הפקת ניצני שמרים וטיהור חלבון לחקר תפקוד, האינטראקציות, ולאחר translational השינויים

Summary

הכנת תמציות תא שמרים איכותיות היא צעד ראשון הכרחי בניתוח של חלבונים בודדים או proteomes שלם. כאן אנו מתארים פרוטוקול homogenization מהיר, יעיל, ואמין לתאי שמרי ניצנים שעבר אופטימיזציה כדי לשמר פונקציות חלבון, אינטראקציות, ולאחר translational שינויים.

Abstract

Homogenization ממכות חרוז הוא דרך מהירה ויעילה כדי לשחרר דנ"א, רנ"א, חלבונים ומטבוליטים מתאי שמרי ניצנים, שהם קשים לשמצה לשבש. כאן אנו מתארים את השימוש בטחנה homogenizer חרוז להפקת חלבונים לתוך המאגרים מותאמים לשמור את הפונקציות, אינטראקציות ולאחר translational שינויים של חלבונים. תאים גדלים וגריתמית המבטאים את החלבון של עניין הם גדלו בתקשורת צמיחה נוזלית של בחירה. את תקשורת הצמיחה עלולה להיות בתוספת חומרים כימיים כדי לגרום ביטוי חלבון מיזמים מושרים (למשל גלקטוז), לסנכרן את שלב מחזור תא (לדוגמא nocodazole), או לעכב פונקצית proteasome (למשל MG132). תאים אז pelleted וresuspended בחיץ מתאים המכיל פרוטאז ו / או מעכבי phosphatase ומעובדים או מייד או קפוא בחנקן נוזלי לשימוש מאוחר יותר. Homogenization מושגת על ידי שישה מחזורים של 20 שניות ביהD-מכות (5.5 מ '/ שנייה), כל אחד ואחריו דגירה דקה אחת על קרח. Homogenate כתוצאה מכך אינו מסומן על ידי צנטריפוגה וניתן להסיר חלקיקים קטנים על ידי סינון. כל תמצית התא פינה כתוצאה מכך (WCE) הוא זירז באמצעות 20% TCA לניתוח ישיר של חלבונים הכולל ב-SDS אחריו מערבי סופג. תמציות מתאימות גם לטיהור זיקה של חלבונים מסוימים, זיהוי של לאחר translational שינויים, או הניתוח של חלבוני שיתוף לטיהור. כמו במקרה של רוב פרוטוקולי טיהור חלבונים, אנזימים וחלבונים מסוימים עשויים לדרוש תנאים ייחודיים או בהרכבי חיץ לטיהורם ואחרים עשויים להיות לא יציבים או לא מסיס בתנאים האמורים. במקרה האחרון, שהוצג הפרוטוקול עשוי לספק נקודת התחלה שימושית אמפירי כדי לקבוע את אסטרטגית חרוז המכות הטובה ביותר למיצוי חלבון וטיהור. אנחנו מראים את השאיבה וטיהור של epitope מתויג SUMO E3 האנזים, Siz1, מחזור תאמוסדר חלבון שהופך גם sumoylated וphosphorylated, כמו גם למקטע האנזים היוביקוויטין SUMO ממוקד, Slx5.

Introduction

כוח האדיר של שמרי גנטיקה הוא אגדי, אבל ההכנה והניתוח של חלבוני ילידים משמרי ניצנים, Saccharomyces cerevisiae, הוא לעתים קרובות כרוכה בבעיות. האחרון הוא כתוצאה מהחוזק מכאני הניכר והאלסטיות של תא שמרי ¹ הקיר. אמצעים שונים כבר תאר להאנזימטית, כימית, מכאני, ומבוסס לחץ השיבוש של תאי שמרים להשיג תמצית חלבון כל תא ^2-6. טכניקות אלו משתנות במידה רבה ביעילותם להניב תמציות חלבוני תא נציגויות, ילידים שיכולים לשמש לניתוחים שלאחר מכן או צעדי טיהור. לדוגמה, ניתן להסיר את דופן תא השמרים עם אנזימים ממסים (למשל zymolyase) וכתוצאה מכך יכול spheroblasts להיות מופר על ידי גז, חומרי ניקוי, או תמוגה האוסמוטי לשחרר חלבונים. גישה זו כבר מועסק בהצלחה כנקודה מוצאת לחלוקות subcellular רבות אבל זה דורש incubations ארוךשאינם תואם את היציבות של חלבונים מסוימים ^7.

