות GTPase של FtsZ בריכוז 50 mM KCl, מימין: פעילות GTPase של FtsZ בריכוז 300 mM KCl. לחץ כאן להצגת תמונה גדולה יותר.

דיון

אנו מתארים סט של שיטות המאפשרות ניתוח מהיר של פעילות FtsZ והאינטראקציה שלה עם חלבונים אחרים. פיזור אור, שקיעה ומבחני GTPase כמו גם מיקרוסקופ אלקטרונים היו בשימוש נרחב לחקר פילמור FtsZ. ביצענו כמה שיפורים בפרוטוקולים הקיימים, הראינו את ההשפעה של תנאים שונים על הרכבת FtsZ, ואנו מציעים בקרות שיש לכלול במחקרי FtsZ.

אנו מציגים צנטריפוגה במהירות נמוכה כדי להבחין בין מבנים גדולים שנוצרו על ידי הקשר בין FtsZ וחלבוני האינטראקציה שלו מפולימרים FtsZ. שיטה זו מציגה שני יתרונות על פני מבחן השיקוע הסטנדרטי. ראשית, לא נוצר רקע על ידי פולימרי FtsZ בשבר הגלולה מכיוון שהם אינם מסובבים כלפי מטה ב-24,600 x גרם. שנית, ניתן לחשב את כמות ה-FtsZ הקיימת במבנה שנוצר עם חלבון מקיים אינטראקציה מהג'ל. שני שלבים קריטיים בשיטה זו הם זמן הדגירה וריכוז ה-GTP. חשוב לצנטריפוגה את מבנה החלבון הגדול כשהוא הושלם, אך לפני שהוא מתפרק כאשר כל ה-GTP עובר הידרוליזה. הבקרה הטובה ביותר למחקר זה היא פילמור של FtsZ עם תמ"ג. יש מגבלה פוטנציאלית אחת של הבדיקה. FtsZ יוצר קומפלקס יציב עם SepF, שניתן לסובב בקלות ב-24,600 x גרם. אם מתבצעת שקיעה עם מפעיל אחר או תרופה המאגדת פולימרים FtsZ, ייתכן שיהיה צורך להתאים את הבדיקה. ניתן לעשות זאת על ידי שינוי זמן הדגירה, או הגדלת מהירות הצנטריפוגה.

הכנה נכונה של הדגימה היא החשובה ביותר לניסויי פיזור אור. יש לנקות חלבונים מראש על ידי סיבוב ויש לסנן את כל המאגרים לפני השימוש. אם קיימים אגרגטים כלשהם בדגימה, הם ישבשו אות יציב המתקבל מפולימרים FtsZ. לניתוח מבני FtsZ על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים, הכנת רשת היא הצעד העיקרי. זמן הדגירה של הדגימה על הרשת ישפיע על ייצור פולימרים דחוסים פחות או יותר. עבור צרורות של FtsZBs, זמן הדגירה חייב להיות קצר יותר מאשר עבור FtsZEc ו-FtsZBs בריכוז KCl גבוה. השתמשנו בריכוז של 12 מיקרומטר עבור כל דגימה כדי שנוכל להשוות את התוצאות. עם זאת, עבור FtsZBs ב-50 מ"מ KCl יש להשתמש בריכוז FtsZ נמוך יותר, מכיוון ש-12 מיקרומטר הביא לרוויה מלאה של הרשת. זה הופך את הפולימרים לדחוסים מאוד וקשים לזיהוי. עדיף לזהות פולימרים פחות דחוסים ב- EM.

