הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ויזואליזציה של תחומי משנה reticulum endoplasmic בתאים בתרבית

13.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/50985

⸱

18 בפברואר 2014

 ,  ,  , 
1Fondazione Filarete, 2Department of Biotechnology and Translational Medicine, University of Milan, 3Neuroscience Institute, National Research Council (CNR), 4Department of Health Science, "Magna Graecia" University of Catanzaro

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים את גישות ההדמיה אנו משתמשים כדי לחקור את ההפצה וניידות של חלבוני ניאון transfected תושב בreticulum endoplasmic (ER) באמצעות confocal ההדמיה של תאי חיים. אנחנו גם ultrastructurally לנתח את ההשפעה של הביטוי שלהם על הארכיטקטורה של תא subcellular זה.

תקציר

השומנים והחלבונים בתאי אוקריוטים הם החליפו ברציפות בין תאי תאים, אם כי אלה לשמור על ההרכב הייחודי שלהם ופונקציות למרות תנועת interorganelle המולקולרית האינטנסיבית. הטכניקות מתוארות במאמר זה הן אמצעי רב עוצמה של לימוד חלבון וניידות שומנים בדם וסחר in vivo ו בסביבה הפיזיולוגית שלהם. התאוששות הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) וירידה בקרינה בphotobleaching (פליפ) נמצאת בשימוש נרחב בטכניקות הדמיה לחיות תאים ללימוד סחר תאיים באמצעות מסלול Exo-endocytic,, לוקליזציה היווצרות של קומפלקסי חלבונים, והחלבונים ההמשכיות בין האברונים או subcompartments בmicrodomains שומנים בדם, אשר כולם יכולים להיות שנצפו בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. המגבלות של גישות אלו הן בעיקר כתוצאה מהשימוש בחלבוני היתוך ניאון, והחסרונות הפוטנציאליים שלהם כוללים artifactual מעל מפורשיון בתאים ואת האפשרות של הבדלים בקיפול והלוקליזציה של חלבונים מתויגים וילידים. לבסוף, כגבול של רזולוציה של מיקרוסקופיה אופטית (כ 200 ננומטר) אינו מאפשר חקירה של המבנה העדין של ER או subcompartments הספציפי שיכול לנבוע בתאים תחת לחץ (כלומר חוסר חמצן, מתן תרופה, ביטוי יתר של הטרנסממברני חלבוני תושב ER) או תחת מצבים פתולוגיים, אנו משלבים הדמיה לחיות תאים של תאי transfected תרבותיים עם ultrastructural ניתוחים הבוסס על מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.

מבוא

גילוי חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) וריאנטים הרפאים שלה, ופיתוח המקביל של מיקרוסקופ פלואורסצנטי של, נפתח אפיקים חדשים לחלוטין לחקירה של חלבון התנהגות בתאים. טכניקות כגון התאוששות הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) וירידה בקרינה בphotobleaching (פליפ), שהם אפשריים בגלל היכולת הפנימית של fluorophores לכבות הקרינה שלהם תחת תאורה אינטנסיבית, מבוססות על הדמיה לחיות תאי confocal והשימוש בtransfected חלבוני היתוך ניאון 1-3. הם נמצאים בשימוש נרחב כדי להעריך לא רק את הלוקליזציה של חלבונים, אלא גם הניידות שלהם והובלת ועי, אשר יכול לחשוף רמזים חשובים הנוגעים לתפקודם 4.

