מאמר שיטה

זיהוי של subpopulation מועשר Murine Erythroblast באירועי Enucleating ידי Multi-רפאים הדמיה תזרים cytometry

DOI:

10.3791/50990

⸱

6 ביוני 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cancer and Blood Diseases Institute, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, University of Cincinnati College of Medicine, 2IBM

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה חדשה לזיהוי אוכלוסייה של enucleating erythroblasts אורתוכרומטי ידי זרימת הדמיה רבת רפאים cytometry, מתן להדמיה של תהליך אנוקלאציה erythroblast.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Erythropoiesis ביונקים מסתיים בתהליך הדרמטי של אנוקלאציה כי תוצאות היווצרות reticulocyte. המנגנון של אנוקלאציה טרם הובהר במלואו. בעיה נפוצה נתקלה כאשר לומדים את הלוקליזציה של חלבונים ומבני מפתח בתוך erythroblasts enucleating ידי מיקרוסקופ היא הקושי לצפות במספר מספק של תאים עוברים אנוקלאציה. פיתחנו פרוטוקול ניתוח חדשני באמצעות הדמיה multiparameter במהירות גבוהה תא בזרימה (Multi-Spectral Imaging cytometry הזרימה), שיטה המשלבת מיקרוסקופיה immunofluorescent עם cytometry זרימה, על מנת לזהות ביעילות מספר משמעותי של אירועי enucleating, המאפשר ל להשיג מדידות וביצוע ניתוחים סטטיסטיים.

אנחנו הראשונים מתארים כאן שתי שיטות מבחנה התרבות בerythropoiesis משמשות כדי לסנכרן erythroblasts העכברי ולהגדיל את ההסתברות ללכידת אנוקלאציה בהזמן דואר של הערכה. לאחר מכן, אנו מתארים בפירוט את ההכתמה של erythroblasts לאחר הקיבוע וpermeabilization כדי ללמוד את הלוקליזציה של חלבונים תאיים או רפסודות שומנים בדם במהלך אנוקלאציה ידי זרימת הדמיה רבת רפאים cytometry. יחד עם גודל ומכתים DNA/Ter119 אשר משמשים כדי לזהות את erythroblasts אורתוכרומטי, אנו מנצלים את הפרמטרים "יחס" של תא בערוץ הבהיר השדה שמסייע בזיהוי של תאים מוארכים ו" centroid דלתא XY Ter119/Draq5 "המאפשר זיהוי של אירועים הסלולר שבמרכז מכתים Ter119 (reticulocyte המתהווה) הוא רחוק אחד מהשני מהמרכז מכתים Draq5 (שיחול גרעין עובר), ובכך מצביע על תא עומד enucleate. קבוצת המשנה של אוכלוסיית erythroblast אורתוכרומטי עם centroid דלתא גבוה ויחס נמוך מועשר בenucleating תאים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בידול מסוף בתוך שושלת erythroid ביונקים מסתיים בתהליך הדרמטי של אנוקלאציה, שדרכו erythroblast אורתוכרומטי מגרש הגרעין שלה, עטוף בממברנה (pyrenocyte) 1, שהניבו reticulocyte 2. המנגנון המדויק של תהליך זה, שהוא גם הגבלת צעד שיעור מוצלח, בקנה מידה גדולה, ייצור כדוריות דם אדומים במבחנה, עדיין לא הובהר במלואו. הלוקליזציה של חלבונים ומבני מפתח בתוך erythroblasts enucleating מסתמכת על השימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי ואלקטרוני 3-5. תהליך מייגע זה בדרך כלל תוצאות בזיהוי של מספר מצומצם של אירועי אנוקלאציה ולא תמיד מאפשר ניתוח סטטיסטי משמעותי. הרחבת על שיטה של זיהוי erythroblast תוארה בעבר על ידי McGrath et al. 6, פיתחנו גישה חדשנית של זיהוי ולימוד אירועי אנוקלאציה ידי Multi-Spectral אמאגינג cytometry הזרימה (multiparameter הדמיה במהירות גבוהה תא בזרימה, בשיטה המשלבת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם cytometry זרימה) 7, אשר יכול לספק מספר מספיק של תצפיות כדי להשיג מדידות וביצוע ניתוחים סטטיסטיים.