ריאגנטים תמוגה שמרי קנייניות (כגון חומרי ניקוי) למיצוי הכימי של חלבונים של תאי שמרים זמינים מסחרי, אבל היעילות של חומרים כימיים האלה במיצוי חלבון והשפעתם על האפיון ביוכימי הבא של חלבונים לא תמיד ברורה ^8. homogenizers לחץ גבוה, המכונה לעתים קרובות לוחץ צרפתית, ביעילות לשבור תאי שמרים על ידי חשיפתם הראשונה ללחץ גבוה ולאחר מכן extruding אותם דרך פתח קטן בתא לחץ. טכניקה זו מייצרת תמציות באיכות גבוהות, אבל הציוד מאוד יקר ולא יכול להיות מתאים לכמויות קטנות של תאים או במספר רב של דגימות ^9. לכן, הפרעה מכאנית של תאי שמרים בטחנת חרוז היא לעתים קרובות את שיטת בחירה של חלבון הכנות שמרי ילידים ^10. טכניקה זו כרוכה בהפרעה מכאנית של דופן תא השמרים עם חומצה-WAלשפוך חרוזי זכוכית, אשר יכול להיות שנערכו עם מגוון רחב של המלשינים, vortexers או טחנות חרוזים. יש לציין, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לעבד בו זמנית מספר רב של מדגמים קטנים יותר (1 מ"ל של תאים או פחות). חרוזים שונים או מטריצות שיבוש טחנת חרוז זמינים מסחרי לשבש כמעט כל סוג של תא בסוג 2 צינורות מ"ל עכשיו. בהתחשב בטכניקות ובציוד האחרות, יש טחנת חרוז יתרון נוסף שהשיבוש של תאי שמרים מתרחש מהר מאוד, מה שעוזר לשימור לאחר translational שינויים כגון sumoylation, במיוחד כאשר את המאגרים המתאימים עם פרוטאז ו / או מעכבי proteasome מנוצלים והטמפרטורה של תמציות נשלטת.

פרוטוקול זה מתמקד בחילוץ המהיר, יעיל, ואמין של חלבונים אנדוגניים וביטוי יתר בתנאים עדינים עם המטרה הסופית לשמר את תפקוד חלבון, יחסי גומלין, ולאחר translational שינויים. תקשורת צמיחה, מאגר תמוגה תאקומפוזיציות והגדרות טחנת חרוז מותאמות לשמור על אינטראקציות חלבון ולאחר translational שינויים כגון sumoylation וubiquitylation.

Protocol

טיהור של חלבוני 6xHIS-מתויגים המתבטאים בתאי שמרי ניצנים בתנאים מקומיים

1. צמיחה של תאי שמרים ואינדוקציה של ביטוי חלבון

(שונה מ ²⁾

אופציונלי: השתמש וגריתמית תרבויות שמרים גדלו מבטאות חלבון של עניין במקום תרבויות-Induced גלקטוז שתפורטנה להלן.

1. להפוך תאים של גל ⁺ שמרי מתח עם קידוד פלסמיד-גלקטוז מושרה 6xHIS מתויג חלבון של בחירה. לדוגמה, ראה רשימת חומרים כימיים.
2. לחסן transformants ב 5 מ"ל של תקשורת סלקטיבית המתאימה (SD-אורציל למשל) המכיל 2% סוכרוז. לדגור על 30 מעלות CO / N, מסתובב.
3. לדלל תרבות O / N, כך שהצפיפות האופטית ב 600 ננומטר מודדת 0.3 (OD ₆₀₀ = 0.3) ב33 מ"ל של תקשורת סלקטיבית עם 2% סוכרוז. לגדול ב 30 מעלות צלזיוס, רעד (Δ150 סל"ד).
4. כאשר התרבות הגיעה OD ₆₀₀ = 0.8 -1.5, לגרום לביטוי של החלבון הרצוי על ידי הוספת 17 מ"ל של YEP 3x עם גלקטוז 6% (מתכון בטבלה מס '1), לריכוז סופי של 1x YEP עם 2% גלקטוז. נפח הכולל של התרבות הוא כעת 50 מ"ל. דגירה, רועד, על 30 מעלות צלזיוס במשך 5-6 שעות נוספות.
   הערה: יכול להיות מגוון נפח התרבות. בשלב 1.3, לדלל לשני שלישים מהנפח הסופי הרצוי. בשלב 1.4, להוסיף נפח הסופי השליש מ3x YEP / 6% גלקטוז.
5. מדוד את OD ₆₀₀ של התרבות המושרית ו צנטריפוגות Δ150-200 ₆₀₀ יחידות OD של תאים במשך 5 דקות ב 5000 סל"ד ב 4 ° C.
6. Resuspend תא גלולה עם 1 מ"ל קר כקרח PBS 1X עם מעכבי פרוטאז קוקטייל 1x ולהעביר צינור כובע בורג מ"ל 2.
7. צנטריפוגה תאים 1 דקות ב15,000 סל"ד ב 4 ° C. למזוג supernatant.
8. הצמד הקפאת תא גלולה בחנקן נוזלי, ואחריו תמוגה המיידית תא או אחסון ב -80 ° C עד לשימוש נוסף.

