הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

השתלת Subretinal של MACS מטוהרים פוטורצפטור קודמן תאים לתוך הרשתית עכבר בוגר

10.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50932

⸱

22 בפברואר 2014

 ,  ,  , 
1CRTD / DFG-Research Center for Regenerative Therapies Dresden, Technische Universität Dresden

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

השתלת תאים מייצגת אסטרטגיה לטיפול ניוון רשתית המאופיינת על ידי אובדן פוטורצפטור. כאן אנו מתארים שיטה להעשרת פוטורצפטורים הניתנים להשתלה והשתלתם התת-קרקעית בעכברים בוגרים.

תקציר

ליקוי ראייה ועיוורון עקב אובדן תאי חישת האור של הרשתית, כלומר פוטורצפטורים, מייצגים את הסיבה העיקרית לנכות במדינות המתועשות. החלפת פוטורצפטורים מנוון על ידי השתלת תאים מייצגת אפשרות טיפול אפשרית ביישומים קליניים עתידיים. ואכן, מחקרים פרה-קליניים אחרונים הראו כי פוטורצפטורים לא בוגרים, מבודדים מהרשתית של עכבר יילודים ביום 4 שלאחר הלידה, יש פוטנציאל להשתלב ברשתית העכבר הבוגרת לאחר השתלת תת-רשתית. תאים תורמים יצרו מורפולוגיה פוטורצפטורית בוגרת הכוללת מקטעים פנימיים וחיצוניים, גוף תא עגול הממוקם בשכבה הגרעינית החיצונית, ומסופים סינפטיים בסמיכות לתאים דו קוטביים אנדוגניים. ואכן, דיווחים אחרונים הראו כי פוטורצפטורים תורמים משתלבים באופן פונקציונלי במעגלים העצביים של עכברים מארחים. עבור יישום קליני עתידי של גישה כזו החלפת תאים, השעיות מטוהרות של התאים של בחירה צריך להיווצר ולהציב בעמדה הנכונה עבור שילוב תקין לתוך העין. להעשרה של מבשרי פוטורצפטור, המיון צריך להיות מבוסס על אנטיגנים ספציפיים משטח התא כדי למנוע שינוי כתב גנטי של תאים תורמים. כאן אנו מראים מיון תאים הקשורים מגנטית (MACS) - העשרה של מבשרי מוט מושתל photoreceptor מבודד מן הרשתית יילודים של עכברי כתב ספציפי photoreceptor מבוסס על סמן פני התא CD73. דגירה עם נוגדנים נגד CD73 ואחריו נוגדנים משניים מצומדים מיקרו חרוזים אפשרו העשרה של מבשרי פוטורצפטור מוט על ידי MACS לכ -90%. בהשוואה cytometry זרימה, MACS יש את היתרון כי זה יכול להיות קל יותר להחיל על תקני GMP וכי כמויות גבוהות של תאים ניתן למיין בתקופות זמן קצר יחסית. הזרקת השעיות תאים מועשרות לחלל התת-קרקעי של עכברים בוגרים מסוג פראי הביאה לשיעור אינטגרציה גבוה פי 3 בהשוואה למתלי תאים לא ממוינים.