כאן, אנו מתארים שתי שיטות מבחנה הראשונות בerythropoiesis תרבות משמשות כדי לסנכרן erythroblasts ולהגדיל את ההסתברות ללכידת אנוקלאציה בעת ההערכה. לאחר מכן אנו מתארים בפירוט את ההכתמה של erythroblasts לאחר הקיבוע וpermeabilization כדי ללמוד את הלוקליזציה של חלבונים תאיים או רפסודות שומנים בדם במהלך אנוקלאציה ידי זרימת הדמיה רבת רפאים cytometry.

דגימות מנוהלות על זרימת הדמיה cytometer והתאים שנאספו הם מגודרים כראוי לזהות erythroblasts אורתוכרומטי 6. אז erythroblasts אורתוכרומטי מנותחים המבוסס על היחס שלהם, כפי שהיא נמדדת בהר"י brightfieldגינג, לעומת ערכם לcentroid דלתא פרמטר XY Ter119-DNA, אשר מוגדר כמרחק בין המרכזים של האזורים המוכתמים עבור Ter119 ו-DNA, בהתאמה. האוכלוסייה של תאים עם יחס נמוך וcentroid דלתא הגבוה XY Ter119/DNA היא מועשר בenucleating תאים. באמצעות wild-type (WT) erythroblasts לעומת erythroblasts עם מחיקת MX-Cre בתיווך מותנית של Rac1 על Rac2 - / - או בשילוב Rac2 - / -; Rac3 - / - רקע גנטי ופרוטוקול ניתוח הרומן הזה של זרימת הדמיה רבת רפאים cytometry, אנחנו הוכיחו לאחרונה כי אנוקלאציה דומה cytokinesis סימטרי וכי היווצרות טבעת actomyosin מוסדרת בחלקו על ידי GTPases RAC היא חשובה להתקדמות אנוקלאציה 7.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. לטווח ארוך במבחנה erythropoiesis התרבות (Ex vivo erythroid בידול תרבות פרוטוקול על ידי Giarratana et al. 8, השתנה והותאם לתאי עכבר)

זה לטווח ארוך 3 שלבים בפרוטוקול erythropoiesis מבחנה. בשלב הראשון (ימים 0-4) 2 x 10 5 תאים / מיליליטר ממוקמים במדיום גידול erythroblast השלים עם גורם תאי גזע (SCF), interleukin-3 (IL-3), ואריתרופויאטין (EPO). בשלב השני (הימים 5-6), תאי resuspended ב2 x 10 5 תאים / מיליליטר ושיתוף תרבותי בתאים חסיד סטרומה (MS5) במדיום גידול erythroblast טרי בתוספת רק ב-EPO. בשלב השלישי (ימים 7-9), תאים בתרבית על שכבה של MS-5 תאים במדיום גידול erythroblast טרי ללא ציטוקינים עד אנוקלאציה (איור 1 א).

כל הפרוטוקולים בבעלי החיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) שלהמרכז הרפואי בית החולים לילדים בסינסינטי.

