פרוטוקול אופטימלי עבור רשתית Wholemount הכנה להדמיה ואימונוהיסטוכימיה

סיכום

הפרוטוקול המתואר כאן מיועד להערכה מבנית של תכשיר רשתית שלם. זה כולל תיאורים של דיסקציה של רקמות, הרכבה על תוספת ממברנה פוליטטרפלואורואתילן הידרופילית (PTFE), העמסת בולוס עם סמנים פלואורסצנטיים, והשוואה של קיבוע עם קרבודימיד ופרפורמלדהיד לניתוח אימונוהיסטוכימי של רכיבים תאיים וסינפטיים.

תקציר

עבודה עם רקמה עדינה יכולה להיות גורם מסבך בעת ביצוע הערכה אימונוהיסטוכימית. כאן, אנו מציגים שיטה המשתמשת בקרום PTFE הנתמך על ידי טבעת כדי לספק תמיכה מבנית הן לרקמה חיה והן לרקמה קבועה במהלך עיבוד אימונוהיסטוכימי, המאפשר שימוש במגוון פרוטוקולים שאחרת יגרמו נזק לרקמה. ראשית, זה מודגם על ידי העמסת בולוס של סמנים פלואורסצנטיים לרקמת רשתית חיה. שיטה זו מאפשרת הדמיה מהירה של מבנים ממוקדים, בעוד שתמיכת הממברנה שומרת על שלמות הרקמה במהלך ההזרקה ומאפשרת העברה קלה של התכשיר להמשך הדמיה או עיבוד.

שנית, מתואר הליך לצביעת נוגדנים ברקמה מקובעת בקרבודימיד. למרות שקיבוע פרפורמלדהיד נפוץ יותר, קיבוע קרבודימיד מספק מצע מעולה להדמיה של חלבונים סינפטיים. מגבלה של קרבודימיד היא שהרקמה הקבועה המתקבלת היא שבירה יחסית; עם זאת, מתגברים על כך באמצעות הממברנה התומכת. רקמת רשתית משמשת להדגמת טכניקות אלה, אך ניתן ליישם אותן על כל רקמה שברירית.

מבוא

ביצוע אימונוהיסטוכימיה ברקמות עדינות ושלמות מסתכן בנזק במהלך הטיפול וההעברה. זה יכול להתרחש בפרוסות מוח או ברקמות דקות אחרות, כגון רשתית מנוונת. בנוסף, ישנן שיטות מסוימות לקיבוע רקמות שיכולות להועיל לצביעה חיסונית של מבנים עצביים, אך גורמות לפגיעה ביציבות המבנית, המונעת את השימוש בהן. דוגמה מסוימת לכך היא קיבוע מבוסס קרבודימיד, שהוא עדיף על צביעת קולטנים והורמונים^1-7 אך בדרך כלל נמנע ממנו בגלל חוסר היציבות של הרקמה הקבועה.

כאן, אנו מתארים הליך המשתמש בקרום PTFE שעבר הידרופיליזציה כדי לתמוך מבנית ברקמות עדינות, קבועות או לא מקובעות, עבור מגוון טכניקות צביעה. הממברנה התומכת מאפשרת מניפולציה של רקמות עדינות לפני ואחרי הקיבוע, ומאפשרת מספר שלבי עיבוד תוך מזעור הסיכון לנזק לרקמות. בסך הכל, שיטה פשוטה זו לשמירה על שלמות הרקמות מספקת את ההזדמנות להשתמש בטכניקות שאחרת ניתן היה להימנע מהן. ככזו, גישה זו יכולה לשמש בהצלחה גם להכנת מגוון רחב של רקמות כגון פרוסות מוח שהופכות לשבריריות לאחר הליכי חיתוך.

פרוטוקול

בכל הליכי הניסוי, בעלי חיים טופלו בהתאם לתקנות בהצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה ובהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המכללה הרפואית וייל קורנל. בעלי חיים הומתו על ידי פחמן דו חמצני ולאחר מכן נקע צוואר הרחם.

