הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF של תא שלם היא שיטה מדויקת ומהירה לניתוח מצבים שונים של הפעלת מקרופאגים

8.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50926

⸱

26 בדצמבר 2013

 ,  ,  ,  , 
1Unité de Recherche sur les Maladies Infectieuses Tropicales et Emergentes (URMITE), CNRS UMR 7278, INSERM U1095, Aix Marseille Université, 2Service de médecine interne, post-urgence et thérapeutique, Hôpital de la Timone

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בספקטרומטריית מסה של תאים שלמים MALDI-TOF על תאים אוקריוטיים. כאן, אנו מדגימים את הדיוק של הטכניקה הזו על ידי ניתוח מצבי ההפעלה המרובים של מקרופאגים בתגובה למיקרו-סביבה שלהם.

תקציר

MALDI-TOF היא טכניקת ספקטרומטריית מסה בשימוש נרחב בכימיה ובביוכימיה. הוא יושם גם ברפואה לזיהוי מולקולות וסמנים ביולוגיים. לאחרונה נעשה בו שימוש במיקרוביולוגיה לזיהוי שגרתי של חיידקים הגדלים מדגימות קליניות, ללא שלבי הכנה או פיצול. אנו ואחרים יישמנו בהצלחה את טכניקת ספקטרומטריית המסה MALDI-TOF של תאים שלמים על תאים אוקריוטיים. היישומים הנוכחיים נעים בין זיהוי סוג תא להערכת בקרת איכות של תרבית תאים ויישומי אבחון. כאן, אנו מתארים את השימוש בו כדי לחקור את פנוטיפים הקיטוב השונים של מקרופאגים בתגובה לציטוקינים או לחיידקים שנהרגו בחום. זה איפשר זיהוי של טביעות אצבע ספציפיות למקרופאגים המייצגות את מגוון התגובות הפרוטאומיות של מקרופאגים. יישום זה ממחיש את הדיוק והפשטות של השיטה. הפרוטוקול שתיארנו כאן עשוי להיות שימושי לחקר תגובת המארח החיסוני במצבים פתולוגיים או עשוי להיות מורחב ליישומי אבחון רחבים יותר.

מבוא

ספקטרומטריית מסה של זמן טיסה (MALDI-TOF MS) היא טכניקת ספקטרומטריית מסה פופולרית לחקר דגימות ביולוגיות. שימוש בקרן לייזר ובמטריצה סופגת אנרגיה מאפשר תהליך יינון רך: אידוי ויצירה של ביומולקולות גדולות בעיקר חד-טעונות. תהליך זה נקרא ספיגה/יינון, המצדיק את ראשי התיבות MALDI. יונים אלה מואצים לאחר מכן על ידי הפעלת מתח ונכנסים למנתח TOF המאפשר הפרדה של יונים אלה וכימות המסות שלהם1.

MALDI-TOF MS נמצא בשימוש נרחב בביולוגיה, כימיה ורפואה לזיהוי מולקולות וסמנים ביולוגיים2-4 או לניטור שינויים לאחר תרגום ב-proteins5,6. לאחרונה, מספר קבוצות יישמו את MALDI-TOF MS לזיהוי מיקרואורגניזמים מדגימות קליניות7,8. יישום מיקרוביולוגי זה משמש כיום באופן שגרתי במסגרות הקליניות. ל-MALDI-TOF של תא שלם יתרונות רבים בהשוואה ליישומים קלאסיים של MALDI-TOF MS. דגימות המכילות תאים שלמים מעובדות ישירות, תוך הימנעות משלבים גוזלי זמן לפיצול או הפרדה של כמויות גדולות של חומר. יתר על כן, אין צורך באפיון הפסגות השונות: הספקטרום כולו נחשב כטביעת אצבע של הדגימה, ואלגוריתמים תואמים משווים את הספקטרום הנבדק למסד נתונים של ספקטרום ייחוס.