התכונה הייחודית של תאי אוקריוטים היא נוכחותם של תאים תאיים שיש לי קומפוזיציות שומנים וחלבונים ספציפיות. למרות האברונים הם בידוד ע פיזיאד, הם צריכים לתקשר אחד עם השני ולשתף את המרכיבים מולקולריים על מנת לשמור על הומאוסטזיס הסלולר. מסלול ההפרשה מבטיח שהחלבונים והשומנים מסונתזים בחדר המיון להגיע ליעד הסופי הנכון שבו הם מפעילים את תפקידם. יכולים גם להיות מחוברים אברונים תאיים על ידי אתרים ליצירת קשר דינמיים המאפשרים למולקולות (שומנים) שתוחלפנה ישירות בין תאים. יתר על כן, חלבונים רבים להתאספו במתחמי heteromeric גדולים או הקשורים למיני שומנים מסוימים (רפסודות שומנים בדם / microdomains) בכדי להפוך לפונקציונלי פעיל או להיות מועבר ליעדן הסופי. כל היבטים ביולוגיים אלה משפיעים באופן משמעותי את מאפייני הקינטית של חלבונים, ולכן ניתן לחקור כראוי באמצעות הטכניקות מתוארות להלן.

הקבוצה שלנו בשימוש נרחב FRAP ולהעיף בשילוב עם מיקרוסקופ אלקטרונים כדי ללמוד את הארכיטקטורה של חדר המיון ותת השונים שלהתחומים. חדר המיון הוא התחנה הראשונה של מסלול ההפרשה וממלא תפקיד מרכזי בחלבון ושומני מיון 5. זהו אברון דינמי מאוד משנה שברורה לשקף את תפקידיה הרבים ושונים (כלומר חלבון וביוסינתזה שומנים וסחר, קיפול חלבונים, Ca 2 + אחסון ולשחרר, וחילוף חומרי xenobiotic). עם זאת, למרות שהם מורפולוגית, מרחבית, ותפקודיים שונים, תחומים אלה הם רציפים אחד עם השני, והשפע היחסי שלהם יכול להיות שונה בתאים בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. ידוע ביותר ותחומים בדרך כלל במרחב נפרד מחדר המיון הם מעטפת הגרעין, וER החלק ומחוספס, עם זאת, אנחנו ואחרים הראינו כי יש מבני ER עם ארכיטקטורה משוכללת יותר וארגון תלת ממדים בסוגי תאים שונים ו רקמות בתנאים פיסיולוגיים שיכול גם להיגרם על ידי אמצעים של גירויים מלחיצים כגון היפוקסיה, סמיםממשל, או על הביטוי של חלבוני ER-תושב הטרנסממברני 2,6 (והפניות בו).

יש לנו גם לאחרונה הפגין את נוכחותם של מבנים כאלה במודלים של תא של מחלות אנושיות 1,7. מקורם cisternae המוערמות של ER חלק, הם קבלו את השם הקולקטיבי של reticulum המאורגן החלק endoplasmic (Oser) ב2003 6, למרות שהם ידועים גם בשם karmellae, lamellae, וER גבישן על בסיס הארכיטקטורה שלהם, אשר, כמוהם גודל, יכול להשתנות. אחרי התאים transfected עם GFP התמזגו לאזור cytosolic של חלבונים (ת"א) ER-תושב (ד EGFP-ER) מעוגני זנב, הנטייה החלשה dimerizing של ה-GFP בטרנס באופן דרמטי משנה את הארגון ומבנה של חדר המיון. FRAP והניסויים FLIP הראו כי EGFP-ER ד הוא בחינם כדי לפזר בתוך OSERs, והעובדה שהוא נע מחדר מיון רשתי לOser ולהיפך </ Em> מצביע על כך שהמצרפים הם רציפים עם ER הרשתית שמסביב. ניתוח Ultrastructural אפשר לנו לתאם את נתוני הקרינה עם תיאור מפורט של אדריכלות Oser וארגון ברמת ננו: OSERs תמיד בנוי מערמות של cisternae לזווג של ER החלק אבל ייתכן שיש לי צורות שונות של ארגון המרחבי, כגון מסודר באופן קבוע סינוסי מערכים או מערבולות, או מערכים צינורי משושה "גבישן". שחלופים אלה להוביל למורפולוגיות מעוקב 8 אשר, כפי שהם כבר נמצאים בתאים בתנאים פיסיולוגיים 9 ולחצים כגון היפוקסיה 10, טיפול תרופתי 11, וסרטן 9 הבאים, ייתכן שיש פוטנציאל משמעותי כסמני ultrastructural.