מבוא

חזון הוא אחד החושים העיקריים של בני האדם. פגיעה בתחושה זו ועיוורון הם אחת הסיבות העיקריות לנכות במדינות המתועשות. הסיבה העיקרית לליקוי ראייה או עיוורון היא ניוון רשתית, המאופיינת באובדן תאים פוטורצפטורים, שכן ניתן לראותה בניוון מקולרי, רטיניטיס פיגמנטוזה, ניוון חרוט-מוט ותנאים אחרים. נכון להיום, טיפול יעיל כדי לשחזר את הראייה שאבדו אינו זמין. בשנים 2006 ו -2008 שתי מעבדות שונות דיווחו, ללא תלות זו בזו, השתלה מוצלחת של תאי מבשר פוטורצפטור מוט לעכברים מסוג פראי בוגר רשתית1,2. לכן, הנובעים האפשרות של השתלת תא מבשר photoreceptor גם לתוך רשתית מנוונת, להחליף פוטורצפטורים מנוונים ולשחזר את הראייה. אכן, הוכח לאחרונה, כי תאים מבשר פוטורצפטור מושתלים כאלה מעוררים קריטריונים מורפולוגיים של קולטני פוטורצפטורים מסוג פראי בוגרים, כגון מקטעים החיצוניים שפותחו כראוי3, מסופים סינפטיים בסמיכות לתאים דו קוטביים אנדוגניים וגוף תא עגול הממוקם בשכבה הגרעינית החיצונית2-4, כמו גם את היכולת להשתלב באופן פונקציונלי במעגלים העצביים המארחים5-7. אחד העקרונות העיקריים של אסטרטגיה זו הוא השימוש ביום שלאחר הלידה 4 (PN 4, PN0 מוגדר כיום לידה) רשתית עכברים צעירים, וכתוצאה מכך תערובת של סוגי תאים שונים להשתלה. על רקע יישום טיפולי בעתיד, תערובת זו צריכה להיות מטוהרת עבור תאים מבשר photoreceptor. CD73 תוארה כסמן פני התא הראשון הספציפי עבור פוטורצפטורים צעירים ברשתית8-10. כאן, אנו מדגימים שיטת טיהור תאים מבשר פוטורצפטור המבוססת על סמן משטח תא זה ועם השימוש בטכניקת מיון התאים המגנטיים (MACS). ל- MACS עשויים להיות יתרונות בהשוואה לטכניקות מיון תאים המופעלות על-ידי פלואורסצנט, עקב זמני מיון מהירים והתאמה קלה יותר לתנאי GMP. אנחנו יכולים להדגים העשרה של ~ 90% ושיעור אינטגרציה גבוה פי 3 בעת השתלת האוכלוסייה המועשרת לחלל התת-קרקעי ברשתיות מסוג בר למבוגרים. לכן, MACS מבוססי photoreceptor הקדמה העשרת תאים השתלה subretinal, הם טכניקות אמינות ומבטיחות לפיתוח אסטרטגיה טיפולית רגנרטיבית לטיפול ניוון רשתית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

שימוש אתי וטיפול בבעלי חיים הצהרה:

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לחוקי האיחוד האירופי והחוקים הגרמניים (Tierschutzgesetz) ודבקו בהצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וחזון. כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה לבעלי חיים של TU דרזדן ואת לנדסדריקציה דרזדן (מספר אישור: 24D-9168.11-1/2008-33).

1. לפני תחילת ניתוק תאים ומיון תאים

  1. תווית שלושה צינורות תגובה 15 מ"ל עם: לשטוף (W), שבר חיובי (+) ושבר שלילי (-).

2. דיסוציאציה של רשתית

  1. ערפו את ראשם של גורי PN 4 בעזרת מספריים.
  2. לשטוף את הראש של הגורים זמן קצר 70% אתנול ואחריו כביסה PBS.
  3. מעבירים את הראש ל- HBSS קר ומעבירים את העין (חזרו על שלב זה לכל הראשים). כדי להסתגר, לפתוח את העפעפיים ולקבע את העין עם מלקחיים מעוגלים באזור עצב הראייה. ואז למשוך את העין בזהירות מחוץ למסלול.
  4. לאחר קיזוז כל העיניים, לבודד את הרשתית: להציג מספריים סגורים לתוך עצב הראייה ולפתוח את הלהבים. Peal RPE / chorid החוצה. הסר את העדשות וכלי הדם באמצעות מלקחיים מעוגלים.
  5. מעבירים את הרשתית המבודדת לצינור תגובה של 1.5 מ"ל המכיל את פתרון הפפאין (המסופק על ידי ערכת ניתוק הפפאין).
  6. דגירה הרשתיות בתמיסת פפאין במשך 30-60 דקות באמבט מים או שייקר (400 סל"ד) ב 37 מעלות צלזיוס.
    1. בעוד רטינות דגירה בתמיסת פפאין, פיפטה 1 מ"ל של פתרון ovomucoid צינור תגובה 15 מיליליטר (תווית "1").
    2. הוסף 60 μl של DNase I (10 מ"ג / מ"ל) + 60 μl של פתרון ovomucoid (מסופק על ידי הערכה) + 520 μl של EBSS לצינור תגובה 15 מ"ל (תווית "2").
  7. לאחר דגירה פפאין, להעביר את פתרון פפאין המכיל את הרשתית מתעכל חלקית צינור תגובה "2".
  8. באמצעות פיפטה מלוטשת אש, לבצע ניתוק מכני (10x למעלה ולמטה).
  9. פיפטה השעיית תא יחיד לצינור תגובה "1". נסה ליצור 2 שכבות על ידי שכבות בעדינות את המתלה התא על גבי הפתרון ovomucoid.
  10. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-300 x גרם (כ-1,300 סל"ד).
  11. השלך את supernatant ו resuspend התאים ב 500 μl של מאגר MACS.

