אנו מתארים את גישות ההדמיה אנו משתמשים כדי לחקור את ההפצה וניידות של חלבוני ניאון transfected תושב בreticulum endoplasmic (ER) באמצעות confocal ההדמיה של תאי חיים. אנחנו גם ultrastructurally לנתח את ההשפעה של הביטוי שלהם על הארכיטקטורה של תא subcellular זה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ויזואליזציה של תחומי משנה reticulum endoplasmic בתאים בתרבית
במאמר זה
סיכום
תקציר
השומנים והחלבונים בתאי אוקריוטים הם החליפו ברציפות בין תאי תאים, אם כי אלה לשמור על ההרכב הייחודי שלהם ופונקציות למרות תנועת interorganelle המולקולרית האינטנסיבית. הטכניקות מתוארות במאמר זה הן אמצעי רב עוצמה של לימוד חלבון וניידות שומנים בדם וסחר in vivo ו בסביבה הפיזיולוגית שלהם. התאוששות הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) וירידה בקרינה בphotobleaching (פליפ) נמצאת בשימוש נרחב בטכניקות הדמיה לחיות תאים ללימוד סחר תאיים באמצעות מסלול Exo-endocytic,, לוקליזציה היווצרות של קומפלקסי חלבונים, והחלבונים ההמשכיות בין האברונים או subcompartments בmicrodomains שומנים בדם, אשר כולם יכולים להיות שנצפו בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. המגבלות של גישות אלו הן בעיקר כתוצאה מהשימוש בחלבוני היתוך ניאון, והחסרונות הפוטנציאליים שלהם כוללים artifactual מעל מפורשיון בתאים ואת האפשרות של הבדלים בקיפול והלוקליזציה של חלבונים מתויגים וילידים. לבסוף, כגבול של רזולוציה של מיקרוסקופיה אופטית (כ 200 ננומטר) אינו מאפשר חקירה של המבנה העדין של ER או subcompartments הספציפי שיכול לנבוע בתאים תחת לחץ (כלומר חוסר חמצן, מתן תרופה, ביטוי יתר של הטרנסממברני חלבוני תושב ER) או תחת מצבים פתולוגיים, אנו משלבים הדמיה לחיות תאים של תאי transfected תרבותיים עם ultrastructural ניתוחים הבוסס על מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.
מבוא
גילוי חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) וריאנטים הרפאים שלה, ופיתוח המקביל של מיקרוסקופ פלואורסצנטי של, נפתח אפיקים חדשים לחלוטין לחקירה של חלבון התנהגות בתאים. טכניקות כגון התאוששות הקרינה לאחר photobleaching (FRAP) וירידה בקרינה בphotobleaching (פליפ), שהם אפשריים בגלל היכולת הפנימית של fluorophores לכבות הקרינה שלהם תחת תאורה אינטנסיבית, מבוססות על הדמיה לחיות תאי confocal והשימוש בtransfected חלבוני היתוך ניאון 1-3. הם נמצאים בשימוש נרחב כדי להעריך לא רק את הלוקליזציה של חלבונים, אלא גם הניידות שלהם והובלת ועי, אשר יכול לחשוף רמזים חשובים הנוגעים לתפקודם 4.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. פלסמיד, תרבית תאים, וtransfection עם חלבונים ניאון ER
- פלסמיד המשמש במחקר זה מורכב מגרסה משופרת של ה-GFP התמזגו בC-הסופית שלה לאזור הזנב של איזופורם ER של b ציטוכרום חולדה (5) (מקוצר כאן ב (5)) באמצעות רצף מקשר. אזור הזנב מכיל את כל הרצף (Pro94-Asp134) שנשאר קרום הקשורים לאחר מחשוף טריפסין של b ילידים (5), ובכלל זה TMD 17 השאריות (תחום הטרנסממברני), מוקף ברצפי קוטב מעלה או במורד (UPS ו DPS) . מקשר מורכב מepitope myc אחריו [4 Ser (גלאי)] 3, וכל cDNA מוכנס לתוך אתרי Hind3-Xba1 של pCDNA3 וקטור ביטוי של היונקים. פרטי ה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 2 מראה מחקר FRAP דוגמא לניידות חלבון. ניידות חלבון EGFP-ER ד של מודגמת על ידי התאוששות הקרינה המהירה לאחר photobleaching בOSERs המולבן. לניתוח כמוני, חצי מהזמן והחלק נייד נגזרו מנתונים שנמדדו באופן ניסיוני על ידי התאמת משוואת monoexponential הבאה:
F (t) = F הודעה + (הודעה F rec-F) (1-e-t / τ)
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקולים וגישות הדמיה מתוארות במאמר זה נעשו שימוש כדי לחקור את ההפצה וניידות של חלבוני ניאון ת"א transfected תושב בחדר המיון של תאי חיים. יש לנו גם ניתחתי את ההשפעה של ביטוי יתר של חלבונים אלה על הארכיטקטורה של תא subcellular זאת באמצעות ניתוחי ultrastructural.
