אבלציה של תא בודד משמונה תאי עוברים של סרטנאים Amphipod<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

סיכום

Hawaiensis amphipod Parhyale הוא אורגניזם מודל מבטיח ללימודים של אמבריולוגיה הסרטנים ופיתוח arthropod השוואתי ואבולוציה. פרוטוקול זה מתאר שיטה להסרה ידנית של לסטומרים אחד מעוברים בשלב המוקדמים של מחשוף Parhyale.

תקציר

Hawaiensis amphipod Parhyale הוא סרטנים קטנים שנמצאו בבתי הגידול ימיים intertidal ברחבי העולם. במהלך העשור האחרון, Parhyale התפתחה כאורגניזם מודל מבטיח למחקרי מעבדה של פיתוח, מתן השוואת קבוצת חוץ שימושית לאורגניזם מודל arthropod למד היטב תסיסנית. בניגוד לשסעים לי עובריים של תסיסנית, השסעים המוקדמים של Parhyale הם holoblastic. מיפוי גורל באמצעות צבעים נותב מוזרקים לתוך לסטומרים מוקדם הראו כי כל שלוש השכבות הנבט והקו נבט נקבעו בשלב שמונה תאים. בשלב זה, שלושה לסטומרים נגזר על להצמיח האאקטודרם, שלוש נגזרו על להצמיח המזודרם, ושני לסטומרים הנותרים הם המבשרים של הקו האנדודרם ונבט בהתאמה. עם זאת, ניסויי אבלציה blastomere הראו כי עוברי Parhyale גם להחזיק capabiliti רגולציה משמעותיתes, כזה גורלות לסטומרים ablated בשלב שמונה התא ניתן השתלטו צאצאים כמה לסטומרים הנותר. אבלציה Blastomere כבר בעבר שתוארה על ידי אחת משתי שיטות: הזרקה וההפעלה הבאה של צבעי phototoxic או אבלציה הידנית. עם זאת, photoablation הורג לסטומרים אך אינו מסיר את התאים המת מהגוף את העובר. ההסרה פיזית מלאה של לסטומרים ספציפי ולכן עשויה להיות שיטה מועדפת של אבלציה עבור יישומים מסוימים. כאן אנחנו מציגים פרוטוקול להסרה ידנית של לסטומרים אחת מבמת שמונה התאים של עוברי Parhyale, הממחיש את המכשירים ונהלים ידניים הכרחיים להסרת תאי הגוף מלאה, תוך שמירה על לסטומרים שנותר בחיים ושלמים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על כל תא Parhyale בשלב שמונה תאים, או ללסטומרים שלבי מחשוף המוקדם אחרים. בנוסף, באופן עקרוני בפרוטוקול זה יכול להיות ישים לקליאה המוקדמתעובר שלב vage של חסרי חוליות ימיות holoblastically ביקוע אחרות.

מבוא

Hawaiensis Parhyale סרטני amphipod התפתחה בעשור האחרון כאורגניזם מודל מבטיח עם פוטנציאל גדול לשימוש במחקר בביולוגיה התפתחותית אבולוציונית ^1. בין פרוקי הרגליים, רוב מערכות מודל הן חרקים, ולמדו נרחב ביותר של אלה הוא זבוב הפירות melanogaster דרוזופילה. ד melanogaster הוא חבר Diptera כדי חרקים, וכמו תכונות עובריות רבות מציג באופן שנגזרות ביחס לאלו של חרקים basally הסתעפות ^2. יתר על כן, חרקים מקוננים בתוך subphylum Pancrustacea ^3, כלומר יש לי חרקים קרובי המשפחה הקרובות ביותר שלהם בתוך הקבוצה ארוכת השנים "הטבעית" בשם pancrustaceans, וכי קבוצה זו היא paraphyletic. הדבר מצביע על כך, בנוסף להסתעפות basally דגמי חרקים, מחקרים של סרטנים אחרים נדרשים כדי לקבל תצוגה רחבה יותר של ההיסטוריה האבולוציונית של התכונות התפתחותיותמנגנונים מולקולריים nd שנחקרו כל כך טוב בד melanogaster. עם זאת, מעט מאוד סרטנים כבר מבוססים היטב על ניתוח מעבדה ניסיוני של פיתוח. Amphipod פ hawaiensis היא מערכת מודל מעבדה צייתנית מאוד, נוחה למגוון של טכניקות ניסוי. Amphipods להציג תכונות ייחודיות רבות בתוך superorder ההורה שלהם Peracarida (מינן חוף, סקדים, ושרימפס היטב), ולכן חשב שניתן להפיק יחסית בתוך קבוצה זו של סרטנים. עם זאת, קלות היחסית של מניפולציה גנטית עוברית ופונקציונלית המוצע על ידי Parhyale להפוך amphipod זו תוספת רבת ערך למלאי הנוכחי של אורגניזמים מודל.