אנחנו ואחרים יישמנו את טכניקת ניתוח התאים השלמים הזו על תאים אוקריוטיים. יישומים רבים עשויים להיגזר מטכניקה זו: (1) לזהות את סוגי התאים העיקריים ממדגם מעורב9-11; (2) להעריך את הכדאיות של תרביות תאים לאורך זמן (כולל בקרת איכות, יישומים תעשייתיים)12; (3) לנטר מצבי הפעלה של תא בודד מסוג13; (4) להעריך את הטרנספורמציה הממאירה של מדגם קליני14,15.

כאן, אנו מתארים את השימוש ב-MALDI-TOF MS של תאים שלמים כדי לחקור את פנוטיפים הקיטוב השונים של מקרופאגים בתגובה לציטוקינים או חיידקים שנהרגו בחום. מקרופאגים ממלאים תפקיד מרכזי בתגובה החיסונית לפתוגנים מיקרוביאליים. הם מזהים גורמים זיהומיים ברקמות באמצעות קולטנים לזיהוי דפוסים המסוגלים לזהות דפוסים מיקרוביאליים משומרים, כגון ליפופוליסכריד (LPS)16. מקרופאגים הם תאים מקצועיים המציגים אנטיגן המקיימים אינטראקציה עם תאי T כדי להגביר את התגובה החיסונית הנרכשת. תאי T משפיעים על מקרופאגים על ידי שחרור ציטוקינים המחזקים או מווסתים את פעילות קוטלי המיקרופגים של מקרופאגים. באנלוגיה לקיטוב הלימפוציטים Th1/Th2, מקרופאגים דלקתיים, קוטלי חיידקים וקוטלי גידולים סווגו למקרופאגים M1 ומקרופאגים מווסתים חיסוניים כמקרופאגים M217-19. המונח M1 מתייחס להפעלה קלאסית של מקרופאגים על ידי ציטוקינים מסוג I, כגון אינטרפרון (IFN)-γ וגורם נמק גידול (TNF), או תוצרי חיידקים, כגון LPS18,20-23, בעוד שמקרופאגים המופעלים על ידי מסלולים חלופיים (אינטרלוקין (IL)-4, IL-10, Transforming Growth Factor-β1 נחשבים למקרופאגים M219,24,25. הפלסטיות הפנוטיפית והתפקודית הגבוהה של מקרופאגים בתגובה למיקרו-סביבה שלהם הופכת את המקרופאגים הללו לשימושיים לניתוח שינויים עדינים על ידי גישת MALDI-TOF MS.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

בפרוטוקול הנוכחי, טכניקת MALDI-TOF של כל התא משמשת להשגת ספקטרום מסה הנחשב כטביעת אצבע של הדגימה. ניתוח ביואינפורמטי איפשר השוואה וסיווג של טביעות אצבע אלה. בפרוטוקול זה היו שלושה חלקים עיקריים:

  1. הכנת הדגימות הביולוגיות: בקרה על מקרופאגים ומקרופאגים מגורים עם אגוניסטים שונים.
  2. הניתוח של כל סוג של דגימה עם שכפולים טכניים על ידי MALDI-TOF MS של תא שלם.
  3. ניתוח ביואינפורמטי של נתונים גולמיים.

הכן פתרונות סטריליים לבידוד תאים ולתרבית. הכן ואחסן את כל הריאגנטים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס

1. הכנת מונוציטים אנושיים

  1. הכן מדיום תרבית תאים. יש להוסיף 55 מ"ל של סרום AB+ אנושי או סרום בקר עוברי (FBS) ו-5 מ"ל של תמיסת אנטיביוטיקה (פניצילין ב-10,000 UI/ml וסטרפטומיצין ב-10,000 מיקרוגרם/מ"ל; ריכוז סופי של 100 UI/ml לפניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל לסטרפטומיצין) ל-RPMI 1640 בינוני (500 מ"ל).
    1. לבודד תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMCs) מלויקופאקים (תרכיזי לויקוציטים).
      1. הכינו 50 מ"ל צינורות המכילים 15 מ"ל Ficoll. לדלל את הדם במי מלח (vol/vol, 1/10). הפקידו 30 מ"ל PBMCs מדוללים ב-Ficoll כפי שתואר קודם לכן26.
      2. צנטריפוגה ב-700 x גרם למשך 20 דקות. שחזר PBMCs בממשק בין Ficoll (צפיפות של 1.077 גרם/מ"ל) לפלזמה מדוללת. מדללים PBMCs במדיום תרבית וצנטריפוגה ב -300 x גרם למשך 5 דקות.
    2. הכן מונוציטים CD14+ מ-PBMCs באמצעות חרוזים מגנטיים המצופים בנוגדנים נגד CD14.
      הערה: יש לשמור את המוצרים והתאים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד להתייצבות מונוציטים.
      1. הכן מאגר רץ המורכב מ-pH 7.2 של מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS), 0.5% אלבומין בסרום בקר (BSA) וחומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA) של 2 מ"מ.
      2. נתק בעדינות PBMCs עם כדורים (107 תאים לבדיקה) ל-80 מיקרוליטר של מאגר פועל.
      3. הוסף 20 מיקרוליטר CD14 MicroBeads ל-PBMCs. מערבבים ודוגרים PBMCs למשך 15 דקות. שטפו PBMCs עם 5 מ"ל של מאגר רץ וצנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות. פרק בעדינות PBMCs עם כדורים ל-500 מיקרוליטר של מאגר פועל עבור 108 PBMCs.
        הערה: השתמש ב-500 מיקרוליטר של מאגר רץ עבור ריכוזי PBMC נמוכים מ-108 PBMCs.
      4. המשך להפרדה מגנטית.
        הערה: עבור פחות מ-2 x 108 PBMCs, השתמש בעמודת MS; עבור יותר מ-2 x 108 PBMCs ופחות מ-2 x 109 PBMCs, השתמש בעמודת LS.
      5. שטפו את העמודה הקדמית והעמודה עם מאגר רץ (500 מיקרוליטר לעמודת MS או 3 מ"ל לעמודת LS).הוסף PBMCs לעמודה המקדימה (המתן עד שתאים ללא תווית יעברו דרך העמודה). יש לשטוף 3 פעמים עם מאגר פועל (500 מיקרוליטר לעמודת MS או 3 מ"ל לעמודת LS). הסר את העמודה המקדימה.
      6. הנח את העמוד על צינורות של 15 מ"ל. הוסף מאגר רץ (1 מ"ל לעמודת MS או 5 מ"ל לעמודת LS) על העמודה והסר תאי CD14+ על ידי הפעלת לחץ על העמודה.
      7. צנטריפוגה את ה-eluate ב-300 x g למשך 5 דקות. שטפו גלולת מונוציטים עם 10 מ"ל מדיום תרבית.
        הערה: נתח את טוהר הכנת המונוציטים באמצעות נוגדנים נגד CD14 וזרימה ציטומטרית (גבוהה קלאסית מ-95%).
  2. בידול מונוציטים למקרופאגים.
    1. דגירה של מונוציטים (106 מונוציטים לבאר ב-6 צלחות באר) ב-3 מ"ל של מדיום תרבית המכיל 10% סרום אנושי AB+ ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר 4 ימים, החלף את מדיום התרבית המכיל סרום אנושי במדיום תרבית של 3 מ"ל המכיל 10% FBS למשך 3 ימים נוספים.
    2. זהה את אוכלוסיית התאים המתקבלת כמקרופאגים שמקורם במונוציטים (MDMs) על ידי זרימה ציטומטרית (ראה איור 1).
      1. החלף את מדיום התרבות ב -3 מ"ל PBS. גרד MDM עם שוטר גומי ואסוף מתלי MDM. צנטריפוגה ב-400 x גרם למשך 5 דקות. הוסיפו PBS המכיל 2% BSA ל-MDMs עם כדורים וערבבו בעדינות את תרחיף התאים. התאם את ריכוז התאים (10-6 MDMs ב-200 מ"ל PBS) ודגירה ב-4 מעלות צלזיוס.