> 2. הומוגניזציה של תאי שמרים והפקה של חלבונים

1. לקפוא תא גלולה מהשלב הקודם, להוסיף 200 μl של חרוזי זכוכית חומצת שטף ו500 μl של חיץ תמוגה קר כקרח (מתכון בטבלה 1 או להשתמש במאגר תמוגה תא של בחירה).
2. בקצרה פיפטה מעלה ומטה. זה לא נדרש באופן מלא לresuspend תא גלולה. שמור צינורות על קרח בכל העת.
   הערה: סוף קצה פיפטה עשוי להיות מנותק לפני pipetting למעלה ולמטה.
3. על 4 מעלות צלזיוס, מניח את הצינור (ים) עם תאים לתוך טחנת חרוז, שיווי המשקל, הנעילה, ולהפעיל את המכונה כהוראות יצרן לכל.
4. הפעל את מקצף חרוז המכיל את הצינור (ות) עבור 20 שניות ב 5.5 מ '/ שנייה, ולאחר מכן מניח על קרח עכור דקות 1. חזור על 6x בסך הכל.
5. נקה את החלבונים המופקים על ידי צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 15,000 סל"ד ב 4 ° C. אופציונלי: להסיר חלקיקים קטנים על ידי צנטריפוגה דרך פילטר SPINX.
6. הכן מדגם של כל תא הדוארxtract (WCE) כדי לאשר את נוכחותו של החלבון של עניין על ידי כתם מערבי:
   1. הוסף WCE מקביל עם 2 ₆₀₀ יחידות OD של תאים (לדוגמא 5 μl של תמצית תנוקה אם 200 ₆₀₀ יחידות OD של תאים נקצרו) ל -20% חומצת 800 μl Trichloroacetic (TCA). מערבולת לערבב.
   2. צנטריפוגה במשך 2.5 דקות ב 15,000 סל"ד ב 4 ° C. למזוג supernatant, אבל להיות זהיר כדי לשמור על גלולה.
   3. הוסף 800 μl של 2% TCA לגלולה ומערבולת הצינור, ואחריו צנטריפוגה ל2.5 דקות ב 15,000 סל"ד ב 4 ° C. למזוג supernatant, אבל להיות זהיר כדי לשמור על גלולה.
   4. הוסף μl 100 של חיץ מדגם TCA (מתכון בטבלה מס '1), מערבולת לפזר גלולה. הערה: אם חיץ המדגם הופך להיות חומצי (הופך לצהוב) לאחר שבנוסף לגלולה, להוסיף aliquots של Δ10 טריס בסיס μl [1M] עד המדגם הוא כחול שוב.
   5. דגירה ב100 ° C גוש חום במשך 2-5 דקות.
   6. מערבולת AGעין לפזר באופן מלא אם שאריות של גלולה עדיין קיימות. פלטות שהוכנו על ידי שיטה זו הן קשה לשמצה להמסה מלאה. זה עלול לקחת Δ10 דקות של vortexing לפזר כדורים לחלוטין.
   7. מדגם בחנות ב -80 ° C עד לשימוש נוסף.
7. הצמד להקפיא aliquots של WCE שנותר פינה בחנקן נוזל חנות ב -80 ° C עד לשימוש נוסף.