כחיות מעבדה, פ hawaiensis מציע יתרונות רבים. בעלי חיים הם סובלניים למגוון רחב של טמפרטורות ומליחות, ולשרוד גם בתרבויות גדולות של מי ים מלאכותי ^1. זה קל להבחין betwזכרים ונקבות een מבוססים על הבדלים מורפולוגיים ברורים, בעיקר, איברים הגדולים, מכור, תא מטען קדמי כי גברים להשתמש בו כדי לתפוס את הנקבות בעת ההזדווגות. לעבודה עוברית והתפתחותי, פ יש hawaiensis כמה תכונות מושכת מאוד. עובר נמשך כ 10 ימים והזמן לבגרות מינית הוא כשישה שבועות ב28 º C (אבל שים לב שParhyale שורד גם בטמפרטורות הנעות בין כ 20-30 º C, וכי מידע בימוי התפתחותית מפורט נגיש לעוברים הועלו ב18 º C ⁴ , 25 C º ^4, ו26 º C ^5,6). מבוגרים הזדווג בכל ימות במעבדה השנה, כך שהעוברים זמינים בכל עת של שנה. נקבות מטיל 2-20 (תלוי בגיל של נקבה) ביצים המופרות לתוך כיס דגירה הגחון ממוקם בין כמה הזוגות הראשונים של רגליים (איורים 1 א ו 1 ב '), ואפשר לאסוף עובר אלהזה מוקדם מאוד בפיתוח בלי להרוג את הנקבה או פגיעה בעוברים (איור 1 ג). העוברים לשרוד במי ים מלאכותיים מסוננים דרך לבקיעה, יכולים להיות קבועים לביטוי גנים שלאחר מכן או ניתוח היסטולוגית ^7, ושולחן היערכות מפורט מאפשר זיהוי מדויק של ההתקדמות בפיתוח ^5. פרוטוקולים חזקים שימשו כדי לבצע ניתוח ביטוי גנים על ידי הכלאה באתר ^8-15 או immunostaining ^4,16,17, מציאה פונקציונלית על ידי התערבות RNA ^13,15 או ¹² morpholinos, וקו נבט יציב Transgenesis ^18. שימוש במערכת transgenesis, הביטוי מושרה ¹⁴ ומלכודת משפר גם ¹⁹ שיטות יכולות לשמש כדי לחקור את תפקוד גן בפ hawaiensis. בעוד רצף הגנום זמין לציבור אינו זמין כרגע, יש transcriptome מכיל תעתיקים נוצרים במהלך oogenesis ועובר דבורהn דה נובו התאסף ומבואר ^20, והופקד במסד נתונים לחיפוש ^21, הנחיית גילוי גן. לסיכום, פ hawaiensis הוא אורגניזם מודל צייתן מאוד מתאים לגישות ניסיוניות וגנטיות רבות להבנת התפתחות.

בניגוד לשסעים לי עובריים המוקדמים של ד melanogaster, פ עוברי hawaiensis לדבוק holoblastically הבא (איור 2 א) הפריה. ניתוח התחקות שושלת הראה כי על ידי מחשוף שלישי, כל אחד מלסטומרים המחשוף השלישי נגזר במיוחד כדי להצמיח אחד משלוש השכבות נבט או הקו נבט ⁶ (איור 2). נתונים אלה, יחד עם נתוני microarray ^22, שושלת תא מנתח ^6,23, וניסויים בידוד blastomere ⁴ הראו כי פוטנציאל התפתחותי מופרד ללפחות חלק לסטומרים מחשוף שלישי בירושה סימטרית של celגורמי גורל ליטר. בהתאם לכך, בניסויי אבלציה blastomere שבמבשר שורת הנבט (שמכונה "G" במינוח שושלת תא Parhyale ⁶⁾ הוסר בשלב התא שמונה, עוברים חסרי תאי נבט בשלבי התפתחותיים מאוחרים יותר ^4, כפי שצוינו על ידי ההעדר של תאים המבטא את החלבון ושה, אשר מהווה סמן שורה נבט ברוב metazoans ^24. לעומת זאת, ניסויי אבלציה blastomere גופניים הראו כי פ עוברי hawaiensis גם בעלי יכולות רגולציה משמעותיות, כך שגורלם של מבשר לסטומרים המזודרם או האאקטודרם מלוטש בשלב שמונה תאים שניתן לנקוט על ידי צאצאיהם של חלק מלסטומרים נותר ^25. איך החלפת גורל תא ויסות יכולה להתרחש, ועל ידי לסטומרים סומטיים היקף אימוץ גורל תא אוטונומי, נותר עלום. טכניקות עובריות ניסיוניות כגון אבלציה blastomere יכולות להיות שימושיות במבדינג האוטונומיה היחסית וnonautonomy של החלטות גורל תא ^26,27 ולכן עניין במחקר של פ עובר hawaiensis.