  1. קציר של עצמות ובידוד של תאי מח עצם בצפיפות נמוכה
    1. הוסף 2 מיליליטר IMDM סטרילי המכיל 2% בסרום שור העובר (FBS) בצינור חרוטי 15 מ"ל ולשמור על קרח.
    2. להרדים עכבר C57/BL6 סוג בר בן 2-6 חודשים (יחד עם או בלי עכבר גנטי ממוקד של עניין) בעקבות פרוטוקול שאושר על מוסד (לדוגמא CO משאיפת 2, ואחריו נקע בצוואר הרחם).
    3. לבודד את עצמות אגן, עצמות ירך, וtibiae של שני רגליו באמצעות מלקחיים ואזמל, להוסיף אותם לצינור המכיל FBS +2% IMDM ולשמור על קרח.
    4. הוספת FBS +2% IMDM 1 מיליליטר בשפופרת סטרילית זרימת cytometry ועצמות סומק באמצעות מלקחיים ומזרק טוברקולין עם x 25-G FBS +2% "מחט 5/8. IMDM פלאש דרך העצמות כמה פעמים בעדינות ( על ידי aspirating ~ 500 μl מהשעית התא ושטיפתו שוב דרך העצם), ולאסוף את תאי מח עצם לתוך זרימת cytometrצינור y. פלאשינג יושלם כאשר עצמות מופיעות לבנה.
    5. סנן תא השעיה באמצעות מערכת מסננת תא 40-מיקרומטר על גבי צינור חרוטי 50 מ"ל. שטוף מסננת תא עם IMDM FBS +2% ושימוש באותו המדיום להתאים נפח סופי של השעיה תא 5 מיליליטר.
    6. הכן את התאים בצפיפות נמוכה מח עצם (LDBM) על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות: שכבה בזהירות 5 מיליליטר של תאי השעיה על 5 מיליליטר של הפרדת תא שיפוע צפיפות גרם / מיליליטר בצינור 15 מ"ל וספין ב750 XG במשך 1.083 בינוני 25 דקות בטמפרטורת חדר (RT) ללא האצה בלם / נמוך.
    7. ההעברה supernatant (הכל עד כ סימן 2 מ"ל של צינור 15 מ"ל על מנת לרכוש מעיל באפי) לצינור 15 מיליליטר חדש ולבצע שטיפה יותר אחד עם FBS +2% IMDM ב525 XG במשך 5 דקות ב RT.
    8. לשאוב supernatant וlyse כל תאים הנותרים דם אדום (RBC) על ידי השעיית גלולה ב 3 מיליליטר חיץ תמוגה RBC למשך 5 דקות ב RT. אם טוהר רב יותר של erythroblasts הואנדרש בשלב האחרון (למשל למחקרים ביוכימיים), לטהר תאי LDBM נוספים בשלב זה לתאי נג לין ידי הפרדה מגנטית.
  2. Vivo לשעבר פרוטוקול תרבות בידול erythroid החל מLDBM או תאי נג לין (איור 1 א)
    1. FBS +2% הוסף 7 מיליליטר IMDM, ספין ב525 XG במשך 5 דקות ב RT ו resuspend תאי pelleted ב2 בינוני מיליליטר צמיחת erythroblast (EGM), בהיקף של:
      . בינוני StemPro-34, המכיל
      ב. 2.6% StemPro-34 תוספת בינונית,
      ג. 20% BIT-9500,
      ד. 900 סולפט ברזלי מיליליטר / ng,
      דואר. 90 חנקה ברזל מיליליטר / ng,
      ו. 100 יחידות / פניצילין / סטרפטומיצין מיליליטר, L-גלוטמין 2 מ"מ