      2. הוסיפו 10 מ"ל נוגדנים נגד CD14 ו-10 מ"ל נוגדנים נגד CD68 לתרחיף MDM ודגרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות בחושך><. הערה: יש לסמן נוגדנים אלה בשני פלואורוכרומים שונים התואמים לניתוח ציטומטריית זרימה. לדוגמה, נוגדנים נגד CD14 עשויים להיות מצומדים עם פיקואריתרין בשילוב (לצביעה של מונוציטים) ונוגדנים נגד CD68 עם Alexa Fluor 647 (לצביעה של מקרופאגים).
      3. צנטריפוגות MDM ב-400 x גרם למשך 5 דקות. הסר סופרנטנטים. יש לפרק בעדינות את גלולת התא ולדגור MDM ב-250 מ"ל 3% פרפורמלדהיד (PFA) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה MDM קבועה PFA ב-400 x גרם למשך 5 דקות. שטפו MDM עם PBS 3 מ"ל וצנטריפוגות MDM ב-400 x גרם למשך 5 דקות. יש להפריד בעדינות את כדור ה-MDM ב-400 מ"ל PBS.
      4. נתח את ההתמיינות של מונוציטים (המבטאים CD14 אך לא CD68) למונוציטים (המבטאים CD68 אך לא CD14). הערה: באופן קלאסי יותר מ-95% מהתאים הם MDM.
  3. גירוי של 18 שעות של MDM.
    1. החלף את אמצעי התרבית של MDMs דבקים במדיום תרבית טרי של 3 מ"ל (המכיל 10% FBS).
    2. כדי לגרום לקיטוב M1 או M2, השתמש בציטוקינים הרקומביננטיים האנושיים הבאים: IFN-γ ו-TNF לקיטוב M1, ו-IL-4 לקיטוב M2. מקרופאגים M1 מתקבלים גם על ידי גירוי עם LPS. שימו לב שתמיסות מלאי של ציטוקינים נשמרות ב-80 מעלות צלזיוס וכי תמיסת המלאי של LPS נשמרת ב-20 מעלות צלזיוס.
      1. יש לדלל את תמיסת המלאי של IFN-gγ (1 מ"ג/מ"ל) ב-1/100 בתרבית כדי לקבל דילול של 10 ננוגרם/מ"ל. יש להוסיף 6 מיקרוליטר של דילול IFN-γ זה ל-MDMs כדי לקבל ריכוז IFN-γ סופי של 20 ננוגרם/מ"ל.
      2. יש לדלל את תמיסת המלאי של TNF (1 מ"ג/מ"ל) ב-1/100 בתרבית כדי לקבל דילול של 10 ננוגרם/מ"ל. יש להוסיף 6 מיקרוליטר של דילול TNF זה ל-MDM כדי לקבל ריכוז TNF סופי של 20 ננוגרם/מ"ל.
      3. יש לדלל את תמיסת המלאי של IL-4 (1 מ"ג/מ"ל) ב-1/100 בתרבית כדי לקבל דילול של 10 ננוגרם/מ"ל. יש להוסיף 6 מיקרוליטר של דילול IL-4 זה ל-MDM כדי לקבל ריכוז סופי של IL-4 של 20 ננוגרם/מ"ל.
      4. הוסף 3 מיקרוליטר מתמיסת המלאי של LPS (1 מ"ג/מ"ל) ל-MDM כדי לקבל ריכוז LPS סופי של 1 מיקרוגרם/מ"ל.
    3. כדי לעורר MDM עם חיידקים, השתמש בחיידקים המומתים בחום. שטפו חיידקים חיים עם PBS וחממו אותם בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך שעה. השתמשו ב-Orientia tsutsugamushi (זן Kato (CSUR R163), Mycobacterium bovis (Bacillus Calmette-Guérin, BCG CIP זן 671203) ו-Coxiella burnetii (Nine Mile בשלב I) מכיוון שפתוגנים אלה ידועים כמדביקים מקרופאגים. לפיכך, הכינו תרחיף O. tsutsugamushi ב-109 חיידקים למ"ל. הוסף 50 מיקרוליטר ל- MDM . חזור על אותו שלב עבור M. bovis ו- C. burnetii.
  4. הכנת דגימות ביולוגיות ל-MALDI-TOF MS.
    1. שטפו MDMs מגורים עם PBS ללא Ca2+ או Mg2+ (תאים עשויים להצטבר בנוכחות Ca2+ או Mg2+). גרד MDM עם שוטר גומי ואסוף מתלי MDM. צנטריפוגות MDM. יש לשטוף שוב MDM ב-PBS ללא Ca2+ או Mg2+ ב-400 x g למשך 5 דקות כדי להיפטר מזיהום FBS.
    2. התאם את ריכוז התאים (2 x 106 MDM לכל בדיקה). צנטריפוגות MDM ב-400 x גרם למשך 5 דקות והשליכו סופרנטנטים. אסוף כדורי תאים ב-20 מיקרוליטר של PBS ללא Ca2+ או Mg2+.
    3. נתח דגימות מיד או אחסן אותן ב-PBS בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לפני הניתוח.

