הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

דור מהיר של עמילואיד מחלבונים שפת אם

6.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50869

⸱

5 בדצמבר 2013

 ,  , 
1Department of Immunology, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

במאמר זה

סיכום

חלבונים יכולים לאמץ מבנה מקורי או להתקפל בצורה לא נכונה לעמילואיד בלתי מסיס. תנאים המעדיפים את מסלול הקיפול הלא נכון מובילים להיווצרות סוגים שונים של סיבי עמילואיד. השיטות המתוארות כאן מאפשרות המרה מהירה של חלבונים מקומיים לעמילואיד במבחנה.

תקציר

חלבונים לבצע משימות קריטיות באורגניזמים באמצעות הפעלת פונקציות שהושרו משלושה קפלי ממדים הספציפיים שלהם. למרות שמבני יליד פוליפפטידים להגשים מטרות רבות, עכשיו זה הכיר בכך שרוב החלבונים יכולים לאמץ הרכבה חלופית של עמילואיד ביתא העשיר גיליון. סיבי עמילואיד מסיסים בתחילה קשורים למחלות אנושיות מרובות, אבל הם מוצגים יותר ויותר כשחקנים פונקציונליים משתתפים בתהליכים תאיים חשובים שונים. בנוסף, עמילואיד הופקד ברקמות מטופל מכיל רכיבי nonproteinaceous, כגון חומצות וglycosaminoglycans (בדיחות) גרעין. cofactors אלה יכול להקל על היווצרות של עמילואיד, וכתוצאה מדור סוגים שונים של משקעים בלתי מסיסים של. על ידי ניצול של ההבנה שלנו כיצד חלבוני misfold באמצעות שלב ביניים של מקדים עמילואיד מסיס, שפתחנו שיטה להמיר חלבוני יליד סיבי עמילואיד במבחנה

מבוא

חלבונים הם המקרומולקולות הביולוגיות הנפוצות ביותר הקיימות בכל סוגי התאים. הם מופיעים במגוון גדול של גדלים, מבנים ושינויים לאחר התרגום, וממלאים מגוון עצום של פונקציות ביולוגיות חשובות כאשר הם בצורתם המקורית. יותר משני תריסר פוליפפטידים חריגים היו מעורבים במצבים פתולוגיים אנושיים רבים, כגון מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון וסוכרת מסוג2 1-4. החלבונים הסופיים המקופלים בצורה לא נכונה מצטברים כסיבי עמילואיד את האגרגטים היציבים הבלתי מסיסים המתרחשים מחוץ לתאית או תוך תאית.

למרות ההשלכות של חלבונים ספציפיים במחלות מסוימות, ראיות הולכות וגדלות תומכות ברעיון שלכל הפוליפפטידים יש תכונות מהותיות המאפשרות טרנספורמציה של עמילואיד. סקר רצף כלל-גנומי זיהה את ה"עמילום", לפיו שברים המועדים לעמילואיד מהווים כ-15% מכלל מקטעי הפפטידים המקודדים מ-E. coli לבני אדם5. בהתאם לכך, התגלה בשנים האחרונות מספר הולך וגדל של עמילואידים פונקציונליים, המשתתפים בתהליכים תאיים חשובים שונים. לדוגמה, חיידקים מרכיבים עמילואידים ליצירת מבני ביופילם ונבגים שהם קריטיים להישרדותם ולפתוגנזהשלהם 6-9. הורמוני פפטיד יוצרים משקעי עמילואיד במהלך האחסון בתוך גרגירי הפרשה של יונקים לפני שחרורם, מה שמרמז עוד יותר על כך שצורת החלבון עמילואיד יכולה לשרת פונקציות ביולוגיות מועילות6,10,11. יתר על כן, חלבונים יכולים גם להתאסף לסיבי עמילואיד כדי להעביר אותות תאיים קריטיים12,13.

