בשימוש נפוץ, שיטות נגישות ביותר לבחינת נדידת תאים ופלישה במבחנה מתוארות. השיטה הראשונה היא assay סגירת פצע תא המודד את תנועתיות תא. השיטה השנייה היא assay ההגירה והפלישה transwell שמעריך את chemotactic וקיבולת פולשני של תאים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
הגירה היא תכונה מרכזית של תאים חיים וקריטית להתפתחות תקינה, תגובה חיסונית ותהליכי מחלה כגון גרורות סרטניות ודלקת. שיטות לבחינת נדידת תאים שימושיות מאוד וחשובות למגוון רחב של מחקר ביו-רפואי כגון ביולוגיה של סרטן, אימונולוגיה, ביולוגיה של כלי הדם, ביולוגיה של התא וביולוגיה התפתחותית. כאן אנו משתמשים בנדידה ופלישה של תאי גידול כדוגמה ומתארים שתי בדיקות קשורות כדי להמחיש את השיטות הנפוצות והנגישות למדידת תהליכים אלה. השיטה הראשונה היא בדיקת סגירת פצע תרבית תאים שבה נוצרת שריטה על חד-שכבת תא קונפלואנט. ניתן לכמת את מהירות סגירת הפצע ונדידת התאים על ידי צילום תמונות במיקרוסקופ הפוך רגיל בכמה מרווחי זמן. ניתן לתעד התנהגות נדידת תאים מפורטת יותר באמצעות מערכת המיקרוסקופיה של זמן-lapse. השיטה השנייה המתוארת במאמר זה היא בדיקת נדידת תאים ופלישה טרנסוול המודדת את יכולת התנועתיות והפולשניות של התאים לעבר שיפוע מושך כימותרפיה. מטרתנו היא לתאר את השיטות הללו בצורה נגישה ביותר כך שניתן יהיה לבצע את ההליכים בהצלחה במעבדות מחקר אפילו רק עם הגדרה בסיסית של ביולוגיה של התא.
מבוא
תנועתיות היא תכונה חיונית של תאי חיים. נדידת תאים מעורבת בתפיסה של חיים, התפתחות עוברית, תגובה חיסונית, ורבים תהליכים פתולוגיים כגון גרורות סרטן ודלקת 1-9. לכן, שיטות ללמוד התנהגות נדידה סלולרי הן כלי מחקר שימושיים מאוד עבור מגוון רחב של תחומים במדעים ביו ושדות, ביולוגיה, הנדסה גנטיות, קשורים.
המחקר של נדידת תאים בחקר הסרטן הוא עניין מיוחד כגורם העיקרי למוות בחולי סרטן קשור להתקדמות גרורתי. על מנת שהסרטן להתפשט ולהפיץ בכל הגוף, תאים סרטניים חייבים לנדוד ולפלוש דרך מטריצה תאית (ECM), intravasate למחזור דם, לצרף לאתר מרוחק, ובסופו extravasate כדי לי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. Assay סגירת פצע תרבית תאים
- ניתוק תאים מצלחת תרבית הרקמה באמצעות 0.25% פתרון טריפסין-EDTA. גלולה תאים בצינור חרוטי 15 מיליליטר על ידי צנטריפוגה, לשאוב supernatant, מחדש תאים להשעות תקשורת והתרבות. פלייט המספר המתאים של תאים בצלחת 6 היטב למפגש 100% ב24 שעות.
הערה: ייתכן שתהיינה צורך בדיקות כדי לקבוע את הזמן ואת מספר התאים כדי להשיג מפגש 100% בשל סוג התא ואת גודל בשימוש גם (לדוגמא, 1 x 10 6 B16F10 תאים מלנומה הם זורעים בטוב של צלחת 6 היטב 24 שעות לפני דור הפצע). לחלופין, ניתן להשתמש ב12 גם צלחות או 24 גם.
הערה: אם....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
Assay פצע הסגר וassay נדידת תאי transwell מוצג כאן בוצעו באמצעות תאים מלנומה B16F10 העכבר כמודל למערכת. ב assay סגירת פצע, B16F10 תאי זרע בצלחת תרבית רקמת 6 היטב ומבוגר כדי מפגש 100% ב24 שעות. פצע של רחב כ 700 מיקרומטר נוצר באמצעות פיפטה קצה וסגירת הפצע (נדידת תאים) נרשם באמצעות מיקרוסקופיה הזמן לשגות. לחלופין, סגירת פצע יכולה להיות גם למדה על ידי לקיחת תמונות תמונת מצב בנקודות זמן שונה, אם מיקרוסקופיה זמן לשגות אינה זמינה 1. ארבעה תמונות מסדרת הזמן לשגות ב 0, 4, 8, ונק.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
נדידת תאים היא היבט חשוב ללמוד בחקר סרטן וזה יכול להיות מיושם גם ללימודי ריפוי התפתחותיים, חיסוניים ופצע. תרבית התאים בסופו של assay סגר ומבחני נדידת תאי transwell והפלישה לחשוף מידע מפורט של התנהגויות נדידת תאים ויכולים לשמש כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים של תא הגירה 1,2,10,14. המחקר שלנו השתמש במבחני תנועתיות תא אלה כדי לקבוע את מהירות הגירה ופלישת היכולות של שורת תאים מלנומה B16F10.
Assay סגירת .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
המחברים מודים למייק מיילס, סם סונדרס ו-C.W. אלטון משירותי המולטימדיה והטכנולוגיה של ECU על הסיוע בהפקת וידאו. אנו מכירים בתמיכת המענק מהמרכז הביוטכנולוגי של צפון קרוליינה, שחקני גולף נגד סרטן, קרן התרומות של האחים ברודי, איגוד הלב האמריקאי וקרן המחקר והחינוך לסרטן ECU/Vidant (L.V.Y. ו-M.J.R).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| דולבקו s שונה Eagle medium (DMEM) | Gibco | 11995-073 | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | אלבומין סרום בקר 100106 | ||
| (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| Trypsin EDTA 0.25% | Gibco | 25200-056 | |
| Dulbecco' s תמיסת מלח חוצץ פוספט (DPBS) | Gibco | 14190-250 | |
| סגול קריסטל | סיגמא | C0775-100G | מומס במים ב-0.2% |
| מאגר ניתוק תאים | Gibco | 13151-014 | |
| חממת תרבית תאים | Thermo Fisher Scientific | Model # 3145 | |
| מכסה המנוע לבטיחות ביולוגית SterilGARD | The Baker Company, Inc. | דגם # VBM-600 | |
| EVOS Fl מיקרוסקופ הפוך | תרמו פישר מדעי | דגם # AMF-4302-US | |
| צלחת תרבית רקמות | בקטון דיקינסון | 353046 | המספר הקטלוגי משתנה בהתאם לסוג צלחת התרבות |
| הכנס קורנינג טרנסוול | פישר | 07-200-150 | המספר הקטלוגי משתנה בהתאם לגודל הנקבוביות של הממברנה |
מקורות
- Castellone, R. D., Leffler, N. R., Dong, L., Yang, L. V. Inhibition of tumor cell migration and metastasis by the proton-sensing GPR4 receptor. Cancer Lett. 312 (2), 197-208 (2011).
- Hall, A. The cytoskeleton and cancer. Cancer Metastasis Rev. 28, (2009).
- Lau....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