לאחר הפגנה ראשונה זה באמצעות חלבוני GFP היתוך, השתמשנו ניסויי הדמיה כדי לנתח את ההתפשטות של תחומים ER בתגובה לטיפולים תרופתיים 12, assess הנטייה של חלבוני ניאון לoligomerise בתאי 13, וכדי לחקור את התפקיד של מוטציה, חלבון ת"א ALS צמוד להיווצרות של אגרגטים תאיים ממוצא ER שעשויה להיות רלוונטי ל1,8 פתוגניות שלה. היה מי שהציע כי היווצרות של אגרגטים תאיים (אשר מתרחשת במחלות ניווניות רבות 14) עשויה להיות מנגנון הגנה שנועד למנוע האינטראקציות בין חלבוני מוטציה רעילים ומרכיבי התא המקיפים 15.

להלן תיאור של שילוב של שיטות מיקרוסקופית אופטיות ואלקטרונים לחקירת מבנים בטרמינל C-שתחומים הידרופובי מוכנסים לתוך הקרום של ER, וניתוח של ההתנהגות הדינמית שלהם ואת ההשפעות של יתר הביטוי שלהם בתחום ER אדריכלות בתאים בתרבית (ראה תרשים 1 לתרשים זרימה של פרוטוקול הניסוי).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. פלסמיד, תרבית תאים, וtransfection עם חלבונים ניאון ER

  1. פלסמיד המשמש במחקר זה מורכב מגרסה משופרת של ה-GFP התמזגו בC-הסופית שלה לאזור הזנב של איזופורם ER של b ציטוכרום חולדה (5) (מקוצר כאן ב (5)) באמצעות רצף מקשר. אזור הזנב מכיל את כל הרצף (Pro94-Asp134) שנשאר קרום הקשורים לאחר מחשוף טריפסין של b ילידים (5), ובכלל זה TMD 17 השאריות (תחום הטרנסממברני), מוקף ברצפי קוטב מעלה או במורד (UPS ו DPS) . מקשר מורכב מepitope myc אחריו [4 Ser (גלאי)] 3, וכל cDNA מוכנס לתוך אתרי Hind3-Xba1 של pCDNA3 וקטור ביטוי של היונקים. פרטי הבנייה של פלסמיד זה תוארו בפרסום קודם שבו הוא מכונה ה-GFP-ER 16.
  2. לגדול COS-7 תאים בנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) בתוספת פטה 10%סרום שור l, L-גלוטמין 2 מ"מ, 1% פניצילין / סטרפטומיצין בחממה על 37 מעלות צלזיוס ו10% CO 2.
  3. Transfection. צלחת 3 x 10 5 תאים על coverslip זכוכית עגול בצלחת 6 היטב ו, ביום שלאחר מכן, transfect עם מערכת JetPEI כפי שתוארו על ידי היצרן. שים לב שיחס JetPEI / DNA האופטימלי נבדק על מנת לבסס את יעילות transfection המרבית בהתאם לפלסמיד והקו סלולרי בשימוש: במקרה שלנו, JetPEI: יחס ה-DNA של 2:1 מוביל ל70-80% יעילות transfection.

