מאמר שיטה

ניתוח פגמים בשרירי השלד בדג זברה זחל על ידי מבחני שבירה כפולה ותגובת בריחה מעוררת מגע

7.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50925

⸱

13 בדצמבר 2013

 ,  , 
1Division of Genetics and Genomics, Manton Center for Orphan Disease Research, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School

במאמר זה

סיכום

דג הזברה הוא כיום כלי מבוסס ורב עוצמה למידול ניוון שרירים, מיופתיות מולדות ומחלות נוירומוסקולריות קשורות. שבירה כפולה והתנהגות בריחה מעוררת מגע הן שתי בדיקות לא פולשניות נפוצות המשמשות לקביעת מידת חוסר הארגון השרירי והפגיעה הקטרתית של עוברי דג הזברה במהלך ההתפתחות המוקדמת.

תקציר

דג הזברה (Danio rerio) הפך לכלי יעיל במיוחד למידול מחלות אנושיות הפוגעות בשרירי השלד, כולל ניוון שרירים1-3, מיופתיות מולדות4,5 ושיבושים בהרכבה סרקומרית6,7, עקב שימור גנומי ומבני גבוה אצל יונקים8. ניתן להעריך במהירות חוסר ארגון שרירי ופגיעה בקטר בדג הזברה במהלך הימים הראשונים לאחר ההפריה. שתי בדיקות המסייעות לאפיין פגמים בשרירי השלד בדג הזברה הן שבירה כפולה (מבנית) ותגובת בריחה מעוררת מגע (התנהגותית).

שבירה כפולה היא תכונה פיזיקלית שבה האור מסובב כשהוא עובר דרך חומר מסודר, כגון המערך הפסאודו-גבישי של סרקומרים שרירים9. זוהי גישה פשוטה ולא פולשנית להערכת שלמות השרירים בזחלי דג זברה שקופים בשלב מוקדם של ההתפתחות. דגי זברה מסוג בר עם שרירי שלד מאורגנים מאוד נראים בהירים מאוד בתוך רקע כהה כאשר הם מוצגים בין שני מסנני אור מקוטבים, בעוד שלמוטציות שרירים יש דפוסי שבירה כפולים ספציפיים להפרעת השרירים העיקרית שהם מדגמים. דג הזברה מדגמן ניוון שרירים, מחלות המאופיינות בניוון מיופייבר ואחריו סבבים חוזרים ונשנים של התחדשות, מציגים כתמים כהים ניווניים בשרירי השלד באור מקוטב. מיופתיות לא דיסטרופיות אינן קשורות לנמק או לשינויים רגנרטיביים, אלא גורמות לסיבי שריר לא מאורגנים ולחולשת שרירי השלד. דג זברה מיופתי מראה בדרך כלל ירידה כללית בשבירה כפולה, המשקפת את חוסר הארגון של סרקומרים.

בדיקת הבריחה המעוררת מגע כוללת התבוננות בהתנהגות השחייה של העובר בתגובה לגירוי מישוש10-12. בהשוואה לזחלים מסוג בר, זחלים מוטנטיים מציגים לעתים קרובות התכווצות מילוט חלשה, ואחריה שחייה איטית או סוג אחר של תנועה לקויה שאינה מצליחה להניע את הזחלים יותר ממרחק קצר12. היתרון של בדיקות אלה הוא שניתן לעקוב אחר התקדמות המחלה באותו סוג דג in vivo במשך מספר ימים, וכי ניתן לנתח מספר גדול של דגים בזמן קצר ביחס לחולייתנים גבוהים יותר.