במשך שנים רבות, העמילואידים הנחקרים ביותר מוכנים מפפטידים בודדים הקשורים למחלות אנושיות, כגון עמילואיד בטא או פפטיד פריון. פפטידים אלה בדרך כלל חסרים מבנה מוגדר היטב ויוצרים באופן ספונטני עמילואיד בתמיסה לאורך זמן, תהליך המתווך על ידי ביניים לא מקופל חלקית המשמש כמבשר של עמילואיד בלתי מסיס. קודמן העמילואיד נקרא גם אוליגומר חלבון מסיס, שהוא נדיר ולא יציב כאשר הוא נוצר מפפטידים טבעיים14,15. עם זאת, כפי שתואר קודם לכן, כמעט כל חלבון באופן עקרוני יכול לאמץ קונפורמציה של עמילואיד בתנאים המתאימים. לאחרונה הקמנו שיטה להכנת אוליגומרים מסיסים מיוצבים של חלבונים מקומיים, היוצרים עמילואיד בקלות בנוכחות קופקטורים שונים16. סיבי העמילואיד המתקבלים משקפים את האופי המורכב של אגרגטים של קיפול שגוי של החלבון הסופי17,18. כאן אנו משתמשים במונח עמילואיד חלבון בלבד כדי להפנות את סיבי החלבון ללא קופקטורים ועמילואיד היברידי לסיבים המכילים רכיבים לא חלבונים.

בעבר, פותחו שיטות שונות ליצירת עמילואיד במבחנה על ידי יישום תנאים הידועים כמעדיפים קיפול שגוי של חלבון, כגון טמפרטורה גבוהה, סביבה הידרופובית ושינויי pH19-23. עם זאת, הם קשורים לבעיות שונות, כגון יעילות נמוכה, קיפול הפיך, וריאציות אצווה גדולות או קינטיקה איטית. הגישה המתוארת כאן ניתנת לשחזור, קלה להרחבה, ומאפשרת לשלוט במדויק בתזמון ובמצב של המרת עמילואיד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכן מאגר MES

  1. השתמש במאגר MES (0.1 M 2-(N-morpholino) חומצה אתנסולפונית ו-0.9 M NaCl) כדי להכין גם עמילואיד חלבון בלבד וגם אוליגומרים של חלבון מסיס מיוצב. שוקל 1.95 גרם MES ו-5.27 גרם NaCl. הוסף H2O והתאם את ה-pH ל-4.7. הרכיבו את הנפח הסופי ל-100 מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים.

2. הכן עמילואיד חלבון בלבד ישירות מחלבונים טבעיים

  1. שקלו חלבון לבחירתכם (כל חלבון או פפטיד מקומי) והרכיבו מחדש ל-10 מ"ג/מ"ל במאגר MES.
  2. דגירה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס באמבט מים למשך 4 שעות. בסוף התקופה, משקעים לבנים נראים בתמיסה.
  3. נטרל את הדגימה עם 10% (v/v) של Tris-HCl (1 M, pH 10.5).
  4. דיאליזה של החלבון בקלטת דיאליזה למשך הלילה כדי להחליף למאגר הרצוי להמשך ניתוח.
  5. ניתן להכין דגימת בקרה של חלבון מקומי על ידי ביצוע שלבים 2.1, 2.3 ו-2.4 ללא משקעי חום (שלב 2.2).

3. הכן עמילואיד היברידי מאוליגומרים מסיסים מיוצבים של חלבונים מקומיים

  1. הכן אוליגומרים של חלבון מסיס מיוצב
    1. שקלו חלבון לבחירתכם והרכיבו מחדש ל-10 מ"ג/מ"ל במאגר MES. השאירו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
    2. שקלו 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC) והכינו מלאי טרי של 20 מ"ג/מ"ל במאגר MES.
    3. מערבבים תמיסות חלבון ו-EDC ביחס של 2:5 (v/v), כלומר 2 מ"ג חלבון לכל 10 מ"ג EDC.
    4. דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים.
    5. נטרל את הדגימה עם 10% (v/v) של Tris-HCl (1 M, pH 10.5).
    6. דיאליזה של החלבון בקלטת דיאליזה למשך הלילה כדי להחליף למאגר הרצוי להמשך ניתוח.
    7. אחסן את אוליגומר החלבון המסיס המיוצב בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד 4 שבועות.
  2. הכן עמילואידים היברידיים מאוליגומר חלבון מסיס מיוצב.
    1. להכנת עמילואיד המכיל DNA, מערבבים DNA ואוליגומר חלבון מסיס מיוצב ביחס של 1:1 (w/w). השאירו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות. במהלך תקופה זו, משקעים בלתי מסיסים נראים בתמיסה כאשר ריכוז החלבון הראשוני הוא 0.5 מ"ג/מ"ל ומעלה.
    2. להכנת עמילואיד המכיל RNA, מערבבים RNA ואוליגומר חלבון מסיס מיוצב ביחס של 1:1 (w/w). השאירו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות. במהלך תקופה זו, משקעים בלתי מסיסים נראים בתמיסה כאשר ריכוז החלבון הראשוני הוא 0.5 מ"ג/מ"ל ומעלה.
    3. להכנת עמילואיד המכיל הפרין, מערבבים הפרין ואוליגומר חלבון מסיס מיוצב ביחס של 1:1 (w/w). השאירו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות. במהלך תקופה זו, משקעים בלתי מסיסים נראים בתמיסה כאשר ריכוז החלבון הראשוני הוא 0.5 מ"ג/מ"ל ומעלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