3. מיון תאים באמצעות מיון תאים משויך מגנטי (MACS)

  1. הוסף נוגדן נגד CD73 עכברוש X μl ל 500 μl על מנת להשיג ריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מיליליטר.
  2. דגירה 5 דקות על קרח.
  3. מלאו את צינור התגובה של 15 מ"ל ל-10 מ"ל עם חיץ MACS וצנטריפוגה למשך 5 דקות במהירות של 300 x גרם.
  4. הסר את העל-טבעי.
  5. Resuspend גלולה ב 480 μl MACS חוצץ ולהוסיף 120 μl של עז נגד חולדה IgG microbeads.
  6. דגירה 15 דקות על קרח; אין להתסיס, לנער או לערבב אותו.
  7. מלאו את צינור התגובה של 15 מ"ל ל-5 מ"ל עם חיץ MACS וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב-300 x גרם.
  8. כמו צינור התגובה הוא צנטריפוגה:
    1. כוונן עמודת LS לתוך המעמד המגנטי.
    2. הצב את מסנן קדם-השילוח מעל עמודת ה- LS.
    3. לחות את מסנן preseparation ואת עמודת LS עם 3 מיליליטר MACS מאגר ולאסוף את מאגר MACS לתוך הצינור לשטוף (W).
  9. הסר את העל-טבעי.
  10. Resuspend גלולה ב 500 μl MACS מאגר.
  11. לטעון את השעיית התא 500 μl למסנן, ולאחר מכן להוסיף 1 מיליליטר MACS מאגר למסנן ולאסוף את השבר השלילי לתוך צינור התגובה שבר שלילי (-).
  12. לאחר מכן, הוסף 3 x 3 מ"ל של מאגר MACS לעמודה כדי לשטוף את התאים שאינם מאוגדים לעמודה
  13. לאחר אלה 9 מיליליטר הם דרך עמודת LS, להסיר את העמודה מן המעמד המגנטי ולהתקין אותו על גבי צינור התגובה שבר חיובי (+).
  14. טען במהירות 5 מ"ל של מאגר MACS בעמודת ה- LS והצב את הכוכנה בעמודת LS והקש עליה כלפי מטה עד שהמאגר כולו יעבור דרך העמודה.
  15. צנטריפוגה צינור התגובה המכיל את השבר החיובי במשך 5 דקות ב 300 x g.
  16. הסר את supernatant, resuspend ב 500 μl של מאגר MACS ולשמור על 4 מעלות צלזיוס.
  17. ספור את הכמות הכוללת של תאים באמצעות התקן נפוץ לספירת תאים.
  18. הכנת השעיית תא מהשבר הממוין החיובי המכיל 2 x 105 תאים/μl במאגר MACS ולשמור על 4 °C (70 °F)