3. טיהור אצווה של חלבונים מhomogenates התא שהמרים

הערה: שיטת טיהור זו הוטבה לטיהור של חלבוני 6xHIS-מתויגים על CO ^{2 +} שרף זיקת מתכת.

1. איזון שרף
   1. למדגם בWCE פינה הוכן מΔ20-40 ₆₀₀ יחידות OD של תאים, להוסיף 50-100 μl של שרף זיקה לצינור microcentrifuge. חלבונים המופקים מהתאים שלא מבטאים את החלבון הרצוי או שרף לא ספציפי, כגון amylose, עשויים לשמש כשליטהים לכריכה ספציפי.
   2. שטוף שרף 5x עם 1 מ"ל של חיץ לשטוף: להפוך עליונה מעל לתחתית עד שרף הוא resuspended, ואז לסובב דקות 1 ב 5000 סל"ד ב 4 ° C. לשאוב supernatant.
      הערה: אם מבצע חילוץ וטיהור באותו היום, ניתן לבצע איזון שרף לפני המיצוי.
2. מחייב חלבון לטיהור זיקה
   1. הוסף 100-200 μl של lysate פינה (Δ20-40 יחידות OD ₆₀₀₎ ל50-100 חרוזים שטף μl, ולהביא את הנפח הכולל עד 1 מ"ל עם חיץ תמוגה.
   2. דגירה עם nutation או נדנדה על 4 מעלות צלזיוס במשך 2-5 שעות.
   3. ספין דקות 1 ב 5000 סל"ד ב 4 ° C.
   4. אם תרצה, לשמור את דגימה של הנוזל העליון שנותר לניתוח שלאחר מכן של חלבונים מאוגד. TCA לזרז כמפורט לעיל לWCE (שלב 2.6).
   5. שטוף שרף עם חלבונים מאוגדים 5x עם 1 מ"ל של חיץ לשטוף, ואחרי ספין דקות 1 ב 5000 סל"ד ב4 ° C. שמור דגימות קרות במהלך שוטף.
3. Elution של חלבונים Bound
   1. הוסף 150 חיץ elution μl לשרף, nutate על 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ספין דקות 1 ב 5000 סל"ד ב 4 ° C ולשמור את supernatant בצינור חדש. אופציונלי: חזור על 2x וelutions בריכת.
   2. הכן מדגם eluted לכתם מערבי: עד 25 μl של חלבוני eluted, להוסיף 25 סולפט μl 2x ליתיום dodecyl (LDS) חיץ מדגם עם 2 μl β-mercaptoethanol (BME) ו דגירה ב100 מעלות צלזיוס גוש חום למשך 2 דקות.
      הערה: ניתן להשתמש גם בחיץ מדגם Laemmli 2X הרגיל.
   3. הצמד חלבון eluted עודף הקפאה בחנקן נוזלי.
      אופציונלי: חלבונים שנותרו רצועה משרף עם נפח שווה של חיץ מדגם LDS 2x על 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, הסירו את חלבוני LDS-eluted לצינור חדש, ולאחר מכן להוסיף 2 BME μl לחלבוני eluted, לא לשרף. צו זה הוא למנוע ההסרה של כל יונים או נוגדני הconjugaטד את החרוזים.
   4. חנות דגימות ב -80 ° C עד לשימוש נוסף.
4. כתם מערבי ובדיקה עם נוגדנים מתאימים כדי להמחיש חלבונים.
   1. טען 10-20 μl (Δ1-3 יחידות OD ₆₀₀₎ של כל דגימה ו3-10 μl של סולם חלבון בג'ל-SDS של בחירה. ג'לי בשימוש שגרתי עבור פרוטוקול זה כולל 4-12% Bis-טריס ו8% טריס-גליצין.
   2. הפעל הג'ל על 200 V למשך 50 דקות.
   3. העבר את החלבונים מג'ל לקרום PVDF על ידי העברת חצי יבשה ב19 V במשך 20-30 דקות (מתכון בטבלה מס '1).
   4. הקרום בבלוק 4% milk/1x טריס נאגר מלוח-Tween (TBST) במשך שעה 1 ב RT או O / N ב 4 ° C (מתכון בטבלה 1).
   5. דגירה הממברנה עם נוגדן עיקרי לחלבון epitope מתויג עניין ב4% TBST milk/1x עבור 1-3 שעות ב RT או O / N ב 4 ° C.
   6. לשטוף קרום 3x במשך 5 דקות כל אחד עם TBST 1x.
   7. דגירה עם קרום מתאיםperoxidase המשני חזרת (HRP) מצומדות נוגדן ל1-3 שעות ב RT.
   8. לשטוף קרום 3x במשך 15 דקות כל אחד בנפח גדול של TBST 1x.
   9. לכסות עם קרום מצע ECL ולעטוף בניילון נצמד.
   10. לחשוף את הקרום לסרט ולפתח לדמיין חלבון.