2. בשידור חי הקרינה סריקת מיקרוסקופיה confocal

  1. Live-תא הדמיה. שים את coverslip על שתאי transfected היו זורעים לתוך תא תא תרבות פלדה ל24 coverslips מ"מ מלא DMEM w / o פנול אדומה, בתוספת 10% FBS, 2 מ"מ L-גלוטמין, 1% עט / סטרפטוקוקוס, 25 HEPES מ"מ , 50 מיקרוגרם / מיליליטר cycloheximide ו1:100 OxyFluor כדי למנוע את הדגימות מphotobleaching. Microscop confocal SP5הדואר מצויד בחממה בטמפרטורה מבוקרת CO 2 (37 ° C ו 5% CO 2) משמש לניסויי הדמיה תא חי, עם GFP-ER ד שדמיין באמצעות לייזר 488 ננומטר ומסנן 525/50 פליטה לעבור להקה.
  2. התאוששות הקרינה לאחר photobleaching (FRAP). צייר אזור של עניין (ROI), המקביל למבנה Oser, ולהלבין אותו באמצעות 20 חזרות ושילוב של 488 ננומטר (של לייזר 30 mW ארגון 100%, המקביל ל 5.5-6 μW במדגם) ו405 ננומטר (60% לייזר דיודה 405 30 mW, המקביל ל 11.6 μW במדגם) לייזרים אשר, בניסיון שלנו, מוביל לphotobleaching יעיל והמהיר.
  3. רשום את ההתאוששות של הקרינה בROIs המולבנת על ידי לקיחת מסגרת אחת כל 10 שניות ל10 דקות (זמן = פיקסל 1.61 μsec / px).
  4. אובדן הקרינה photobleaching (פליפ). לצייר את ההחזר על ההשקעה המתאימה למבנה Oser, ואקונומיקה כמתואר לעיל. הלבנת חוזרת על עצמו כל 30 שניות,ותמונות שלאחר הלבנת-נרשמות כל 10 שניות ל30 דקות (זמן = פיקסל 1.61 μsec / px).
  5. FRAP וניתוח FLIP. כל התמונות נותחו באמצעות תוכנת ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html). בניסויים FRAP, התאוששות הקרינה של ההחזר על ההשקעה המולבנת נמדדת לאורך זמן ומנורמל לקרינה הכוללת של תא מולבן, שתמיד בדקה כדי להיות קבוע לאורך זמן.
  6. לניסויי FLIP, לצייר את ההחזר על ההשקעה מחוץ לOser מולבן ומכסה את כל התא. למדוד עוצמת הקרינה שלה לאורך זמן ולנרמל את רמות הקרינה של החזר על השקעה שצוירו על תא מולבן על מנת לתקן את כל ירידה בקרינה הנגרמת על ידי ההדמיה עצמו.
  7. בכל הניסויים, מופחתים אות הרקע (שנקבעה באזור שמחוץ לתאים) מעוצמות הניאון של ROIs. לבסוף, תשרטט את התוצאות באמצעות Grתוכנת aphPad פריזמה.

3. Ultrastructural ניתוח באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים

לאור רעילותם של רבים מהחומרים הכימיים, כל ההליכים צריכים להתבצע לובשים מעבדה מתאימה. מעיל וכפפות מתחת למכסת מנוע קטר.

  1. לאחר הסרת coverslip מצלחת פטרי, לתקן את התאים שנותרו גדלו על תחתית הצלחת כmonolayer באמצעות glutaraldehyde 2% מסוננים ב0.1 חיץ cacodylate מ ', pH 7.4, ל10 דקות בטמפרטורת חדר.
  2. לגרד את התאים באמצעות מגרד טפלון ולהעביר אותם לתוך 1.5 צינורות מיליליטר Eppendorf. גלולה התאים באמצעות צנטריפוגה ב9,000 גרם ל10 דקות. הסר את supernatant, להוסיף מקבע טרי, ולהשאיר לילה בשעה 4 ° C.
  3. לשטוף את כדורים עם החיץ, אז פוסט לתקן עם תמיסה של 1% tetroxide אוסמיום במאגר cacodylate במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר.
  4. לשטוף עם מים MilliQ, וחדר כתם גוש עם1% אצטט uranyl במים מזוקקים לבין 20-60 דקות.
  5. מייבשים את הדגימות בסדרת אתנול (70%, 80%, 90%, 100%, ו10 דקות כל אחד 100%) הולך וגדל, ולשטוף בקצרה פעמיים בפרופילן אוקסיד (15 דקות כל אחד).
  6. לחדור דגימות בתערובת של תחמוצת פרופילן + קומיטה (1:1) (משעה 2 ללילה).
  7. להטביע בשרף אפוקסי קומיטה רפא ב60 מעלות צלזיוס במשך לפחות 24 שעות.
  8. סעיף גושי שרף הגזוז באופן ידני באמצעות ultramicrotome LEICA UC6 מצויד בסכין יהלום 45 ° להשיג חלקים בעובי של 60-70 ננומטר. לאסוף את החלקים ב300 רשתות נחושת רשת.
  9. להכתים את החלקים ברשת עם תמיסה רוויה של אצטט uranyl (20 דקות) ולהוביל ציטרט (7 דקות), לשטוף ביסודיות את הרשתות על ידי טבילתם במים מזוקקים דו מסוננים, ולאפשר להם להתייבש בטמפרטורת חדר.
  10. הרשתות המוכתמות הם נצפו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים Tecnai G2, והתמונות שנתפסו באמצעות בוטמצלמת CCD רכוב אום בהגדלות שונות סופיות (נעות בדרך כלל בין 6,000-39,000 X).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 2 מראה מחקר FRAP דוגמא לניידות חלבון. ניידות חלבון EGFP-ER ד של מודגמת על ידי התאוששות הקרינה המהירה לאחר photobleaching בOSERs המולבן. לניתוח כמוני, חצי מהזמן והחלק נייד נגזרו מנתונים שנמדדו באופן ניסיוני על ידי התאמת משוואת monoexponential הבאה:

F (t) = F הודעה + (הודעה F rec-F) (1-e-t / τ)

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקולים וגישות הדמיה מתוארות במאמר זה נעשו שימוש כדי לחקור את ההפצה וניידות של חלבוני ניאון ת"א transfected תושב בחדר המיון של תאי חיים. יש לנו גם ניתחתי את ההשפעה של ביטוי יתר של חלבונים אלה על הארכיטקטורה של תא subcellular זאת באמצעות ניתוחי ultrastructural.

השילוב של הדמיה confocal לחיות תאים במיקרוסקופ אלקטרונים מייצג הוא אמצעי חזק מאוד של חוקר את התכונות דינמיות של חלבונים, ועשוי לספק מידע חשוב הנוג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

יש המחברים אין לחשוף.

תודות

המחברים מודים לFondazione Filarete לעזרתה ותמיכה בפרסום של מאמר זה. כמו כן, אנו רוצים להודות לCentro di Europeo Nanomedicina לשימוש במיקרוסקופ האלקטרונים הילוכים Tecnai G2.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
דולבקו s Modified Eagle Medium (DMEM)Invitrogen41966029
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM) עם פנול אדוםInvitrogen31053028
סרום בקר עוברי (FBS)Invitrogen10270106
עט/סטרפטוקוקוסInvitrogen15140-122
L-Glutamine 200 mM תמיסהInvitrogen25030-024
jetPEIPolyplus TransfectionPP10110
OxyFluorOxyrase בע"מOF-0005
גלוטראלדהיד דרגה Iסיגמא אולדריץ'G5882
נתרן קקודילאט טריהידראטסיגמא אולדריץ'C0250
אוסמיום טטרוקסיד תמיסה 4%מיקרוסקופיה אלקטרונית מדע19150
אורניל אצטט דיהידראטסיגמא אולדריץ'73943רדיואקטיבי
פרופילן אוקסידסיגמא-אולדריץ'82320
EPON הטמעת ערכה בינוניתסיגמא-אולדריץ'45359-1EA-F
עופרת ציטראט אלקטרונים מיקרוסקופיה מדע17800
צנטריפוגה עליונה ספסלEppendorf5415 D
ספקטרלי קונפוקלי מיקרוסקופ Leica MicrosystemsTCS SP5
CO2 מערכת דגירה של כלוב מיקרוסקופ OkoLab
Ultramicrotome Leica MicrosystemsUC6
סכין יהלום דיאטומהאולטרה 45 מעלות;
מיקרוסקופ אלקטרונים שידור FEITecnai G2
GraphPad פריזמה תוכנהGraphPad תוכנה, בע"
תא תרבית פלדה תא עבור 24 מ"מ כיסויכלים ביו-מדעייםCSC-25
רשתות מיקרוסקופיה אלקטרונית מיקרוסקופיה אלקטרוניםמדעG300Cu
מעט מ