4. השתלה של MAC ממוין פוטורצפטור קודמן תאים לתוך הרשתית של העכבר

  1. הקפד לקבל את כל הפתרונות הבאים מוכנים: 1 מיליליטר סטרילי PBS או HBSS, 10 μl DNAse I, 1-2 מיליליטר סטרילי deionized H2O, aliquots של שברי השעיית התא ב 4 מעלות צלזיוס.
  2. הרדמה של העכבר הבוגר(כלומר 2-4 חודשים) עם הזרקה תוך-אישית של medetomidine הידרוכלוריד (0.01 מ"ג /10 גרם משקל גוף), קטמין (0.75 מ"ג / 10 גרם משקל גוף). לאחר מכן לעשות זריקה תת עורית של Buprenorphine (0.05 מ"ג / קילוגרם משקל גוף) להקלה על הכאב.
  3. תרחיב את התלמידים עם ירידה של פנילפרין 2.5%-טרופיקמיד 0.5%.
  4. תקן את העכבר במחזיק ראש העכבר והנח תחת מיקרוסקופ סטריאו.
  5. החל טיפה של ג'ל Visidic כדי למנוע ייבוש של העין.
  6. לעשות חור קטן בגבול בין סקלרה וקרנית (בהתאמה אורה serrata)באמצעות סטרילי 30 G 1/2 במחט.
  7. חותכים שקופית כיסוי משותפת לחתיכות קטנות (כ-5 מ"מ x 5 מ"מ) באמצעות עט יהלום, מניחים את אחת החתיכות האלה על גבי הקרנית, ומאפשרים הדמיה ישירה של הרשתית.
  8. לשטוף את מזרק microliter מעוקר מספר פעמים עם מים deionized.
  9. לטעון את מזרק microliter עם 1 μl של השעיית התא, מחט ישירה משיקת דרך הלחמית וסקלרה ומניחים תחת שליטה חזותית במחצית האף של הרשתית.
  10. אגרוף בעדינות חור לתוך הרשתית עד להגיע לחלל subretinal, להזריק את המתלה התא לתוך החלל subretinal.
  11. שימו לב לניתוק השוורי של הרשתית, שאמורה להיות אחידה, המכסה כ -1/4 משטח הרשתית ללא דימום.
  12. משוך את המזרק בעדינות, אטמי חור הרשתית באופן אוטומטי.
  13. לשטוף את מזרק microliter מספר פעמים עם מים deionized.
  14. שחרר את העכבר ממחזיק הראש.
  15. הער את העכבר על ידי הזרקת אטיפמוזולה הידרוכלוריד להיפוך של אפקט הידרוכלוריד medetomidine.
  16. מניחים את העכבר לזמן התעוררות בתא כהה וחם (כ 25 °C (60 °F).
  17. ביומיים הבאים לאחר ההשתלה, Buprenorphine (0.05 מ"ג / קילוגרם של משקל גוף) צריך להינתן על ידי הזרקה תת עורית בבוקר ואחר הצהריים להקלה על הכאב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

על מנת להעריך את היכולת של רוד photoreceptors להשתלב ברשתית העכבר, קו כתב העכבר שימש, שבו GFP מונע על ידי רוכסן רשתית עצבית (Nrl, Nrl-GFP) מקדם11. Nrl הוא הסמן המוקדם ביותר של פוטורצפטורים מוט מתחיל את הביטוי שלה ב E12.5 לאורך כל הבגרות, המאפשר תיוג ספציפי של תאים פוטורצפטור מוט התורם.

PN 4 גורי NRL-GFP נערפו והעיניים היו חדורים. לאחר מכן, הרשתית בודדה ונותקו בשיטה שתוארה לעיל. לאחר מכן מוין השעיית התא שנוצרה באמצעות MACS מבוסס CD73 (איורים 1 ו- 2)....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השתלה תת-קרקעית של תאי מבשר פוטורצפטור מייצגת כלי אמין להשגת שילוב של תאים רגישים לאור אלה ברשתיות מארחות במספרים משמעותיים1,2. זה עשוי לאפשר הקמת טיפול בתא לטיפול במחלות ניווניות ברשתית בעתיד6. אוכלוסיית התורמים של תאים, מבודד כיום PN 4 רטינות, היא תערובת של סוגי תאים שונים, שממנו רק תאים מבשר photoreceptor לשלב לאחר הזרקת subretinal. באמצעות מיון MAC מבוסס CD73, ניתן להגדיל את שיעור הפוטורצפטורים בתוך המתלים של תאי התורם ל- ≈ 90% המאפשר שיעור אינטגרציה גבוה פי 3 בערך ברשתיות מארחות מסוג בר בהשוואה לאוכלוסיית התאים הלא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

אנו אוהבים להודות לאנאנד סווארופ על שסיפק לעכברי NRL-GFP, יוכן האס על התמיכה הטכנית, וסינדי בוהם ואמלי לסמן על גידול בעלי חיים.

עבודה זו נתמכה על ידי דויטשה Forschungsgemeinschaft (DFG): FZT 111 - מרכז טיפולים רגנרטיביים דרזדן, תוכנית מענק זרע CRTD, SFB 655, ואת E.V ProRetina. קרן, תוכנית הבוגרים DIGS-BB דרזדן, ואת Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH / BD / 60787/2009)