השילוב של הדמיה confocal לחיות תאים במיקרוסקופ אלקטרונים מייצג הוא אמצעי חזק מאוד של חוקר את התכונות דינמיות של חלבונים, ועשוי לספק מידע חשוב הנוג.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש המחברים אין לחשוף.
תודות
המחברים מודים לFondazione Filarete לעזרתה ותמיכה בפרסום של מאמר זה. כמו כן, אנו רוצים להודות לCentro di Europeo Nanomedicina לשימוש במיקרוסקופ האלקטרונים הילוכים Tecnai G2.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| דולבקו s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 41966029 | |
| Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM) עם פנול אדום | Invitrogen | 31053028 | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | Invitrogen | 10270106 | |
| עט/סטרפטוקוקוס | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine 200 mM תמיסה | Invitrogen | 25030-024 | |
| jetPEI | Polyplus Transfection | PP10110 | |
| OxyFluor | Oxyrase בע"מ | OF-0005 | |
| גלוטראלדהיד דרגה I | סיגמא אולדריץ' | G5882 | |
| נתרן קקודילאט טריהידראט | סיגמא אולדריץ' | C0250 | |
| אוסמיום טטרוקסיד תמיסה 4% | מיקרוסקופיה אלקטרונית מדע | 19150 | |
| אורניל אצטט דיהידראט | סיגמא אולדריץ' | 73943 | רדיואקטיבי |
| פרופילן אוקסיד | סיגמא-אולדריץ' | 82320 | |
| EPON הטמעת ערכה בינונית | סיגמא-אולדריץ' | 45359-1EA-F | |
| עופרת ציטראט | אלקטרונים מיקרוסקופיה מדע | 17800 | |
| צנטריפוגה עליונה ספסל | Eppendorf | 5415 D | |
| ספקטרלי קונפוקלי מיקרוסקופ | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| CO2 מערכת דגירה של כלוב מיקרוסקופ | OkoLab | ||
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC6 | |
| סכין יהלום | דיאטומה | אולטרה 45 מעלות; | |
| מיקרוסקופ אלקטרונים שידור | FEI | Tecnai G2 | |
| GraphPad פריזמה תוכנה | GraphPad תוכנה, בע" | ||
| תא תרבית פלדה תא עבור 24 מ"מ כיסוי | כלים ביו-מדעיים | CSC-25 | |
| רשתות מיקרוסקופיה אלקטרונית מיקרוסקופיה אלקטרונים | מדע | G300Cu |
מקורות
- Fasana, E., et al. A VAPB mutant linked to amyotrophic lateral sclerosis generates a novel form of organized smooth endoplasmic reticulum. FASEB J. 24, 1419-1430 (2010).
- Borgese, N., Francolini, M., Snapp, E. Endoplasmic reticulum....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