פרוטוקול

1. ניתוח in vivo של מבנה שרירי השלד על ידי שבירה כפולה

  1. הכן כלובי הזדווגות המפרידים בין הזכר לנקבה של חוט דג הזברה הרצוי בשעות אחר הצהריים המאוחרות לאחר ההאכלה.
    1. הבחין בין נקבות לפי הבטן הגדולה יותר והצבע הכחול/לבן הקל, והזכרים לפי צורת הגוף הדקה והגוונים הוורודים/צהובים.
    2. הצלחה עם הכלאות זוגיות (זכר אחד ונקבה אחת) עשויה להיות רק כ-50%. לשיעור הצלחה גבוה יותר, הזדווג זכר אחד עם 2-3 נקבות.
  2. הסירו את מחיצות הכלוב למחרת בבוקר זמן קצר לאחר תחילת האור ואפשרו לדגים להשריץ ללא הפרעה.
  3. אוספים את הביצים באמצעות מסננת כאשר מוטלים מספר מספיק של ביצים מופרות בתחתית המיכל.
  4. העבירו את העוברים לצלחת פטרי עמוקה על ידי שטיפת המסננת במי דגים והחזירו את דגי ההורים למיכלים שלהם. מניחים צלחות של עוברים באינקובטור של 28.5 מעלות צלזיוס.
  5. נקו את הביצים והפסולת הבלתי ניתנות לקיימא מאוחר יותר באותו יום או למחרת בבוקר, והחזירו את העוברים לאינקובטור להמשך צמיחה.
  6. עוברים/זחלים מגיעים לגיל המתאים לצפייה בשבירה כפולה 3-7 ימים לאחר ההפריה (dpf), מכיוון שתוצאות לפני 3 dpf עלולות לסבול מניגודיות מוגבלת. עוברים מסוג בר בוקעים מהכוריון שלהם בין 48-60 שעות לאחר ההפריה (hpf), ולאחר מכן יישור ציר הגוף. עוברים מסוג בר או מוטנטים שבקעו מאוחר עשויים לדרוש דה-כוריון ידני.
    1. עשו בעדינות קרע בכוריון בעזרת מלקחיים חדים והפכו אותו כך שהעובר ייפול.
    2. אפשר לעוברים שעברו דה-כוריון להתיישר לפני תחילת הבדיקה.
    3. להרדים עוברים עם טריקאין (0.04% במי דגים) כדי לסייע במיקומם הנכון.
  7. התאימו מיקרוסקופ מנתח עם עדשה מקוטבת הניתנת לסיבוב כדי לכוונן את זווית האור המקוטב (איור 1A).
  8. הנח עובר/ים מורדמים ומורדמים ישירות על גבי עדשה מקוטבת שנייה לאורך הציר הצדדי של הגוף. העדשה השנייה צריכה להיות ממוקמת מתחת לעדשה העליונה, על המיקרוסקופ stage (איור 1B). אל תשתמש בצלחות פטרי מפלסטיק בשום שלב במהלך בדיקת השבירה הכפולה, מכיוון שפלסטיק אינו מדיום מתאים להעברת אור שבור.
  9. סובב את העדשה העליונה עם העובר המעניין עד שצירי הקיטוב של שתי העדשות מכוונים ב-90 מעלות זו מזו והרקע כהה לחלוטין.
  10. התפוקה האופטימלית של הבדיקה תלויה בכיוון הדגים בין שתי עדשות מקוטבות. הזיזו את הדגים כדי לוודא שהם שוכבים שטוחים ככל האפשר.
    1. אם הדג מעוקל, רק הקטעים עם הכיוון השטוח הזה יעברו את האור המקוטב ויפגינו שבירה כפולה. במקרים כאלה, מדוד את השבירה הכפולה באזורים השטוחים ורשום את השבירה הכפולה של האזור המקביל בדגי הבר (למשל סומיטים 1-10 הן בדגי בר והן בדגים מוטנטיים).
  11. שימו לב לפנוטיפ הדו-שביר של הדג.
    1. דגים מסוג בר עם שרירי שלד מאורגנים מאוד מראים שבירה כפולה בהירה, מכיוון שמקדם השבירה של האור המקביל לשרירים גבוה יותר מהאור המקוטב בניצב למבנים אלה.
    2. דגים עם שרירי שלד לא מאורגנים המרמזים על מיופתיה לא ניוונית או פגם התפתחותי מראים בדרך כלל ירידה כללית בשבירה כפולה.
    3. דגים עם שרירי שלד לא מאורגנים האופייניים לניוון שרירים מציגים בדרך כלל דפוס דמוי טלאי של שבירה כפולה, כאשר אזורים כהים מייצגים ניוון שרירים בין אזורים בהירים של ארכיטקטורת שרירים תקינה.
  12. כמת שבירה כפולה על ידי צילום תמונות של דגים פראיים ומוטנטיים תחת אור מקוטב באותן הגדרות חשיפה והגדלה. שמור תמונות כקבצי .tiff.
    1. פתיחת תמונות דו-שבירות בתוכנת ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/).
    2. עבור כל תמונה, בחר את האזור של שריר דג הזברה על ידי ציור קו סביב הגוף באמצעות האפשרות "בחירות מצולע" מסרגל הכלים.
    3. השתמש ב"הגדר מדידות" בתפריט הנפתח "ניתוח" כדי לבחור את הנתונים הסטטיסטיים הנדרשים עבור התמונה.
      1. בחירה מינימלית מחייבת סימון תיבות עבור "שטח", "ערך אפור ממוצע" ו"ערך אפור מינימלי ומקסימלי".
      2. ערך אפור מרבי של >255 יציין רוויית פיקסלים. לכן, השתמש בתמונות עם ערכי אפור מרביים נמוכים מ- 255.
    4. נרמל את העוצמה הממוצעת עם האזור שנבחר וחזור על אותו הליך כימות עבור כל תמונת שבירה כפולה.