1. דיסקציה של רשתית שלמה

1. לאחר המתת חסד של העכבר, הוציאו את עיניו מהגרעין והניחו אותן בתמיסת רינגר מחומצנת HEPES (טבלה 1).
2. הסר את הקרנית על ידי חיתוך במסלול מעגלי לאורך האורה-סרטה עם מספריים קטנות, החזקת העין בלימבוס בעזרת מלקחיים. משוך החוצה את העדשה בעזרת מלקחיים.
3. הסר כמה שיותר זגוגית, באמצעות מלקחיים קהים. שלב זה חשוב להזרקות בולוס ולרישומים אלקטרופיזיולוגיים; זה לא הכרחי בעת ביצוע אימונוהיסטוכימיה בלבד.
4. נתק את הרשתית מכוס העין על ידי מיקום מלקחיים בין הרשתית לכוס העין, תוך הזזת המלקחיים לאט סביב ההיקף. ייצב את העין על ידי החזקת הסקלרה בחוזקה עם סט שני של מלקחיים. חתכו את עצב הראייה במיקום שבין הרשתית לכוס העין כדי להקל על הפרדת הרשתית מכוס העין.
5. ניתן לנתח את הרשתית לחתיכות (למשל רבעים) או להשתמש בה כמכלול. כדי לחתוך לחתיכות, השתמש במספריים כדי לבצע חתכים מהיקף הרשתית עד לעצב הראייה. לחלופין, כדי להשתמש בכל הרשתית, בצע חתכים מהפריפריה באמצע הדרך לעצב הראייה. החתכים יעזרו לבצע הכנה שטוחה.

2. הרכבה על תוספת קרום PTFE הידרופילי

1. הכן את הממברנה כמתואר להלן. כאשר מבוצעות הקלטות פיזיולוגיות או ניסויי הזרקת צבע, קצר את המחזיק באמצעות מחרטה או מסור ידני כך שהטבעת הנותרת תהיה בגובה של 1 מ"מ.
   הערה: תוספות לוחית התרבות עשויות להיות ללא שינוי או שינוי (איור 1A). בחירת התצורה מוכתבת על ידי מטרת הניסוי. לצביעה חיסונית, תוספת ללא שינוי מתאימה.
2. ללטש משטחים מחוספסים עם נייר זכוכית עדין (300 חצץ ומעלה).
3. (אופציונלי) יש להסיר את כפות הרגליים מתחת לטבעת בעזרת מספריים.
4. כדי להסיר פסולת, שטפו או סוניקציה של הממברנה במים מזוקקים למשך 2-3 דקות.
5. הרכיבו את הרקמה על הממברנה (איור 1A). הניחו את הרקמה עם תמיסה כלשהי על גבי הממברנה בעזרת פיפטת העברה מפלסטיק. חתכו את הקצה הצר של הפיפטה במידת הצורך, כדי למנוע שדגימת הרקמה תידבק לפיפטה במהלך ההעברה.
6. חבר את הרשתית עם תאי גנגליון (GCs) כלפי מעלה: על הממברנה, הסר בהדרגה את התמיסה תוך פיזור הרשתית ופתיחת הקפלים בעזרת מלקחיים.
7. בצד הנגדי של הממברנה, מקם מזרק ריק (1 מ"ל) ישירות מתחת לרקמה. הפעל יניקה על ידי משיכת הבוכנה לאחור לנפח של 0.2-0.3 מ"ל. הגדל את שטח היניקה על ידי חיתוך קצה האחיזה של המזרק לפני השימוש. הרקמה אינה דורשת טיפול נוסף להידבקות, מכיוון שהיא כלואה פיזית בתוך הממברנה.

3. הזרקת בולוס של איזולקטין אלקסה 488

1. הכן פיפטות תיקון ותמיסת מכתים. משוך פיפטות תיקון מזכוכית נימית בורוסיליקט עם מושך בוער/חום, עם התנגדות של ~1 MΩ. שוברים בעדינות את קצה הפיפטה.
2. הכינו תמיסת צביעה על ידי הוספת 0.3 מיקרוליטר של תמיסת מלאי איזולקטין Alexa 488 ל-10 מיקרוליטר של תמיסת ה-Ringer המאגרת HEPES המתוארת בשלב 1.2.
3. העבירו את הדגימה לתיקון-clamp מערך להזרקה (איור 1C). הנח את הממברנה עם רקמה מחוברת לתוך תא ההקלטה המלא בתמיסת רינגר מחוממת (37 מעלות צלזיוס) ומחומצנת HEPES.
4. הניחו את הפיפטה המכילה צבע כנגד הממברנה המגבילה הפנימית (ILM, איור 2A). בעזרת מיקרומניפולטור, קדם עוד יותר את הפיפטה כנגד ה- ILM עד שהיא חודרת אליה. הזרקו את תמיסת הצביעה בלחץ 10-20 psi למשך שנייה אחת באמצעות פיקוספריצר. מיקומים בודדים או מרובים עשויים להיות ממוקדים להזרקה (איור 2B). אם אין פיקוספריצר, ניתן להשתמש במזרק של 10 מ"ל כדי לספק לחץ אוויר חיובי להזרקה.
5. דגירה של רקמה מוזרקת למשך 10 דקות. במהלך הדגירה ניתן לראות את הרקמה המוזרקת תחת תאורה אפיפלואורסצנטית.
6. לאחר התיוג, ניתן לקחת את התכשיר למיקרוסקופ להדמיה. העבירו את התוספת לתבנית תרבית עם תחתית זכוכית, והניחו את הרשתית כלפי מטה (איור 1C).
7. הוסף טיפה של תמיסת HEPES כדי לשמור על לחות הדגימה.
8. הניחו 2-3 כתמים של שומן ואקום סביב היקף טבעת הפלסטיק כדי להדק היטב את התוספת לתחתית צלחת התרבות.
9. מעבירים את המנה לשלב המיקרוסקופ.