2. ניתוח מקרופאגים על ידי Maldi-TOF MS של תא שלם

  1. הכנת מטריצת CHCA.
    1. הוסף לבקבוקון 500 מיקרוליטר של אצטוניטריל, 250 מיקרוליטר 10% חומצה טריפלואורואצטית ו-250 מיקרוליטר של מים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) בעלי ביצועים גבוהים. יש לדלל 10 מ"ג CHCA בתמיסה זו לריכוז סופי של 10 מ"ג/מ"ל. מערבבים וסוניקציה למשך 20 דקות לפחות.
      הערה: סוניקציה תשפר את הרוויה של המטריצה אך שלב זה אינו חובה.
    2. צנטריפוגה ב-13,000 x גרם למשך 5 דקות. השליכו את הכדור ושמרו את ה-supernatant.
      הערה: הכינו את תמיסת המטריצה ממש לפני השימוש. תמיסת מטריצה המכילה גבישים אינה מאפשרת יינון טוב של מולקולות הדגימה, והדבר עלול להשפיע על איכות הספקטרום.
  2. הכנת יעד פלדה MALDI.
    1. הרטיבו את מטרת הפלדה המלוטשת במי ברז חמים. משפשפים בנייר ניגוב מדויק. מוסיפים 70% אתנול ומשפשפים. שוטפים במים על ידי שפשוף. מוסיפים 70% אתנול ומשפשפים בנייר מדויק.
    2. טבלו את המטרה ב-70% אתנול וסוניקט למשך 15 דקות לפחות. כסו את המטרה ב-500 מיקרוליטר עד 1 מ"ל של חומצה טריפלואורואצטית ב-80%. משפשפים ומנגבים בנייר מדויק. יש לשטוף במי HPLC מבלי לשפשף. יבש את המטרה בטמפרטורת החדר.
      הערה: מטרה לא מנוקה כראוי עלולה להשפיע על איכות הספקטרום.
  3. הכנת פיקדונות.
    1. הנח את המטרה הנקייה על תמיכה אופקית ומישורית כדי להשיג משקעים אחידים.
    2. הפשירו בעדינות דגימות MDM על קרח. הערה: הפשרה מהירה ונמרצת עלולה לשנות דגימות, ובכך להשפיע על איכות הספקטרום. הומוגניזציה של MDMs (על ידי פיפטינג קדימה ואחורה של תרחיף התאים) לפני שקיעה של 1 מיקרוליטר (המכיל כ-1 x 105 תאים) על מטרת MALDI. הוסף 1 מיקרוליטר של תמיסת מטריצת MALDI על המדגם. הימנע מנקודת ערבוב עם הפיפטה. ערבוב כתמים עם פיפטות משנה את איכות הספקטרום. להוציא 12-16 דגימות/בדיקה (שכפולים טכניים).
    3. מתאדים באופן ספונטני בטמפרטורת החדר. הערה: האידוי מתרחש בהדרגה ומוביל להיווצרות גבישי מטריצה/דגימה. ניתן לנתח את המשקעים באופן מיידי או לאחסן אותם בחושך במשך מספר ימים לפני הניתוח (עד שבועיים).
    4. על המשתמש לשלוט בכך שהציטוקינים או החיידקים המומתים בחום ששימשו בניסוי אינם מספקים שיאים בטווח הספקטרום של מקרופאגים מגורים. כאן, בדקנו שהציטוקינים והחיידקים שנהרגו בחום לבדם לא סיפקו שום אות בטווח הנחקר (0-20 kDa).
  4. כוונון ספקטרומטר מסה ורכישת נתונים.
    1. הכנס את מטרת הפלדה המכילה דגימות בספקטרומטר המסה.
    2. הגדר את ספקטרומטר המסה והפעל רכישת נתונים. השתמש בתצורת ברירת המחדל לרכישה אוטומטית של הנתונים.
    3. הערה: תצוגה מפורטת של התצורה של תוכנת flexControl ניתנת בנספח/טבלה 1. זה עשוי להשתנות בהתאם לספקטרומטר המסה ולתוכנה בה נעשה שימוש.