בדיקת GTPase היא הניסוי היחיד המשמש לחקר הפעילות ולא המבנים של FtsZ. Mg2+ נחוץ לתחלופת GTP בפולימרים FtsZ. לפיכך, בהיעדר Mg2+, FtsZ אינו מבצע הידרוליזה של GTP. לכן, דגימה ללא Mg2+ היא הבקרה הנכונה בבדיקה זו, אך קטיונים של Mg קיימים במאגר האחסון של FtsZ. ניתן להסיר אותם על ידי תוספת של 1 מ"מ EDTA לדגימת הבקרה. השלב הקריטי בבדיקה זו הוא זמן הדגירה. חשוב להפסיק את פעילות ה-FtsZ לאחר זמן נתון. זה מושג על ידי העברת דגימת ה-FtsZ לתמיסה ירוקה מלכיט בצלחת של 96 בארות. עם זאת, התפתחות הצבע הירוק של המלכיט היא תהליך מתמשך. לפיכך, יש לבצע את המדידות בו זמנית עבור כל דגימה. באמצעות פרוטוקול תוספת GTP מתוכנן היטב עם מדידות שנלקחו כל 30 שניות זו מזו בסדר קבוע, ניתן לקבל את אותו זמן דגירה וטיפול בדגימה עבור כל נקודת זמן. שלב קריטי נוסף הוא בחירת ריכוז החלבון לניסוי. בניסוי השתמשנו בשני ריכוזים שונים עבור FtsZEc ו-FtsZBs. הידרוליזה של GTP מהירה בהרבה עבור FtsZEc בהשוואה ל-FtsZBs. פעילות ה-GTPase של FtsZEc בתנאים נבחרים וב-12 מיקרומטר היא ליניארית רק למשך 5 דקות לכל היותר ולאחר זמן זה קצב ההידרוליזה מתייצב. לפיכך, קשה לפרש נתונים מהניסוי כאשר הם מבוצעים בתנאים אלה. במקרה זה יש להשתמש ב-FtsZEc בריכוז נמוך יותר מ-FtsZBs כדי להיות מסוגל להשוות את הפעילויות של שני החלבונים. פעילות GTPase של FtsZs ממקורות שונים עשויה להשתנות. לפיכך, יש לבחור את הריכוז הנכון. הריכוז לפילמור FtsZ צריך להיות הרבה מעל הריכוז הקריטי (באופן כללי בין 2.5-10 מיקרומטר). הדינמיקה של הרכבה ופירוק של FtsZ חשובה גם היא. חלק מהחלבונים מראים פיגור משמעותי בפילמור לאחר הוספת GTP, כפי שמוצג עבור FtsZBs ב-50 מ"מ KCl. כדאי לבצע את בדיקת פיזור האור לפני בדיקת GTPase כדי להעריך את זמן ההרכבה והפירוק של פולימרי FtsZ. לאחר מכן, ניתן לבחור את זמן הדגירה וריכוז החלבון. מכיוון שהתנאים שנבחרו לפילמור FtsZ הם קריטיים, חשוב להשתמש בריכוז ה-pH וה-KCl הנכונים בכל שיטה. בעבודה זו חקרנו 9 חוצצים שונים עם pH שנע בין 6.5-7.5 וריכוזי KCl מ-0 מ' עד 300 מ"מ. שמנו לב שהמצב הטוב ביותר לניתוח FtsZs מ-B. subtilis ו-E.coli והפעילות הביולוגית שלהם הוא ב-pH הקרוב לרמה הפיזיולוגית (7.5) יחד עם ריכוז KCl גבוה. בריכוז KCl גבוה, ל-FtsZ יש פעילות GTPase גבוהה יותר ומייצר פולימרים הניתנים לזיהוי טוב יותר על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים. אישרנו גם כי ה-pH הפיזיולוגי וריכוז KCl גבוה טובים יותר לחקר האינטראקציה בין FtsZ לחלבונים רגולטוריים מאשר כל חוצץ אחר המשמש בעיקר לחקר הרכבת FtsZ. FtsZBs מראה פעילות דומה ל-FtsZEc כאשר נחקר בריכוז KCl גבוה. בנוסף, בריכוז מלח נמוך השפעת ה-pH ניכרת יותר מאשר במאגרים עם ריכוז מלח גבוה. FtsZ לפעמים משקע בעת שימוש במאגרים ללא KCl, כתוצאה מכך יש להימנע ממאגרים ללא מלח. שקיעה של פולימרים FtsZ נמוכה בעת שימוש במאגרים עם ריכוזי KCl גבוהים. זה עשוי להיות יתרון כאשר חוקרים אינטראקציות בין FtsZ לחלבונים המרכיבים חוטי FtsZ כגון SepF ו-ZapA מכיוון שקל לזהות מבנים מסדר גבוה יותר אלה באמצעות צנטריפוגה. בכל הניסויים שלנו השתמשנו ב-MgCl2 בריכוז של 10 מילימטר. הוכח כי ריכוז גבוה יחסית של Mg2+ מייצב פולימרים FtsZ ומפחית את פעילות ה-GTPase של FtsZ. בטבלה 2 מסכמים תוצאות ממחקרים שונים המתארות פילמור FtsZ ופעילות GTPase בריכוזים שונים של Mg2+ תוך שימוש בתנאי חיץ זהים אחרת 27. הריכוז הנמדד של Mg2+ ציטופלזמי חופשי הוא 0.9 מ"מ3. יש לשים לב ש-GTP יבצע כמות שווה ערך של Mg2+. לפיכך, הריכוז האופטימלי של Mg2+ לניסויי GTPase הוא בסביבות 2-2.5 מ"מ, שהוא קרוב לרמה פיזיולוגית3. עם זאת, בניסויים שלנו השתמשנו ב-MgCl2 בריכוז של 10 מ"מ כדי להשיג אות פיזור אור הניתן לזיהוי בקלות ולייצב פולימרים של FtsZ במהלך בדיקת השיקוע.