מקורות

  1. Fasana, E., et al. A VAPB mutant linked to amyotrophic lateral sclerosis generates a novel form of organized smooth endoplasmic reticulum. FASEB J. 24, 1419-1430 (2010).
  2. Borgese, N., Francolini, M., Snapp, E. Endoplasmic reticulum architecture: structures in flux. Curr. Opin. Cell Biol. 18, 358-364 (2006).
  3. Ronchi, P., Colombo, S., Francolini, M., Borgese, N. Transmembrane domain-dependent partitioning of membrane proteins within the endoplasmic reticulum. J. Cell Biol. 181, 105-118 (2008).
  4. Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. Studying protein dynamics in living cells. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 444-456 (2001).
  5. Lee, M. C., Miller, E. A., Goldberg, J., Orci, L., Schekman, R. Bi-directional protein transport between the ER and. 20, 87-123 (2004).
  6. Snapp, E. L., et al. Formation of stacked ER cisternae by low affinity protein interactions. J. Cell Biol. 163, 257-269 (2003).
  7. Papiani, G., et al. Restructured endoplasmic reticulum generated by mutant amyotrophic lateral sclerosis-linked VAPB is cleared by the proteasome. J. Cell Sci. 125, 3601-3611 (2012).
  8. Almsherqi, Z. A., Kohlwein, S. D., Deng, Y. Cubic membranes: a legend beyond the Flatland* of cell membrane organization. J. Cell Biol. 173, 839-844 (2006).
  9. Federovitch, C. M., Ron, D., Hampton, R. Y. The dynamic ER: experimental approaches and current questions. Curr. Opin. Cell Biol. 17, 409-414 (2005).
  10. Takei, K., Mignery, G. A., Mugnaini, E., Sudhof, T. C., De Camilli, P. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor causes formation of ER cisternal stacks in transfected fibroblasts and in cerebellar Purkinje cells. Neuron. 12, 327-342 (1994).
  11. Feldman, D., Swarm, R. L., Becker, J. Ultrastructural study of rat liver and liver neoplasms after long-term treatment with phenobarbital. Cancer Res. 41, 2151-2162 (1981).
  12. Sprocati, T., Ronchi, P., Raimondi, A., Francolini, M., Borgese, N. Dynamic and reversible restructuring of the endoplasmic reticulum induced by PDMP in cultured cells. J. Cell Sci. 119, 3249-3260 (2006).
  13. Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13, 643-649 (2012).
  14. Pyszniak, A. M., Welder, C. A., Takei, F. Cell surface distribution of high-avidity LFA-1 detected by soluble ICAM-1-coated microspheres. J. Immunol. 152, 5241-5249 (1994).
  15. Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic proteins in neurodegenerative disease. Science. 296, 1991-1995 (2002).
  16. Winklhofer, K. F., Tatzelt, J., Haass, C. The two faces of protein misfolding: gain- and loss-of-function in neurodegenerative diseases. EMBO J. 27, 336-349 (2008).
  17. Borgese, N., Gazzoni, I., Barberi, M., Colombo, S., Pedrazzini, E. Targeting of a tail-anchored protein to endoplasmic reticulum and mitochondrial outer membrane by independent but competing pathways. Mol. Biol. Cell. 12, 2482-2496 (2001).
  18. Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol Rev. 90, 1103-1163 (2010).
  19. Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP. Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).
  20. Michida, T., et al. Role of endothelin 1 in hemorrhagic shock-induced gastric mucosal injury in rats. Gastroenterology. 106, 988-993 (1994).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

התאוששות פלואורסצנציה לאחר הלבנה פוטוכימיתאובדן פלואורסצנציה לאחר הלבנה פוטוכימיתדימוי תאים חייםמיקרוסקופיה אלקטרונית חודרתמיקרוסקופיה קונפוקליתחלבונים מתויגים ב-GFPתעתוע של חלבונים ושומניםתתי-תאים של אברוניםאנליזה אולטרה-מבנית
ויזואליזציה של תחומי משנה reticulum endoplasmic בתאים בתרבית
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.