4. קיבוע פרפורמלדהיד וקרבודימיד

1. תקן את הדגימה על ידי העברת התוספת לקיבוע למשך 15 דקות. ניתן להשתמש בזמני קיבוע ארוכים או קצרים יותר, בהתאם ליישום. ניתן להשתמש ביעילות בשני המקבעים לקיבוע GFP, איזולקטין או הידרזידים פלואורסצנטיים של אלקסה (למשל משמשים למילוי התאים בהקלטות מהדק טלאי).
   הערה: לקיבוע, ניתן להשתמש בתמיסות 4% קרבודימיד או 4% פרפורמלדהיד. כדי לשמור על הדבקות, יש לבצע קיבוע לאחר שהרקמה כבר הוצמדה לקרום. ניתן לקבע את הרקמה מיד לאחר ההרכבה, או לאחר רישום פיזיולוגי ו/או הזרקת בולוס.
2. שטפו את הרקמה במאגר פוספט (PB) למשך 30 דקות. לאחר מכן, ניתן לעבד את הרקמה כהרכבה שלמה (שלב 5) או לחתוך אותה לחלקים אנכיים ולאחר מכן לעבד אותה (שלבים 6 ו-7).

5. צביעה חיסונית של שלמות הרשתית

1. בצלחת של 24 בארות (איור 1D) חסמו חתיכות רשתית על הממברנה למשך שעה אחת בתמיסת צביעה.
2. יש לדלל את הנוגדנים העיקריים נגד PSD-95 בעכבר 1:300 בתמיסת הצביעה ולמרוח למשך 48 שעות בטמפרטורת החדר בחושך. הוסף תמיסת נוגדנים של ~100-150 מיקרוליטר בכל באר עם הרקמה. כדי למנוע התייבשות, מלאו בארות שאינן בשימוש במים מזוקקים.
3. יש לשטוף במשך 20 דקות ב-PB, פי 3.
4. דגירה למשך 24 שעות בנוגדנים משניים נגד עכבר אלקסה 568 של חמור מומסים 1:500 בתמיסת הצביעה.
5. יש לשטוף במשך 20 דקות ב-PB, פי 3.
6. מניחים את התוספת עם הרקמה המוכתמת בצלחת פטרי סטנדרטית בגודל 3 ס"מ מלאה בתמיסת PB. בעזרת מספריים קטנים, גזרו את חלק הממברנה המכיל את הרשתית מהטבעת.
7. מעבירים את הרשתית על הממברנה על רשתית שקופית כלפי מעלה. הסר PB, הוסף אמצעי הרכבה. הנח חתיכות קטנות של זכוכית כיסוי שבורה בין המגלשה למשקפיים כדי למנוע סחיטה נרחבת ונזק לרשתית. הנח כיסוי.
8. אטום את הכיסוי במקומו עם לק. שמור שקופיות בחושך, במקרר.

6. חתך אנכי של רקמה המותקנת על הממברנה

1. לאחר הקיבוע, טבלו את הרקמה על הממברנה בתמיסות שיפוע סוכרוז של 10%, 20% ו-30% סוכרוז למשך 30 דקות, שעה ולילה, בהתאמה. שלב הלילה מתבצע בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במקרר, כל שאר השלבים בטמפרטורת החדר.
2. בעזרת מספריים, הסר את הממברנה עם הרקמה מטבעת הכנסת הפלסטיק.
3. הנח את הממברנה החתוכה על Parafilm עם הרשתית כלפי מעלה והסר כמה שיותר תמיסה עם Kimwipes.
4. הכניסו את הפרפילם עם הרקמה לתא הקריוסטט והוסיפו טיפה של מדיום OCT. השתמש במכשיר המקפיא המהיר כדי להאיץ את ההקפאה.
5. נתקו את הדגימה הקפואה והפכו אותה.
6. חותכים עודפי OCT קפואים. השאירו כ-2 מ"מ סביב הדגימה משלושה צדדים, והשאירו 5-6 מ"מ מהצד שיוצמד למחזיק.
7. יש לכסות את צד הרשתית החשוף (צד הממברנה) בטיפה של OCT. יש להשאיר את אזור החיבור פנוי.
8. הקפיאו את הממברנה ברקמת הרשתית. כעת המדגם מוכן להצבה על מחזיק חיתוך.
9. יש להניח טיפה של OCT על טבעת מחזיק קר. הכנס מיד את הדגימה הקפואה לטיפה.
10. חותכים קטעים בעובי 10-20 מיקרומטר, מכוונים את טמפרטורת הקריוסטט ל-19 מעלות צלזיוס. השאירו את השקופיות עם החלקים המצורפים על פלטפורמת חימום למשך ~2-3 דקות (41 מעלות צלזיוס) בחושך כדי להבטיח הידבקות יציבה של החלקים.
11. הכניסו את המגלשות לקופסת אחסון ושמרו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