היכולת להמיר חלבונים טבעיים ישירות לאמילואיד נשענת על השינוי הקונפורמציונלי המתרחש בטמפרטורה גבוהה במערך MES. שקיעה בתמיסה מהווה אינדיקציה טובה לאגרגציה של חלבונים וייתכן שמעידה על היווצרות אמילואיד. מאידך, כדי לאפשר ייצוב של אוליגומרים של חלבונים ממיסים, נעשה שימוש ב-EDC ליצירת קשרים צולבים בין החלבונים, במטרה להקשיח את הקונפורמציה האוליגומרית שהשתחלה בתמיסת ה-MES. כתוצאה מכך, האוליגומרים המיוצבים של החלבונים הם חלבונים מולטמריים (איור 1), המובחנים מחלבון טבעי מונומרי או מאגרגטים המושרים על ידי חום כאשר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השיטה המתוארת כאן מציעה אמצעי מהיר וגמיש להכנת סיבי עמילואיד במבחנה כמעט מכל חלבון או פפטיד לבחירה. ניתן להכין באופן אמין מספר סוגים שונים של עמילואיד - סיבי חלבון בלבד או אגרגטים היברידיים המכילים DNA, RNA או גליקוזאמינוגליקנים. הנהלים המעורבים הם פשוטים, ישירים ואינם דורשים הכשרה טכנית מתקדמת. העמילואיד שהוכן בשיטה זו יציב למדי וניתן לאחסן אותו בבטחה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס או להקפיא בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לתקופה ארוכה יותר.

אחד הגורמים הקריטיים ביותר להבטחת ייצור מוצלח ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין לנו מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים ל-W.C. מהמכונים הלאומיים לבריאות AI074809 ותוכנית מענק המחקר המוסדי של מרכז הסרטן M. D. Anderson של אוניברסיטת טקסס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2-(N-מורפולינו)חומצה אתנסולפונית (MES)Sigma-AldrichM8250
NaClFisherBP358-10
1-ethyl-3-[3-dimethyl-aminopropyl] carbodiimide hydrochloride (EDC)Thermo/Pierce22980
DNA מזרע סלמוןSigmaD1626
RNA משמרי טורולהSigmaR6625
הפרין מרירית מעי חזירSigmaH3149
Tris baseFisherBP152-1
ציוד:
אמבט מיםFisher ScienceIsotemp 210
קלטת דיאליזה Slide-A-LyzerThermo / Pierce66380