      גרם. 10 -6 הידרוקורטיזון M
      שעות. והוסיף טרי ציטוקינים:
      i) 100 ng / ml SCF,
      ii) 5 ng / ml IL-3, ו
      iii) 3 IU / ml Epo.
    2. ספירת התאים באמצעות מונה תא אוטומטי או באופן ידני במיקרוסקופ באמצעות אמרהocytometer.
    3. צלחת בצלחת תרבית תאי 6 גם בריכוז של 5 x 10 5 תאים / גם לנפח סופי של 2.5 מיליליטר בEGM (2 x 10 5 תאים / מיליליטר LDBM) ו לדגור על 37 ° C (זה נחשב כמו יום # 0 של תרבות).
    4. שנה בינונית על ידי aspirating 1.5 מיליליטר של supernatant, מסתובב ב525 XG במשך 5 דקות ב RT, resuspending ב1.5 מיליליטר של מדיום טרי המכיל את כל 3 ציטוקינים והוספה חזרה לבארות בכל יום בימים # 2, 3, 4, כדי לייעל את שלב שגשוג. ביום 3, להסיר את כל התאים, לספור והתפצל למספר מתאים של בארות כדי לקיים ריכוזי תא היטב של ~ 2 x 10 5 תאים / מיליליטר. לשמור על התרבות ב37 ° C / 5% CO 2.
    5. ביום 4, תאי MS5 הצלחת (קו תאי סטרומה עכברי) לבארות של צלחת 6 היטב תרבית התאים חדשה. מדיום תרבית תאי MS5 הוא α-ממ מכיל FBS 20%, 100 יחידות / פניצילין / סטרפטומיצין מיליליטר, ו -2 L-גלוטמין מ"מ.
    6. ביום 5, לספור מספרתאים (כיום מועשר באופן משמעותי בerythroblasts) בבאר כל צלחת התרבות המקורית באמצעות מונה תא אוטומטי או באופן ידני במיקרוסקופ באמצעות hemocytometer.
    7. הרם את כל התאים מכל טוב ולהעביר לצינורות חרוטי 15 מ"ל, ספין למטה ב525 XG במשך 5 דקות ב RT, לשאוב supernatant ו לפזר פתיתים עם EGM טריות המכילה רק EPO (3 IU / ml) לריכוז של 2 x 10 5 תאים / מיליליטר.
    8. לשאוב supernatant מהבארות שבו MS-5 תאים היו מצופים ביום הקודם (ממוקד לconfluency 70-80% בזמן של התרבות המשותפת) ולהוסיף תאי erythroid בבארות אלה בEGM מכילה רק EPO (אם כי לא המדיום שלהם בחירה, MS-5 תאים לשרוד גם בEGM במשך כמה ימים).
    9. שנה בינונית הוספת EPO הטרי ביום # 6.
    10. שנה בינונית ביום # 7, תוך שימוש בEGM ללא ציטוקינים הוסיפו. בימים 7 עד 9, דגימות מבחן לאנוקלאציה עם cytometry זרימה לאחר צביעה עם אנטי Ter119 וSyto-16 יומית ו-proceed למכתים את הדגימות לMulti-Spectral Imaging cytometry הזרימה (כמפורט בסעיף 3).
      הערה:. לפני ציפוי וביום 2, 4, 6, ו -7 של תרבות, לפקח על תאים בתרבית להעשרת erythroblast והבחנה עם cytometry זרימה על ידי הערכת סמני משטח CD44 וTer119 לעומת הגודל (FSC) 9 לחלופין CD71, Ter119, וFSC יכול לשמש גם 10, 11.