7. צביעה חיסונית של חלקי רשתית

1. הוצא את השקופיות עם החלקים מהמקפיא. תן להם להישאר בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת כדי להסיר את העיבוי.
2. הקף את החלקים בחוסם נוזלים כדי ליצור מחסום לדגירה נוספת.
3. הנח את השקופיות לתוך קופסת הדגירה. יש לכסות את תחתית הקופסה במים כדי למנוע אידוי של תמיסת הנוגדנים.
4. שוטפים עם PB למשך 5 דקות.
5. הכן את אותם פתרונות מכתים ובצע את השלבים כמו בשלב 5. הדגירה עם הנוגדן הראשוני היא לילה ועם שעה משנית. אל תשתמש בזכוכית שבורה בין הכיסוי למגלשה.

תוצאות

הוכחו כאן שני ניסויים מייצגים הנהנים משימוש בקרום PTFE שעבר הידרופיל לתמיכה ברשתית שלמה במהלך הליכי צביעה. הניסוי הראשון מדגים את השיטה לאפיון מהיר ופשוט של כלי דם ברשתית, רשת משוכללת של כלי דם המשתרעים על פני שכבות רשתית מרובות (איור 2). גישה זו משלבת העמסת בולוס של איזולקטין עם תיוג טבילה עם SRH. זוהי שיטה יעילה לתיוג רקמות חיות שניתן לדמיין ולסרוק כמעט מיד. ברשתית, כלי דם יכולים להיות מסומנים מהשכבה השטחית לשכבה העמוקה (איור 2E). בניגוד ל-SRH מפוזר היטב יחסית, איזולקטין אינו מחלחל היט...

דיון

התאימות הביולוגית והשקיפות הגבוהה של קרום ה-PTFE ההידרופילי בתמיסות היא יתרון בעבודה עם רקמה חיה. תכשיר זה שימש בהצלחה בעבודות קודמות להקלטות מהדק טלאי של תגובות אור^8-10. כאן, אנו מראים כיצד ניתן לאמץ גישה זו לניתוח מבני של הרשתית השלמה.

ניתן להשתמש ביעילות בטכניקת העמסת הבולוס לתיוג רקמות חיות. טכניקה זו נעזרת בתמיכה המבנית של תוספת הממברנה. היישומים כוללים טעינה של מחוון סידן⁹, צביעת הרקמה עם הסמנים הפלואורסצנטיים¹¹, או ליגנדים מסומנים¹².

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תוספת תרבית תאים מילי-תאית, 12 מ"מ, PTFE הידרופילי (Biopore), 0.4 μ m	Millipore	PICM01250
מזרק אינסולין, 1 מ"ל	Beckton Dickinson	309659
מספריים	Fine Science Tools	15003-08	מלקחיים לדיסקציה
, Dumont #55, inox	Fine Science Tools	11255-20	דיסקציה
Cryostat	Leica
	Nikon	זכוכית נימית שונים
	מכשירי דיוק עולמיים	1B150F-4
P-97 חולץ מיקרופיפטה בוער/חום	סאטר מכשיר ושות'.
Picospritzer III	Parker Hannifin
כלי תרבות תחתון זכוכית	MatTek Corporation	P35G-0-14-C
צלחת פטרי	Falcon	1008
פיפטות העברה חד פעמיות מדורגות	VWR	16001-180
צלחות Multiwell, 24 בארות	בקטון דיקינסון	351147
זכוכית כיסוי, #1	מדעי מיקרוסקופיית אלקטרונים	72200-30
שקופיות הידבקות פוליזין	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית	63412-01
שקופיות מיקרוסקופ	גלובוס	1301
חוסם	נוזלים מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית	71312
VECTASHIELD הרכבה בינונית	מעבדות וקטור	H-1000
OCT בינוני	סאקורה	4583
סרט מעבדה פרפילם	פישר	13-374-10
דאו קורנינג גריז ואקום גבוה	סיגמא-אולדריץ'	Z273554
עכבר אנטי-PSD95	Millipore	MABN68
נוגדן חמור נגד עכבר Alexa 568	Invitrogen	A10037	נוגדן
איזולקטין Alexa 488	Invitrogen	I21411
Chemiblocker	Chemicon	2170S
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
Sulforhodamine	Sigma-Aldrich	341738
Carbodiimide	Thermo Scientific	22980	EDC
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148