אף על פי שהחלנו את הפרוטוקולים שלנו על FtsZ מאורגניזמי המודל E. coli ו-B. subtilis, הם יכולים להיות מותאמים ל-FtsZ מכל אורגניזם אחר. יש לציין כי ה-pH הפיזיולוגי, והריכוזים של קטיונים חד-ערכיים ודו-ערכיים שונים בין אורגניזמים. לפיכך, התנאים האופטימליים לפילמור FtsZ עשויים להשתנות. הבדלים בזמן ההכפלה ובתנאי הגידול של חיידקים שונים עשויים לגרום לקינטיקה שונה של הרכבה של FtsZ ולתנאים אופטימליים של הניסויים. אולם הפרוטוקול שלנו מספק נקודת התחלה טובה לניסויים עם FtsZs מאורגניזמים אחרים. הפרוטוקולים צריכים להיות שימושיים לחקר FtsZ עם חלבונים רגולטוריים או לחקר ההשפעות של תרכובות ותרופות קטנות על FtsZ.

מקורפילמור [% מ-FtsZ משוקע]GTPase [Pi/FtsZ/min]ריכוז מ"ג2+ [מ"מ]ריכוז FtsZ [μM]הפניות
FtsZEC~ 28%~ 2.11012עבודה זו
~ 50%~ 2.41012.527
~ 43%~ 3.5512.527
~ 27%~ 4.62.512.527
נ.ד~ 5.42.5526
FtsZBs~ 30%~ 0.812עבודה זו
~ 52% (עם דקסטרן DEAE)~ 0.5101011
נ.ד~ 2.252.5526

טבלה 2. השפעה על Mg2+ על פילמור FtsZ ו-GTPase. תוצאות מעבודה זו בהשוואה לנתונים שפורסמו. כל הניסויים בוצעו ב-50 מ"מ MES/NaOH, pH=6.5, 50 מ"מ KCl.

גילויים

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

תודות

העבודה במעבדה שלנו ממומנת על ידי מענק VIDI מהארגון ההולנדי למחקר מדעי (ל-DJS). אנו מודים למארק סטיוארט ולמחלקה למיקרוסקופיה אלקטרונית באוניברסיטה שלנו, על הסיוע והגישה למיקרוסקופ אלקטרוני השידור.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
GTPRoche10106399001חלק 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7
צינורות פוליקרבונט עבי דופןבקמן קולטר343776חלק 2
אופטימה MAX-XP אולטרה-צנטריפוגהבקמן קולטר393315 חלק 2, 3
צינור פוליאלומר עם כובע הצמדהבקמן קולטר357448חלק 3
חבילה ביולוגית AIDA, 1D, 2D,FL Raytest Isotopenmessgerä te GmbH15000001חלק 4
מנתח תמונות זוהר LAS-4000Fujifilmחלק 4
ספקטרומטר תרמו-ספקטרוני AMINCO-Bowman ספקטרומטר זוהרמכשיריםחלק 5
תא פלואורסצנטיHellma Analytics105-250-15-40חלק 5
ריבוע 400 רשת, נחושת, 100/בקבוקוןמיקרוסקופ אלקטרונים מדעיG400-Cuחלק 6
מיקרוסקופ אלקטרונים CM120 הפועל ב-120 קילו וולטפיליפסחלק 6
96 מ"ל x 0.2 מ"ל צלחתBIOplasticsB70501חלק 7
ערכת בדיקת פוספט ירוק מלכיטמערכת בדיקה ביולוגיתPOMG-25Hחלק 7
PowerWave HT ספקטרופוטומטר מיקרופלייטBioTekחלק 7
ספקטרוניים