3. ניתוח ביואינפורמטי

הערה: הניתוח הביואינפורמטי בוצע באמצעות תוכנת הניתוח הסטטיסטי החינמית והקוד הפתוח R, יחד עם ספריות ניתוח ספציפיות (MALDIquant). ניתן להוריד את R באופן חופשי מאתר האינטרנט שלה http://cran.r-project.org/. תיאור מפורט של קובץ ה- Script מסופק כ- חומר משלים.

  1. טעינה וטיפול מקדים בנתונים גולמיים.
    1. אחסן נתונים גולמיים במחשב המשויך לספקטרומטר המסה במספר קבצים ותיקיות. אחזר את תיקיית השורש של הניסוי עם כל תיקיות המשנה. העתק את תיקיית השורש למחשב האישי לצורך ניתוח.
    2. השתמש בספריות readBrukerFlexData ו-MALDIquant כדי לטעון ולנתח נתונים גולמיים.
      הערה: readBrukerFlexData מאפשר טעינת נתונים גולמיים מספקטרומטר המסה לאובייקט ספציפי ב-R לצורך ניתוח נוסף. ראה תיאור MALDIquant למידע נוסף27.
    3. ניתוח ספקטרום שנוצר.
      הערה: כל ספקטרום מורכב מרשימה של פסגות עם המסות והעוצמות שלהן (שפע יחסי). השתמש בשורש הריבועי של העוצמות כדי לשפר את ההדמיה הגרפית של הספקטרום. תקן את הרקע באמצעות אלגוריתם חיתוך שיא לא ליניארי רגיש לסטטיסטיקה להערכת קו בסיס27. השתמש ביחס אות לרעש של 6 כדי לזהות פסגות. קחו בחשבון שהפסגות שזוהו דומות על פני הספקטרום כאשר ערכי המסה/מטען (m/z) נמצאים בתוך חלון של 2,000 עמודים לדקה.
  2. הגדרת ציון וחישוב. סווג את הספקטרום באמצעות אשכולות היררכיים עם אלגוריתם מחלקה לצבירה ומטריצת אי-דמיון המבוססת על מרחק Jaccard.
    הערה: מדד ז'קארד מודד את הדמיון בין קבוצות דגימה בוליאניות (כלומר נוכחות/היעדר רשימת פסגות).
  3. השוואה בין ספקטרום וצפייה.
    1. נתח עלילות ספקטרום גולמיות. הערה: ציר x מייצג את יחס m/z (ב-Daltons) וציר ה-y מייצג את העוצמה (שפע יחסי).
    2. העריכו את הדמיון בין ספקטרום על ידי אשכולות היררכיים. מייצגים דמיון (או סטייה) כדנדרוגרמה.
    3. העריכו את יכולת השחזור באמצעות ייצוג תצוגת ג'ל וירטואלית. הערה: ייצוג תצוגת ג'ל וירטואלי הוא עלילת מפת חום שונה שבה השפע היחסי מקודד בצבע עם עוצמות הולכות וגדלות של כחול.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מטרת הפרוטוקול הנוכחי היא להדגים את הדיוק של MALDI-TOF MS של תאים שלמים להערכת התגובתיות של מקרופגים לסביבתם המיקרוסקופית.