2. בדיקת התנהגות בריחה מעוררת מגע

  1. הגדר זוגות הזדווגות של קווי דג הזברה המתאימים ואסוף עוברים כמתואר לעיל בשלבים 1.1-1.5.
  2. 2-7 ימים לאחר ההפריה, הניחו עוברים/זחלים שעברו דה-כוריון בנפרד לתוך צלחת פטרי עמוקה או לתאים של צלחות מרובות בארות.
  3. בעבודה עם עובר אחד בלבד בכל פעם, מרכז את העובר בשדה הראייה של סטריאומיקרוסקופ SMZ1500 ניקון עם מערכת מצלמה דיגיטלית SPOT RT3 או דומה, והתחל בהדמיה עוקבת.
    1. יש להשתמש באותה תדירות הדמיה הן עבור דגי בר והן עבור דגים מוטנטיים. מומלץ קצבי פריימים >30 הרץ, מכיוון שקצבים איטיים יותר בדרך כלל לא יספיקו כדי ללכוד את השחייה המהירה של דגים מסוג בר.
  4. העבירו גירויים מכניים-חושיים לעובר על ידי נגיעה בזנב עם סיכת חרקים.
  5. הפסק את ההדמיה כאשר העובר הפסיק לשחות או שחה מחוץ לשדה הראייה.
  6. המר תמונות עוקבות לקובץ וידאו, או נתח פריימים בודדים של תמונות דולג זמן במצב לא מקוון, באמצעות תוכנת SPOT 5.1 Advanced. חבילות תוכנה דומות כוללות את Open Lab, NIS Elements או ImageJ הזמין בחינם (http://rsbweb.nih.gov/ij/).
  7. כמת את התנהגות השחייה על ידי ביצוע התגובה המעוררת מגע במספר עוברים.
    1. ניתן להשיג זאת על ידי חישוב ממוצע המרחק שהעוברים מסוגלים לשחות במרווח זמן קבוע באמצעות תוכנה או סרגל מטרי לסימון נקודות ההתחלה והסיום של קרב השחייה.
    2. הימנע מעוברים להתרגל לגירוי המגע לאורך זמן על ידי ביצוע הבדיקה עם עובר חדש עבור כל חזרה ניסיונית. התנהגויות במודלים מוטנטיים מסוג בר ואמינים נוטות להיות ניתנות לשחזור מאוד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ניתן להשתמש בדו-שבירה (Birefringence) כבדיקה יעילה ולא פולשנית כדי להשיל אור על מצב הארגון של המיופיברילים בעוברים חיים של דגי זברה. מוצגות דוגמאות של דגי זברה מסוג בר (wild-type) וכן של דגי זברה עם ביטוי מופחת של גנים הקריטיים להתפתחות ותפקוד השריר השלדי. דגי זברה מסוג בר ביום ה-5 לאחר ההביה (5 dpf) מראים שרירים שלדיים בעלי דו-שבירה גבוהה תחת אור מקוטב, וזאת בשל המערך המסודר של המיופילמנטים (Figures 2A-B). לעומת זאת, עובר בן אותו גיל, הומוזיגוט למוטציה פתוגנית בגן הדיסטרוגליקן (dag1), מראה דו-ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרעות נוירומוסקולריות ראשוניות מסווגות באופן מסורתי כתהליכים דיסטרופיים או לא דיסטרופיים. ניוון שרירים מאופיין בניוון מיופייבר ואחריו סבבים חוזרים ונשנים של התחדשות, מה שמוביל בסופו של דבר לתהליך סופי המאופיין בפיברוזיס והחלפה ברקמת שומן14. מיופתיות לא דיסטרופיות, לעומת זאת, אינן קשורות לנמק או לשינויים רגנרטיביים, אך גורמות לסיבי שריר לא מאורגנים ולחולשה כללית של שרירי השלד.