Results

תוצאות הנציג שלנו מגלות כי פרוטוקול חילוץ חרוז מכות וחלבון תאר שימושי להכנה לשחזור של חלבונים עבור מגוון רחב של יישומים במורד הזרם (בטבלה 2). -SDS אחריו מכתים Coomassie של WCEs מראה כי מגוון רחב של חלבונים (~ 12 ל> 250 KDA) ניתן לחלץ reproducibly מתאי שמרים (איור 1 א). להקות בדידות על פני טווח של משקלים מולקולריים מצביעות על תמציות חלבונים באיכות גבוהות. האיכות של תמציות יכולה להיות מאושרת על ידי מערבי סופג לחלבוני epitope-מתויגים ספציפיים. מוצ...

Discussion

פרוטוקול זה מתמקד בהכנת שלמה, ילידים, ולאחר translationally שונה חלבונים מתאי שמרי ניצנים עבור יישומים למטה הנחל. לפני שאנסה פרוטוקול זה, זה הוא קריטי כדי לקבוע אם החלבון של עניין ניתן לאתר בקלות בתמציות חלבונים שהוכנו תחת denaturing תנאי ^12. אם נוגדני polyclonal אינם זמינים זה עשוי להיות יתרון לepitope תג החלבון של עניין, כך שחלבון ההיתוך ניתן להבחין בכתמים מערביים. בפרוטוקול הנוכחי, אנו מתויגים SIZ1 עם HA, 6xHIS-V5, או תגיות epitope myc ואסטרטגיה זו אפשרה לנו...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Omni Bead Ruptor 24	Omni International	19-010
Yeast ORF strain in BG1805	ThermoScientific	YSC3869	GAL+ זן שמרים שניתן להשתמש בו לאינדוקציה ומיצוי
pYES2.1 TOPO וקטור	Life Technologies	K4150-01	GAL+ זן שמרים שניתן להשתמש בו לאינדוקציה ומיצוי; מכיל תג V5/6xHIS
מעכב פרוטאז קוקטייל חד פעמי ( 100x)	Thermo Scientific	1860932
2.0 מ"ל צינור חצאית עם מכסה בורג קשור	BioExpress	C-3369-3	ודא שהצינור מתאים כראוי לקרע החרוזים
חרוזי זכוכית, שטופים בחומצה, 425-600 ומיקרו; m (30-40 מסננת ארה"ב)	Sigma-Aldrich	G8772
Corning Costar Spin-X מסנני צינור צנטריפוגה	Sigma-Aldrich	CLS8161	שימוש לסינון נוסף של ליזאט מובהר
TALON Metal Affinity Resin	Clontech	635502	לטיהור חלבונים מתויגים 6xHIS
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)	Life Technologies	NP0007	כדי להכין ו/או להעלים דגימות לפני SDS-PAGE ו-Western Blotting
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel	Life Technologies	NP0321BOX	ג'לים טרומיים המשמשים לעתים קרובות עבור SDS-PAGE לפני Western Blotting
Simply Blue	Life Technologies	#LC6060	כתם ג'ל חלבון
מאגר ליזה של יונקים	Promega	G9381	מאגר ליזה מסחרי חלופי
Anti-V5 agarose	Sigma	A7345	שיטת אימונו-משקעים
ECL	Millipore	WBKL S0 050
PVDF ממברנה	Millipore	IPVH00010
BIS-TRIS ג'לים	Life Technologies NP0321BOX
נוגדן נגד myc	Covance	mms-150R
נוגדן משני	Abcam	ab97040	עז pAb לעכבר IgG (HRP)