איור 1 מתאר את הכנתם של מקרופאגים מעוררים מדגימות דם. איור 2 מציג את הניתוח של מונוציטים ו-MDMs באמצעות ציטומטריה של זרימה. שימו לב כי מונוציטים ביטאו CD14 אך לא CD68 (איור 1A). בניגוד לכך, MDMs ביטאו CD68 אך לא CD14 (איור 1B).

איור 3 מתאר את העיקרון של MALDI-TO...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מתאר את השימוש ב-MALDI-TOF-MS על תאים שלמים אוקריוטיים. כאן, אנו מדגימים את הדיוק של השיטה על ידי ניתוח מצבי ההפעלה המרובים של מקרופאגים בתגובה למיקרו-סביבה שלהם.

הצלחת הפרוטוקול מסתמכת על כמה צעדים קריטיים. ראשית, כל מזהם תמיסה עשוי לשנות את הספקטרום. לדוגמה, חשוב לשטוף תאים ב-PBS כדי להסיר מדיום תרבית וחלבוני סרום לפני התצהיר על המטרה. יש צורך גם בריכוז תאים של 1 x 105 תאים/מיקרוליטר כדי להבטיח תוצאות הניתנות לשחזור. שנית, ההתגבשות היא שלב חשוב בפרוטוקול. כדי להבטיח תו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגוד אינטרסים להצהיר עליהם. RO, JLM ו-CC הם ממציאים של פטנט בינלאומי WO 2011/154650, בשם "Procédé d'identification de cellules de mammifères par spectrométrie de masse MALDI-TOF".

תודות

Richard Ouedraogo נתמך על ידי מענק ממשרד הבריאות של סאנטה (PHRC 2010). אנו מודים ללורן גורוול, כריסטוף פלודרופס וניקולס אמסטרונג על הסיוע הטכני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