2. Enucleation Assay המהיר, על פי הפרוטוקול שתואר על ידי יושידה et al. 12 עם שינויים (איור 1)

  1. אינדוקציה erythropoiesis מתח וstroma הכנת תא לתרבות erythropoiesis במבחנה
    1. הרדימי עכבר ישן 2-6 חודש סוג בר C57/BL6 להנחיות IACUC (לדוגמא עם פתרון isoflurane). ודא שהעכבר כבר מורדם כראוי על ידי בדיקה על היעדרות של תגובות רפלקסיביות לקמצוץ האחורי-כפה עדין ועבורנשימתו הסדירה במהלך ההליך. השתמש במשחת עיני וטרינר על עיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה.
    2. לגרום erythropoiesis מתח באמצעות זנב מדמם לנפח סופי של μl 500. שימוש במזרק אינסולין, להזריק נפח שווה של מלח רגיל intraperitoneally כדי להבטיח החייאת נוזלים של החיה (להחזיק בעלי חיים בעמדת Trendelenburg לפני הזרקה ולהזריק בבטן התחתונה, כדי שלא לגרום נזק לאיברים פנימיים).
    3. אל תשאיר את העכבר ללא השגחה עד שהוא שב לשליטה מוטורית כפי שצוין על ידי בעלי החיים מתחילים לנוע בכלוב ולהיות מסוגל לעמוד וללכת בלי ליפול. עכבר phlebotomized ממוקם בכלוב בלי עכברים אחרים.
    4. אחרי 2 ימים, צלחת MS-5 תאים בבארות של צלחת תרבית תאי 24 גם. דגירה MS-5 תאים ב37 ° C / 5% CO 2 במדיום סלולרי MS5 (-ממ מכיל FBS 20%, 100 יחידות / פניצילין / סטרפטומיצין מיליליטר, ו 2 מ"מ L-גלוטמין) במטרה להיות 70-80 % I מחוברותבארות צלחת n לאחר 48 שעה.
  2. קציר של טחול ועיבוד של splenocytes
    1. ארבעה ימים (96 hr) אחרי גיוס erythropoiesis המתח, להרדים דימם בעבר עכבר באמצעות פרוטוקול שאושר IACUC (למשל משאיפת CO 2 ואחריו נקע בצוואר הרחם).
    2. טחול קציר ולשים אותו בצינור חרוטי 15 מיליליטר המכיל 2% FBS IMDM ולשמור על קרח.
    3. חזרה במעבדה, במכסת המנוע בתרבית רקמה בתנאים סטריליים, להפוך צינור המכיל טחול במסננת תא 40-מיקרומטר נקבע על גבי צינור 50 מ"ל. קראש טחול באמצעות הבוכנה של מזרק פלסטיק 5 מ"ל.
    4. שטוף מסננת תא עם FBS +2% IMDM ובאמצעות אותו המדיום, להתאים את הנפח הסופי של השעיה תא 5 מיליליטר.
    5. שכבה בזהירות את ההשעיה splenocyte 5 מיליליטר ב -5 בהפרדת תא מיליליטר צפיפות שיפוע בינוני 1.083 גר '/ מיליליטר בצינור 15 מ"ל וספין ב750 XG במשך 25 דקות ב RT ללא האצת בלם / נמוך.
    6. להעבירsupernatant (פתרון למטה על סימן 2 מ"ל של הצינור 15 מ"ל על מנת לרכוש מעיל באפי) לצינור 15 מיליליטר חדש ולבצע שטיפה נוספת עם FBS +2% IMDM ב525 XG במשך 5 דקות ב RT .
    7. לשאוב supernatant ותאי דם אדומים lyse ידי השעיית גלולה ב 3 מיליליטר חיץ תמוגה RBC למשך 5 דקות ב RT.
    8. הוסף 7 IMDM מיליליטר FBS +2% לשטוף תאים ולדלל ולנטרל את מאגר תמוגה RBC וספין ב525 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    9. לשאוב supernatant ו להשעות תאי טבליות ב2 מיליליטר של מדיום גידול erythroblast (EGM).
  3. תרבות של splenocytes המבודד בצפיפות נמוכה, מועשר בerythroblasts, על פלסטיק (השלב ​​הראשון של תרבות erythropoiesis מהירה במבחנה)
    1. ספירת תאים על דלפק תא אוטומטי או באופן ידני על ידי hemocytometer. מספר רגיל של תאים מבודדים לטחול בשלב זה הוא ~ 15 x 10 6.
    2. להשעות את התאים נוספים בEGM המכילים ציטוקינים (בfריכוזי inal): SCF 50 מיליליטר ng /, IL-3 5 ng / ml, וEpo 2 U / ml.
    3. פלייט 1-5 x 10 6 תאים בנפח סופי של 1 מיליליטר / היטב (אותו מספר של תאים לכל גם בהתאם למספר כולל של תאים) של צלחת תרבית תאי 24 היטב דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס / CO 2 של 5%.
  4. תרבות של erythroblasts על תאי MS5 (שלב שני של תרבות erythropoiesis מהירה במבחנה
    1. לשאוב supernatant מהפלסטיק היטב ולהרים את התאים (מועשרים בerythroblasts) על ידי הוספת 2 מיליליטר של קר 10 mM EDTA ב PBS במשך 5 דקות, על קרח היטב כל אחד.
    2. שים תאים בצינורות טריים, לשטוף פעם בEGM (ללא ציטוקינים) ו resuspend באותו הדבר.
    3. צלחת 5 x x 10 5 -1 10 6 תאים בנפח 1-2 מיליליטר לכל MS5 גם צלחת 24 גם מצופה תא. אם מעכבים תרופתיים נמצאים בשימוש בניסוי, להוסיף אותם בריכוזים מתאימים עכשיו.
    4. דגירה במשך 6 עד 8 שעות (זמן מונחה על ידיתצפית מיקרוסקופית של כ 30% אנוקלאציה -40% במדגם WT שלא טופל). המחייבים של erythroblasts ל-MS-5 תאים מאיץ אנוקלאציה.
    5. הרם תאים מכל גם על ידי הוספת 2 מיליליטר של PBS הקר + 10 mM EDTA, למשך 5 דקות, על קרח. יחד עם erythroblasts, MS-5 תאים יהיו גם נאספו, אך מאוחר יותר ניתן לשלול אלה בקלות במהלך ניתוח תזרים cytometric כTer119 היי FSC - תאים.
    6. בשלב זה, ניתן לתקן תאים ומוכתמים לניתוח על ידי Multi-Spectral Imaging cytometry הזרימה.

