דרוזופילה מפורסמת המניפולציה הגנטית החזקה שלה, אבל לא להתאמתה של אנליזה ביוכימית לעומק. כאן אנו מציגים הליך מבוסס TAP לזהות שותפים באינטראקציה של כל חלבון של עניין ממוח הזבוב. הליך זה עלול להוביל לאפיקים חדשים של מחקר.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
מסכי גנטיים שנערכו באמצעות דרוזופילה melanogaster (זבוב פירות) יש תגליות אבן דרך רבות בהתקדמות של מדעים ביולוגיים. עם זאת, השימוש במסכים ביוכימי שמטרתה להרחיב את הידע שנצבר מניתוח גנטי שנחקר רק לאחרונה. כאן אנו מתארים שיטה לטיהור החלבון המורכב שמקורביו עם כל חלבון של עניין מראשי זבוב בוגרים. שיטה זו מנצלת את מערכת דרוזופילה Gal4/UAS לבטא חלבון פיתיון התמזגו עם תג טנדם זיקה הטיהור (TAP) בנוירונים זבוב in vivo, ולאחר מכן מיישמת את שני סבבים של טיהור באמצעות הליך TAP דומה לזה שהוקם במקור בשנת שמרי 1 כדי לטהר את החלבון מורכב אינטראקציה. בסופו של הליך זה, תערובת של קומפלקסי חלבונים מרובים מתקבלת אשר מולקולרי זהויות יכולים להיקבע על ידי ספקטרומטריית מסה. אימות של חלבוני המועמד תיהנה מresource וקלות ביצוע מחקרי אובדן של פונקציה בזבובים. ניתן ליישם גישות דומות לרקמות זבוב אחרות. אנו מאמינים כי השילוב של מניפולציות גנטיות וגישת proteomic זה במערכת מודל זבוב בעל פוטנציאל אדיר להתמודדות עם בעיות יסוד בתחום הנוירוביולוגיה ומעבר.
מבוא
הגדרת מסלולים או רשתות המולקולריים שמתווכים תהליך ביולוגי מסוים היא אחת המטרות האולטימטיבית של מחקר ביו. גנטיקאים טוסו הסתמכו רבים על גנטיקה קדימה, במיוחד מתקנים מסכי גנטיים (שניהם משפר והמסכים המדכאים), כדי לזהות גורמים שפועלים יחד, במקביל, או במעלה הזרם או במורד הזרם של גן של עניין. עם זאת, מסכי גנטיקה קדימה לעתים קרובות פעמים לא מצליחים לזהות את הגנים חיוניים אשר, כאשר מוטציה, לגרום הקטלניות בשלבי התפתחות מוקדמים, או גנים עם יתירות פונקציונלית ופיצוי אובדנה של פונקציה היחידה לגרום למומים עדינים שקשה להבקיע. דרך אחת להתגבר על קושי זה היא מסך עבור אינטראקציות בין חלבונים ישירים. במשך יותר מעשור, רשימה הולכת וגדלה של שיטות ביוכ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. צור כטב"מ-מתויג TAP זבובים טרנסגניים
- צור pUAST-מתויג TAP בונה DNA.
- להחליט באיזה צד (N-או C-סופית) של חלבון פיתיון תג TAP יש התמזגו, המבוסס על המבנה / התפקוד של החלבון. ראה דיון לפרטים נוספים.
- Subclone אזור קידוד cDNA של הגן של עניין לאתרים המרובים שיבוט (MCS) של וקטורי pUAST-NTAP או pUAST-CTAP ליצור transgenes כטב"מ-TAP N-או C-מסוף מתויג, בהתאמה. ראה איור 1 עבור מפות מפורטות ואתרי ה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כאן אנו מדגימים המאמץ שלנו בזיהוי חלבוני Highwire-אינטראקציה במוח הזבוב. Highwire (hiw) וhomologues החוליות וחסרי חוליות שלה הם ligases היוביקוויטין ענק המווסתים את ההתפתחות ותיקון של מערכת העצבים 14. הם חולקים מספר תחומים פונקציונליים השמורים ביותר. עם זאת, הפעולות מולקולריות שלהם הן לא לגמרי ברורות. עבודה שנעשתה בתולעת, לעוף ועכבר הוביל למודל העבודה הנוכחי שפונקציות hiw כאנזים E3 וכמו חלבון פיגומים כדי להקל על היווצרות מורכבת ubiquitination רב למקטע, המסדיר פונקציות ע.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שיטת טיהור זיקת טנדם (TAP) מציעה פרוטוקול טיהור כפול המאפשר בידוד והעשרה של קומפלקסי חלבונים באמצעות שני צעדי טיהור זיקה עצמאיים. העיצוב של תג TAP אינו מוגבל למה שמוצג בפרוטוקול זה, תחומים אחרים חלבון מחייב ומוטיבים חלים גם אם תנאי חיץ מותאמים בהתאם. דוגמא טובה לתגי TAP אחרים היא תג GS-TAP, שילוב של חלבון G ומוטיב מחייב streptavidin, שעוצב על ידי קבוצת ג'וליו של Superti-Furga שמטרתה מורכבת חלבון טיהור בשורות תאי יונקים בתרבית 18. GS-TAP מאוחר יותר הותאם לחקור את האי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש המחברים אין לחשוף.
תודות
אנו מודים EUROSARF ששלח לנו פלסמידים ביטוי השמרים TAP. אנו מודים גם למערכת עזרה מLabadens ריאן. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH / NINDS (R01NS070962) לCW
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
מסננת מסננת
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| בדיקה סטנדרטית בארה"ב מס' 25 | פישר סיינטיפיק | 04-881-18 | |
| בדיקה סטנדרטית בארה"ב מס' 40 | פישר סיינטיפיק | 04-881-21 | |
| מטחנות רקמות Kontes Dounce 15 מ"ל | קימבל צ'ייס | 885300-0015 | |
| IgG חרוזי ספרד | Pharmacia | 17-0969-01 | |
| Econo-column 0.7 ס"מ x 20 ס"מ | Bio-Rad | 737-4721 | |
| Econo-column 0.5 ס"מ x 15 ס"מ | Bio-Rad | 737-4716 | |
| חרוזי קלמודולין | סטרטגן | 214303 | |
| קורס טיט ועלי | CoorsTek | 60311 | |
| AcTEV Protease | Invitrogen | 12575-015 | |
| קוקטייל מעכב פרוטאז | Roche | 11836153001 | |
| תערובת מעכבי פרוטאז | Sigma | P8340 |
מקורות
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat. Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
- Collins, S. R., et al. Toward a comprehensive....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