מקורות

  1. Mass Gross, J. Spectrometry: A Textbook. , Springer-Verlag. Berlin. (2011).
  2. Villanueva, J., et al. Serum Peptide Profiling by Magnetic Particle-Assisted, Automated Sample Processing and MALDI-TOF Mass Spectrometry. Anal. Chem. 76 (6), 1560-1570 (2004).
  3. Diamandis, E. P. Mass Spectrometry as a Diagnostic and a Cancer Biomarker Discovery Tool Opportunities and Potential Limitations. Molec. Cell. Proteomics. 3 (4), 367-378 (2004).
  4. Pusch, W., Kostrzewa, M. Application of MALDI-TOF Mass Spectrometry in Screening and Diagnostic. 11 (20), 2577-2591 (2005).
  5. Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).
  6. Domon, B., Aebersold, R. Mass Spectrometry and Protein Analysis. Science. 312 (5771), 212-217 (2006).
  7. Carbonnelle, E., et al. Robustness of two MALDI-TOF mass spectrometry systems for bacterial identification. J. Microbiol. Methods. 89 (2), 133-136 (2012).
  8. Bizzini, A., Jaton, K., Romo, D., Bille, J., Prod’hom, G., Greub, G. Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization–Time of Flight Mass Spectrometry as an Alternative to 16S rRNA Gene Sequencing for Identification of Difficult-To-Identify Bacterial Strains. J. Clin. Microbiol. 49 (2), 693-696 (2011).
  9. Buchanan, C. M., Malik, A. S., Cooper, G. J. S., et al. Direct visualisation of peptide hormones in cultured pancreatic islet alpha- and beta-cells by intact-cell mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 21 (21), 3452-3458 (2007).
  10. Ouedraogo, R., Flaudrops, C., Ben Amara, A., Capo, C., Raoult, D., Mege, J. -L. Global analysis of circulating immune cells by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. PloS One. 5 (10), 13691 (2010).
  11. Munteanu, B., von Reitzenstein, C., Hänsch, G. M., Meyer, B., Hopf, C. Sensitive robust and automated protein analysis of cell differentiation and of primary human blood cells by intact cell MALDI mass spectrometry biotyping. Anal. Bioanal. Chem. 404 (8), 2277-2286 (2012).
  12. Feng, H., Sim, L. C., Wan, C., Wong, N. S. C., Yang, Y. Rapid characterization of protein productivity and production stability of CHO cells by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 25 (10), 1407-1412 (2011).
  13. Ouedraogo, R., Daumas, A., Ghigo, E., Capo, C., Mege, J. -L., Textoris, J. Whole-cell MALDI-TOF MS: A new tool to assess the multifaceted activation of macrophages. J. Proteomics. 75 (18), 5523-5532 (2012).
  14. Amann, J. M., et al. Selective profiling of proteins in lung cancer cells from fine-needle aspirates by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin. Cancer Res. 12 (17), 5142-5150 (2006).
  15. Maurer, K., Eschrich, K., Schellenberger, W., Bertolini, J., Rupf, S., Remmerbach, T. W. Oral brush biopsy analysis by MALDI-ToF Mass Spectrometry for early cancer diagnosis. Oral Oncol. 49 (2), 152-156 (2013).
  16. Ishii, K. J., Koyama, S., Nakagawa, A., Coban, C., Akira, S. Host innate immune receptors and beyond: making sense of microbial infections. Cell Host Microbe. 3 (6), 352-363 (2008).
  17. Mantovani, A., Sica, A., Locati, M. Macrophage polarization comes of age. Immunity. 23 (4), 344-346 (2005).
  18. Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Front. Biosci. 13, 453-461 (2008).
  19. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat. Rev. Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
  20. Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat. Rev. Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).
  21. Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. -L. Macrophage polarization in bacterial infections. J. Immunol. 181 (6), 3733-3739 (2008).
  22. Biswas, S. K., Sica, A., Lewis, C. E. Plasticity of macrophage function during tumor progression: regulation by distinct molecular mechanisms. J. Immunol. 180 (4), 2011-2017 (2008).
  23. Cassetta, L., Cassol, E., Poli, G. Macrophage polarization in health and disease. Sci. World J. 11, 2391-2402 (2011).
  24. Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3 (1), 23-35 (2003).
  25. Mantovani, A., Sica, A., Sozzani, S., Allavena, P., Vecchi, A., Locati, M. The chemokine system in diverse forms of macrophage activation and polarization. Trends Immunol. 25 (12), 677-686 (2004).
  26. Delaby, A., Gorvel, L., et al. Defective monocyte dynamics in Q fever granuloma deficiency. J. Infect. Dis. 205 (7), 1086-1094 (2012).
  27. Gibb, S., Strimmer, K. MALDIquant: a versatile R package for the analysis of mass spectrometry data. Bioinformatics. 28 (17), 2270-2271 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

בידוד מונוציטיםתאים חיוביים ל-CD14ציטומטריה זרימההכנת מצע ל-MALDIמטריצת CHCAניתוח ספקטרליהבחנה בין M1 ל-M2
ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF של תא שלם היא שיטה מדויקת ומהירה לניתוח מצבים שונים של הפעלת מקרופאגים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.