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מערכת דיסוציאציה פפאיןWorthington Biochemical CorporationLK003150סיפקה DNase I אינו משמש בשיטה
עכברוש מטוהר נגד עכבר CD73, שיבוט TY/23BD Pharmingen550738ריכוז מלאי 0.5 מ"ג/מ"ל
עז נגד חולדות IgG MicroBeadsMiltenyi130-048-501נפח כולל של 2 מ"ל
PBSGibco10010-015משמש לספירת המספר הכולל של התאים
DNase ISigmaD5025-150KU
HBSSGibco14025050 משמש לדיסוציאציה של הרשתית
Trypan blueSigmaFluka93595משמש לספירת המספר הכולל של התאים
VidisicDr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG
DomitorPfizer76579
קטמין 10%רציופארם7538843
אנטיסדאןפייזר76590
פנילפרין 2.5%-טרופיקמיד 0.5%מרפאות אוניברסיטאיות דרזדן בית מרקחת
מסנני הפרדהMiltenyi130-041-407
LS עמודותMiltenyi130-042-401
MACS MultiStandMiltenyi130-042-303
מפריד QuadroMACSMiltenyi130-090-976
זכוכית פולנית אש פסטר פיפטהמותג74777 20הפיפטה' הטיפים צריכים להיות מלוטשים באש ולבצע חיטוי.
מתלה צינורות MACS 15 מ"לMiltenyi130-091-052
תא ספירת תאיםCarl RothT728.1
צינורות סטריליים 15 מ"לGreiner Bio-One188271
Leica M651 MSDLeicaM651 MSDניתן להשתמש במקום Olympus SZX10
Olympus SZX10 Olympus SZX10 Olympus SZX10ניתןלהשתמש במקום Leica M651 MSD
מיקרוסקופ סטריאו הפוך אולימפוס CKX41אולימפוסCKX41
קולט אדים לתרבית תאים Thermo Scientific MSC-AdvanceThermo Scientific51025411
1.5 מ"ל צינור תגובהSarstedt727706400
2 מ"ל צינור תגובהSarstedt72695
צנטריפוגה אפנדורף 5702VWR (Eppendorf)521-0733
מחזיק ראש עכברmyNeurolab471030
BD Microlance 3 30 G 1/2 inBD Pharmingen304000
מזרק מיקרוליטר המילטון 5 ומיקרו; l, 75RNהמילטון065-7634-01נמסר ללא מחטים
המילטון RN מחט מיוחדת 34 Gהמילטון065-207434קהה, אורך 12 מ"מ
Vannas-Tü מספריים קפיציים של bingen - 5 מ"מ להבים ישריםכלי מדע עדינים15003-08
Dumont #7 מלקחיים - טיטניום ביולוגיFine Science Tools11272-40
עט יהלוםTools-tech
15 מ"מ x 15 מ"מ כיסוי מחליקניצוצותMIC3366

מקורות

  1. Bartsch, U., et al. Retinal cells integrate into the outer nuclear layer and differentiate into mature photoreceptors after subretinal transplantation into adult mice. Exp. Eye Res. 86, 691-700 (2008).
  2. MacLaren, R. E., et al. Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors. Nature. 444, 203-207 (2006).
  3. Eberle, D., et al. Outer segment formation of transplanted photoreceptor precursor cells. PLoS One. 7, (2012).
  4. Lakowski, J., et al. Cone and rod photoreceptor transplantation in models of the childhood retinopathy Leber congenital amaurosis using flow-sorted Crx-positive donor cells. Hum. Mol. Genet. 19, 4545-4559 (2010).
  5. Barber, A. C., et al. Repair of the degenerate retina by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 354-359 (2013).
  6. Pearson, R. A., et al. Restoration of vision after transplantation of photoreceptors. Nature. , (2012).
  7. Singh, M. S., et al. Reversal of end-stage retinal degeneration and restoration of visual function by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, (2013).
  8. Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6462-6471 (2011).
  9. Koso, H., et al. CD73, a novel cell surface antigen that characterizes retinal photoreceptor precursor cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 5411-5418 (2009).
  10. Lakowski, J., et al. Effective transplantation of photoreceptor precursor cells selected via cell surface antigen expression. Stem Cells. 29, 1391-1404 (2011).
  11. Akimoto, M., et al. Targeting of GFP to newborn rods by Nrl promoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3890-3895 (2006).
  12. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
  13. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
  14. Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 26, 215-224 (2008).
  15. Lee, M. Y., Lufkin, T. Development of the "Three-step MACS": a novel strategy for isolating rare cell populations in the absence of known cell surface markers from complex animal tissue. J. Biomol. Tech. 23, 69-77 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

MACSCD73
השתלת Subretinal של MACS מטוהרים פוטורצפטור קודמן תאים לתוך הרשתית עכבר בוגר
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.