3. הכתמה של Erythroblasts ללוקליזציה של חלבונים תאיים או רפסודות שומנים בדם במהלך Enucleation ידי Multi-רפאים הדמיה תזרים cytometry

  1. שטפו תאי PBS, ספין 525 XG במשך 5 דקות ב RT ולשאוב supernatant.
  2. תקן את התאים על ידי resuspending כדורי תא ב500 μl של פורמלדהיד .3.7% ב-PBS במשך 15 דקות (זמן קיבוע עשוי להשתנות תלוי באנטידור שחקר) וpipetting בעדינות.
  3. העברה לצינורות צנטריפוגה פלסטיק 1.5 מ"ל ו דגירה של 15 דקות ב RT.
  4. ספין על XG microcentrifuge ספסל 2,000 ל20 שניות, לשאוב supernatant ולבצע שטיפה אחת על ידי הוספת 500 μl PBS על צינור אחד וpipetting בעדינות.
  5. ספין על XG 2,000 microcentrifuge ספסל עבור 20 שניות, לשאוב supernatant ולשמור על צינורות על קרח לפחות 15 דקות. Permeablization צעדים 3.6-3.9 צריכים להיעשות במהירות וביעילות, ובעקבות ספינינג / שאיפה ב RT, צריכים מייד לשים כדורי תא אחורי על קרח, על מנת שתאים כדי לשמור על היושרה שלהם טובים יותר.
  6. קח את פתרונות אצטון מ מקפיא -20 מעלות צלזיוס ולשים על קרח. Permeabilize תאים על ידי resuspending כדורי תא הראשון ב500 אצטון μl קר כקרח 50% (1:1 עם DH 2 O) וpipetting בעדינות.
  7. ספין על ספסל microcentrifuge 2,000 XG לכדורי 20 שניות, לשאוב supernatant ותא גלול ב500 μl60; אצטון 100% קרים כקרח על ידי pipetting בעדינות.
  8. ספין על ספסל microcentrifuge 2,000 XG לכדורי 20 שניות, לשאוב supernatant ותא גלול פעם נוסף ב500 אצטון 50% קרים כקרח μl ידי pipetting בעדינות.
  9. ספין על ספסל microcentrifuge 2,000 XG במשך 20 שניות, לשאוב supernatant ולשטוף את תאי פעם אחת בחיץ FACS הקר (BSA + 0.5% PBS) על ידי pipetting בעדינות.
  10. הכן קוקטייל תיוג עם נוגדנים או סמנים למולקולות של עניין: 0.1 U/100 μl AF488-phalloidin לצביעת F-אקטין ו1 μl/100 μl Ter119-PECy7 למכתים תא erythroid. מכתים אלטרנטיבי או נוסף יכול להיעשות גם באמצעות AF-488-אנטי β-טובולין נוגדן (1:50), למקטע רעלן הכולרה B AF-594 מצומדות לתייג רפסודות שומנים בדם (1:200), אנטי pMRLC (Ser19) נוגדן ראשוני לשרשרת שרירן פוספורילציה אור הרגולציה (1:50), ואחריו נוגדנים נגד ארנב AF-488 מצומדות משניים (1:400), ואנטי γ-tubuנוגדן לין ארנב העיקרי (1:100) ואחריו נוגדנים נגד ארנב AF-555 מצומדות המשניים (1:300).
  11. בעקבות שאיפת supernatant, resuspend כדורי תא בקוקטייל הסמן, פיפטה 100 μl עדינות דגירה במשך 30 דקות ב RT.
  12. הכן את חיץ FACS מכיל 2.5 מיקרומטר של Draq5 הכתם הגרעיני.
  13. שטוף תאים בחיץ FACS, ספין למטה על microcentrifuge ספסל 2,000 XG במשך 20 שניות, לשאוב supernatant ו resuspend ב 60 חיץ FACS μl מכיל Draq5.
  14. דגימות לרוץ על ההדמיה לזרום cytometer לאסוף לפחות 10,000 אירועים לכל ניסוי, לפצות את קבצי הנתונים הגולמיים כ13 שפורסמו בעבר, ולנתח את התוצאות כפי שמוצגות באיור 2, תוך שימוש בתוכנה לניתוח ספציפי להדמית cytometer זרימה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ראשית, תאים מנותחים על בסיס יחס הממדים Brightfield (היחס בין אורכם הקטינים לעומת הציר המרכזי שלהם) ופינת Brightfield (מעיד על הגודל שלהם). אירועים עם ערך פינת Brightfield נמוך מ20 וגבוהים יותר מאשר 200 הם בעיקר אגרגטים פסולת ותאים, בהתאמה, והם נכללים בניתוח (איור 2 א). תאים בודדים (שער "R1") הם לאחר מכן נותח על בסיס ערכם לפרמטר צבע RMS, דבר שמצביע על חדות של תמונה. השער "R2" נוצר