מקורות

  1. Selkoe, D. J. Folding proteins in fatal ways. Nature. 426, 900-904 (2003).
  2. Schnabel, J. Protein folding: The dark side of proteins. Nature. 464, 828-829 (2010).
  3. Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426, 895-899 (2003).
  4. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annu. Rev. Biochem. 75, 333-366 (2006).
  5. Goldschmidt, L., Teng, P. K., Riek, R., Eisenberg, D. Identifying the amylome, proteins capable of forming amyloid-like fibrils. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3487-3492 (2010).
  6. Fowler, D. M., Koulov, A. V., Balch, W. E., Kelly, J. W. Functional amyloid - from bacteria to humans. Trends Biochem. Sci. 32, 217-224 (2007).
  7. Chapman, M. R., et al. Role of Escherichia coli Curli Operons in Directing Amyloid Fiber Formation. Science. 295, 851-855 (2002).
  8. Barnhart, M. M., Chapman, M. R. Curli Biogenesis and Function. Annu. Rev. Microbiol. 60, 131-147 (2006).
  9. Claessen, D., et al. A n olved in aerial hyphae formation in Streptomyces coelicolor by forming amyloid-like fibrils. Genes Dev. 17, 1714-1726 (2003).
  10. Maji, S. K., et al. Functional Amyloids As Natural Storage of Peptide Hormones in Pituitary Secretory Granules. Science. 325, 328-332 (2009).
  11. Badtke, M. P., Hammer, N. D., Chapman, M. R. Functional Amyloids Signal Their Arrival. Sci. Signal. 2, pe43(2009).
  12. Li, J., et al. The RIP1/RIP3 Necrosome Forms a Functional Amyloid Signaling Complex Required for Programmed Necrosis. Cell. 150, 339-350 (2012).
  13. Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146, 448-461 (2011).
  14. Stefani, M. Biochemical and biophysical features of both oligomer/fibril and cell membrane in amyloid cytotoxicity. FEBS J. 277, 4602-4613 (2010).
  15. Glabe, C. G. Structural classification of toxic amyloid oligomers. J. Biol. Chem. 283, 29639-29643 (1074).
  16. Di Domizio, J., et al. Binding with nucleic acids or glycosaminoglycans converts soluble protein oligomers to amyloid. J. Biol. Chem. 287, 736-747 (2012).
  17. Zhang, X., Li, J. -P., Lijuan, Z. Heparan sulfate proteoglycans in amyloidosis. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 93, 309-334 (2010).
  18. Jiménez, J. S. Protein-DNA Interaction at the Origin of Neurological Diseases: A Hypothesis. J. Alzheimer's Dis. 22, 375-391 (2010).
  19. Bhattacharya, M., Jain, N., Mukhopadhyay, S. Insights into the Mechanism of Aggregation and Fibril Formation from Bovine Serum Albumin. J. Phys. Chem. B. 115, 4195-4205 (2011).
  20. Vetri, V., et al. Bovine Serum Albumin protofibril-like aggregates formation: Solo but not simple mechanism. Arch. Biochem. Biophysics. 508, 13-24 (2011).
  21. Bucciantini, M., et al. Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases. Nature. 416, 507-511 (2002).
  22. McParland, V. J., Kalverda, A. P., Homans, S. W., Radford, S. E. Structural properties of an amyloid precursor of b2-microglobulin. Nat. Struct. Mol. Biol. 9, 326-331 (2002).
  23. Chiti, F., et al. Designing conditions for in vitro formation of amyloid protofilaments and fibrils. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 3590-3594 (1999).
  24. McParland, V. J., et al. Partially Unfolded States of b2-Microglobulin and Amyloid Formation in vitro. Biochemistry. 39, 8735-8746 (2000).
  25. Liu, K., Cho, H. S., Lashuel, H. A., Kelly, J. W., Wemmer, D. E. A glimpse of a possible amyloidogenic intermediate of transthyretin. Nat. Struct. Mol. Biol. 7, 754-757 (2000).
  26. Pfefferkorn, C. M., McGlinchey, R. P., Lee, J. C. Effects of pH on aggregation kinetics of the repeat domain of a functional amyloid. Pmel17. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21447-21452 (2010).
  27. Di Domizio, J., et al. Nucleic acid-containing amyloid fibrils potently induce type I interferon and stimulate systemic autoimmunity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14550-14555 (2012).
  28. Halle, A., Hornung, V., Petzold, G. C., Stewart, C. R., Monks, B. G., Reinheckel, T., Fitzgerald, K. A., Latz, E., Moore, K. J., Golenbock, D. T. The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-β. Nat. Immunol. 9, 857(2008).
  29. Masters, S. L., O'Neill, L. A. Disease-associated amyloid and misfolded protein aggregates activate the inflammasome. Trends Mol. Med. 17, 276-282 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

היווצרות עמילואידקיפול שגוי של חלבוניםבופר MESשיקוע תרמיקשירה צולבת באמצעות EDCעמילואיד של חומצות גרעיניותעמילואיד של הפריןאוליגומרים של חלבון מסיסבדיקת הזזת ג'לניתוח ציטוטוקסיות
דור מהיר של עמילואיד מחלבונים שפת אם
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.