מודלים של דג הזברה התגלו בשנים האחרונות כמשאב בעל ערך עצום להבנה טובה יותר של המסלולים המולקולריים והפתוגנז...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

תודות

אנו מודים ל-Behzad Moghadaszadeh על עזרתו הנפלאה בכימות תמונות של שבירה כפולה. עבודה זו מומנה על ידי האגודה לניוון שרירים בארה"ב (MDA201302) והמכון הלאומי לדלקת מפרקים ומחלות שרירים ושלד ועור (R01 AR044345), כמו גם תמיכה נדיבה מ-A Foundation Building Strength, Cure CMD וקרן הצדקה AUism. VAG נתמך על ידי K01 AR062601 מהמכון הלאומי לדלקת מפרקים ומחלות שרירים ושלד ועור, ו-LLS נתמך על ידי F31 NS081928 מהמכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ מוחי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Tricaine SigmaA5040
צלחות פטריפישר סיינטיפיק0875711Z
מלקחייםפישר סיינטיפיק100189-588
סיכת חרקיםפישר סיינטיפיקS67375
עדשות מקוטבותמצלמת ריץQuantaray Tristar אופטיקה C-PL 72 מ"מ
אינקובטור פישר חממת איזוטמפ מדעית דגם 630D
מיקרוסקופניקון אינסטרומנטס בע"מSMZ 1500
מכשירי אבחוןמצלמותSPOT RT3
Diagnostic Instruments Inc.ספוט 5.1 מתקדם
בע"מתוכנת הדמיה

מקורות

  1. Bassett, D. I., Bryson-Richardson, R. J., Daggett, D. F., Gautier, P., Keenan, D. G., Currie, P. D. Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo. Development. 130, 5851-5860 (2003).
  2. Gupta, V., et al. The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies. Hum. Mol. Genet. 20 (9), 1712-1725 (2011).
  3. Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin α2-deficient congenital muscular dystrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (17), 7092-7097 (2007).
  4. Dowling, J. J., et al. Loss of myotubularin function results in T-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy. PLoS Genet. 5 (2), e1000372(2009).
  5. Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. Neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis. Model Mech. 5 (3), 389-396 (2012).
  6. Ferrante, M. I., Kiff, R. M., Goulding, D. A., Stemple, D. L. Troponin T is essential for sarcomere assembly in zebrafish skeletal muscle. J. Cell Sci. 124 (4), 565-577 (2011).
  7. Hawkins, T. A., et al. The ATPase-dependent chaperoning activity of Hsp90a regulates thick filament formation and integration during skeletal muscle myofibrillogenesis. Development. 135 (6), 1147-1156 (2008).
  8. Barbazuk, W. B., et al. The syntenic relationship of the zebrafish and human genomes. Genome Res. 10 (9), 1351-1358 (2000).
  9. Schapira, G., Dreyfus, J. C., Joly, M. Changes in the flow birefringence of myosin as a result of muscular atrophy. Nature. 170 (4325), 494-495 (1952).
  10. Kimmel, C. B., Patterson, J., Kimmel, R. O. The development and behavioral characteristics of the startle response in zebrafish. Dev. Psychobiol. 7, 47-60 (1974).
  11. Eaton, R. C., Bombardieri, R. A., Meyer, D. L. The Mauthner-initiated startle response in teleost fish. J. Exp. Biol. 66, 65-81 (1977).
  12. Saint-Amant, L., Drapeau, P. Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo. J. Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).
  13. Hirata, H., et al. Zebrafish relatively relaxed mutants have a ryanodine receptor defect, show slow swimming and provide a model of multi-minicore disease. Development. 134 (15), 2771-2781 (2007).
  14. Wallace, G. Q., McNally, E. M. Mechanisms of muscle degeneration, regeneration, and repair in the muscular dystrophies. Annu. Rev. Physiol. 71, 37-57 (2009).
  15. Granato, M., et al. Genes controlling and mediating locomotion behavior of the zebrafish embryo and larva. Development. 123, 399-413 (1996).
  16. Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochem. Biophys. Res. Commun. 423 (4), 785-788 (2012).
  17. Low, S. E., et al. TRPM7 is required within zebrafish sensory neurons for the activation of touch-evoked escape behaviors. J. Neurosci. 31 (32), 11633-11644 (2011).
  18. Liu, D. W., Westerfield, M. Function of identified motoneurones and co-ordination of primary and secondary motor systems during zebrafish swimming. J. Physiol. 403, 73-89 (1988).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

In Vivo

מאמרים קשורים