תאים המכילים ערך עם Gradient RMS יותר מ אחוזון ה 50 כדי לבחור את התמונות ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשנים האחרונות המחקר של אנוקלאציה erythroblast צבר תאוצה גוברת שכן הוא הצעד במבחנת תרבויות erythropoiesis שהוא קשה ביותר להתרבות ביעילות על מנת להשיג ייצור של תאי דם אדומים לשעבר vivo מוצלח, בקנה מידה גדולה. עד לאחרונה, המחקר של אנוקלאציה erythroblast מנוצל מיקרוסקופיה בעיקר הקרינה וזרימת cytometry שיטות. שיטות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אם כי מועיל בזיהוי מולקולות משתתפות, דורשות ימים של התבוננות מיקרוסקופית כדי לזהות מספר קטן של erythroblasts אורתוכרומטי עובר אנוקל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים זרימת מחקר Cytometry Core בבית החולים לקרן המחקר לילדים בסינסינטי וריצ'רד דימרקו, Sherree חבר, וסקוט מרדכי מחברת Amnis (חלק מEMD Milllipore) לקבלת תמיכה טכנית מומחה. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות מעניק K08HL088126 וR01HL116352 (TAK) וDK090971 P30 (YZ).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ואלפא; MEM בינוניCellGro15-012-CV
IMDM בינוניHyclone (Thermo Scientific)SH30228.01
Stempro-34 SFMGIBCO (Life Tech)10640
תוסף תזונה Stempro-34GIBCO (Life Tech)10641-025
סרום בקר עוברי (FBS)Atlanta Biologicals512450
BIT9500Stemcell Technologies09500
אלבומין סרום בקר (BSA)פישר סיינטיפיקBP-1600-100
פוספט חוצץ מלח (PBS)היקלון (תרמו סיינטיפיק)SH30028.02
פניצילין/סטרפטומיציןהיקלון (תרמו סיינטיפיק)SV30010
ל-גלוטמיןהיקלון (תרמו סיינטיפיק)SH30590.01
איזותזיה (איזופלורן)באטלר-שיין029405
היסטופאקה 1.083 מ"ג/מ"לסיגמא10831
BD פארמליז (מאגר ליזה RBC)BD Biosciences555899
אצטוןסיגמא-אולדריץ'534064
פורמלדהידפישר סיינטיפיקBP 531-500
הידרוקורטיזוןסיגמאH4001
פקטור תאי גזע (SCF)פפרוטק250-03
אינטרלוקין-3 (IL-3)פפרוטק213-13
EPOGEN Epoetin Alfa (אריתרופוייטין, EPO)AMGENזמין על ידי בית מרקחת
נוגדן CD44-FITC BDPharmingen553133
CD71-FITC נוגדןBD Pharmingen553266
נוגדן Ter119-PECy7BD Pharmingen557853
Phalloidin-AF488Invitrogen (Life Technologies)A12379
β-tubulin-AF488 נוגדןאיתות תאים# 3623
אנטי ארנב AF488 - נוגדן משניInvitrogen (Life Technologies)A11008
נגד ארנב AF555 - נוגדן משניInvitrogen (חיים טכנולוגיות)A21428
AF594-תת-יחידה של רעלן כולרה BInvitrogen (Life Technologies)C34777
pMRLC (Ser19) נוגדןאיתות תאים#3671
&גמא;-נוגדן טובוליןSigmaT-3559
Syto16Invitrogen (Life Technologies)S7578
Draq5BiostatusDR50200
ברזל גופרתיSigmaF7002
ברזל חנקתיSigmaF3002
EDTAFisher ScientificBP120500
צינורות 15 מ"לBD Falcon352099
צינורות 50 מ"לBD Falcon352098
צלחות 6 בארותBD Falcon353046
24- צלחותבאר צינורות זרימה BD פלקון351147
BD פלקון352008
טוברקוליןמזרק BD309602
מזרק אינסוליןBD329461
מחט מזרק 25-G 5/8BD305122
צינורות זרימה מכוסיםBD352058
40-μ מסננת תאים mBD Falcon352340
אזמל (חד פעמי)נוצה2975 # 21
FACS Canto Flow CytometerBD
ImagestreamX Mark II Imaging Flow CytometerAMNIS (EMD Millipore)
תוכנה לחקר וניתוח נתוני תמונה (IDEAS) גרסה 4.0 ומעלה.AMNIS (EMD Millipore)
Hemavet 950 מונה תאיםדרו מדעיCDC-9950-002
סדרת NAPCO 8000WJ אינקובטורתרמו מדעי
Allegra X-15R צנטריפוגהבקמן קולטר392932
מיני עכבר ספסל צנטריפוגהדנווילC0801
מזרק