מקורות

  1. Haydon, D. J., Stokes, N. R., et al. An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcal activity. Science. 321 (5896), 1673-1675 (2008).
  2. Adams, D. W., Errington, J. Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring. Nat. Rev. Microbiol. 7 (9), 642-653 (2009).
  3. Erickson, H. P., Anderson, D. E., Osawa, M. FtsZ in bacterial cytokinesis: cytoskeleton and force generator all in one. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (4), 504-528 (2010).
  4. Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division. EMBO J. 26 (22), 4694-4708 (2007).
  5. Król, E., van Kessel, S. P., van Bezouwen, L. S., Kumar, N., Boekema, E. J., Scheffers, D. J. Bacillus subtilis SepF binds to the C-terminus of FtsZ. PLoS One. 7 (8), e43293(2012).
  6. Singh, J. K., Makde, R. D., Kumar, V., Panda, D. SepF increases the assembly and bundling of FtsZ polymers and stabilizes FtsZ protofilaments by binding along its length. J. Biol. Chem. 283 (45), 31116-31124 (2008).
  7. Gündoğdu, M. E., Kawai, Y., et al. Large ring polymers align FtsZ polymers for normal septum formation. EMBO J. 30 (3), 617-626 (2011).
  8. Pacheco-Gomez, R., Roper, D. I., Dafforn, T. R., Rodger, A. The pH dependence of polymerization and bundling by the essential bacterial cytoskeletal protein FtsZ. PLoS One. 6 (6), e19369(2011).
  9. Mendieta, J., Rico, A. I., Lopez-Vinas, E., Vicente, M., Mingorance, J., Gomez-Puertas, P. Structural and functional model for ionic (K(+)/Na(+)) and pH dependence of GTPase activity and polymerization of FtsZ, the prokaryotic ortholog of tubulin. J. Mol. Biol. 390 (1), 17-25 (2009).
  10. Tadros, M., Gonzalez, J. M., Rivas, G., Vicente, M., Mingorance, J. Activation of the Escherichia coli cell division protein FtsZ by a low-affinity interaction with monovalent cations. FEBS Lett. 580 (20), 4941-4946 (2006).
  11. Scheffers, D. J. The effect of MinC on FtsZ polymerization is pH dependent and can be counteracted by ZapA. FEBS Lett. 582 (17), 2601-2608 (2008).
  12. Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. Analysis of FtsZ assembly by light scattering and determination of the role of divalent metal cations. J. Bacteriol. 181 (3), 823-832 (1999).
  13. Chen, Y., Erickson, H. P. Rapid in vitro assembly dynamics and subunit turnover of FtsZ demonstrated by fluorescence resonance energy transfer. J. Biol. Chem. 280 (23), 22549-22554 (2005).
  14. Hou, S., Wieczorek, S. A., et al. Characterization of Caulobacter crescentus FtsZ protein using dynamic light scattering. J. Biol. Chem. 287 (28), 23878-23886 (2012).
  15. Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. Dynamic assembly of FtsZ regulated by GTP hydrolysis. EMBO J. 17 (2), 462-469 (1998).
  16. Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate. Anal. Biochem. 100 (1), 95-97 (1979).
  17. Ray, S., Kumar, A., Panda, D. GTP regulates the interaction between MciZ and FtsZ: a possible role of MciZ in bacterial cell division. Biochemistry. 52 (2), 392-401 (2013).
  18. Rivas, G., Lopez, A., et al. Magnesium-induced linear self-association of the FtsZ bacterial cell division protein monomer. The primary steps for FtsZ assembly. J. Biol. Chem. 275 (16), 11740-11749 (2000).
  19. Oliva, M. A., Cordell, S. C., Lowe, J. Structural insights into FtsZ protofilament formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 11 (12), 1243-1250 (2004).
  20. Lowe, J., Amos, L. A. Crystal structure of the bacterial cell-division protein FtsZ. Nature. 391 (6663), 203-206 (1998).
  21. Cordell, S. C., Robinson, E. J., Lowe, J. Crystal structure of the SOS cell division inhibitor SulA and in complex with FtsZ. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (13), 7889-7894 (2003).
  22. Chen, Y., Anderson, D. E., Rajagopalan, M., Erickson, H. P. Assembly dynamics of Mycobacterium tuberculosis FtsZ. J. Biol. Chem. 282 (38), 27736-27743 (2007).
  23. White, E. L., Ross, L. J., Reynolds, R. C., Seitz, L. E., Moore, G. D., Borhani, D. W. Slow polymerization of Mycobacterium tuberculosis FtsZ. J. Bacteriol. 182 (14), 4028-4034 (2000).
  24. Oliva, M. A., Trambaiolo, D., Lowe, J. Structural insights into the conformational variability of FtsZ. J. Mol. Biol. 373 (5), 1229-1242 (2007).
  25. Thanbichler, M., Shapiro, L. M. ipZ. a spatial regulator coordinating chromosome segregation with cell division in Caulobacter. Cell. 126 (1), 147-162 (2006).
  26. Buske, P. J., Levin, P. A. Extreme C terminus of bacterial cytoskeletal protein FtsZ plays fundamental role in assembly independent of modulatory proteins. J. Biol. Chem. 287 (14), 10945-10957 (2012).
  27. Mukherjee, A., Lutkenhaus, J. Analysis of FtsZ assembly by light scattering and determination of the role of divalent metal cations. J. Bacteriol. 181 (3), 823-832 (1999).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

GTPEscherichia coliBacillus subtilis
FtsZ פלמור מבחני: פרוטוקולים ושיקולים פשוטים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.