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McGrath, K. E., Kingsley, P. D., Koniski, A. D., Porter, R. L., Bushnell, T. P., Palis, J. Enucleation of primitive erythroid cells generates a transient population of "pyrenocytes" in the mammalian fetus. Blood. 111, 2409-2417 (2008).
  2. Chasis, J. A., Mohandas, N. Erythroblastic islands: niches for erythropoiesis. Blood. 112, 470-478 (2008).
  3. Koury, S. T., Koury, M. J., Bondurant, M. C. Cytoskeletal distribution and function during the maturation and enucleation of mammalian erythroblasts. J Cell Biol. 109, 3005-3013 (1989).
  4. Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2. Nat Cell Biol. 10, 314-321 (2008).
  5. Keerthivasan, G., Small, S., Liu, H., Wickrema, A., Crispino, J. D. Vesicle trafficking plays a novel role in erythroblast enucleation. Blood. 116, 3331-3340 (2010).
  6. McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology. J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).
  7. Konstantinidis, D. G., et al. Signaling and cytoskeletal requirements in erythroblast enucleation. Blood. 119, 6118-6127 (2012).
  8. Giarratana, M. C., et al. Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells. Nat Biotechnol. 23, 69-74 (2005).
  9. Chen, K., Liu, J., Heck, S., Chasis, J. A., An, X., Mohandas, N. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2009).
  10. Kalfa, T. A., et al. Rac1 and Rac2 GTPases are necessary for early erythropoietic expansion in the bone marrow but not in the spleen. Haematologica. 95, 27-35 (2010).
  11. Koulnis, M., Pop, R., Porpiglia, E., Shearstone, J. R., Hidalgo, D., Socolovsky, M. Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay. J Vis Exp. , (2011).
  12. Yoshida, H., Kawane, K., Koike, M., Mori, Y., Uchiyama, Y., Nagata, S. Phosphatidylserine-dependent engulfment by macrophages of nuclei from erythroid precursor cells. Nature. 437, 754-758 (2005).
  13. Ortyn, W. E., et al. Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging. Cytometry A. 69, 852-862 (2006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CentroidTer119DNA Draq5In Vitro

מאמרים קשורים