בניסויים שהדגימו החלפה רגולטיביות של שושלות ectodermal וmesodermal, אבלציה blastomere בוצעה על ידי הזרקה ²⁸ והעירור הבא של צובעת phototoxic ^25. אמנם שיטה זו היא יעילה להרוג blastomere (ים) המוזרק, זה לא להסיר לחלוטין את גוף תאים המת מן העובר. בנוסף, הבדלים שנצפו בין נתונים שנאספו באמצעות שושלת תא לשלבי gastrulation של עובר על ידי הזרקת לסטומרים עם קליעים נותבים שושלת ניאון ^28,29, ונתונים שנאספו על ידי ביצוע לסטומרים מוטרד באמצעות פיתוח של אותו שלבים עובריים ^23. ההסרה גופנית מלאה של לסטומרים ספציפי ולכן עשויה להיות שיטה מועדפת של אבלציה עבור יישומים מסוימים.

אנחנו שפורסמו בעבר התוצאות של שושלת תא ניתוחים של עוברים שבו תאים בודדים היו ablated ²³ באופן ידני. יחד עם זאת, הפעולות העדינות נדרשו להסיר לסטומרים אחד מעוברים בשלב מחשוף מוקדמים טרם תוארו באופן מלא. כאן אנו מציגים פרוטוקול לאוסף של פ עוברי hawaiensis ואבלציה הידנית של blastomere בודד מעובר בשלב שמונה תאים. מטרתה של שיטה זו היא להשיג הסרה מלאה של גוף התא מהעובר, ומאפשר התבוננות בהתנהגויות הסלולר ויכולות גורל תא של התאים שנותרו בעובר והתפתחות פוסט עוברי. הפרוטוקול שלנו מראה הסרת g שורת נבט המבשר (איור 2 ג), אבל יכול להיות מיושם על כל תא בשלב שמונה תאים, או ללסטומרים שלבי מחשוף קודם לכן. באופן עקרוני, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם להסרת תאים בודדים מעוברי שלב מחשוף המוקדמים של other holoblastically ביקוע חסרי חוליות ימיות.

פרוטוקול

תגובות שעשויות להיות מועילים בביצוע צעדים מסוימים מסומנות בכתב נטוי.

1. יום 1: הכנה של חומרים

1. הכן את החומרים הבאים (ראה טבלה של חומרים וציוד):
   • 15 סנטימטר ו22 טפטפות פסטר סנטימטר
   • סופר יהלומים
   • מי ים מלאכותי מסונן (מליחות בין 0.0018-.0020) המכילה 1 מ"ג / מיליליטר Amphotericin B (1:100 של פתרון מניות 100 מ"ג / מיליליטר), 100 יחידות / מיליליטר פניצילין ו100 מ"ג / מיליליטר סטרפטומיצין (01:50 של פתרון מניות המכיל 5,000 / מיליליטר יחידות פניצילין ו -5,000 מ"ג / מיליליטר סטרפטומיצין)
   • מים מסוננים מלאכותיים ים (מליחות בין 0.0018-0.0020) ללא תוספים
   • מיכל פלסטיק גדול לזוג לדיור (לפחות 15 סנטימטר x 15 סנטימטר X 5 ס"מ)
   • צלחות פטרי קטנות (3 סנטימטר או 5 ס"מ) מרופדות בSylgard
   • צלחות פטרי (3 סנטימטר או 5 ס"מ) קטנות
   • watchglass או זכוכית רב גם
   • מלקחיים (אנו משתמשים במלקחיים בוטים נגזרים לכאן ולכאןמלקחיים מ 'ישן דומון # 5 שנפגעו בטעות בנהלי מעבדה אחרות, שיש לנו לשנות את ייעודו באמצעות מלקחיים חידוד אבן, כדי להבטיח שקצות המלקחיים חלקים, ששני שיניים הן באותו אורך, ושכבר אין להם נקודות חדות. מלקחיים עדינים ביותר, כגון דומון # 5 מלקחיים חדשים, אינם רצויים כיוון שהם עלולים לפגוע בעוברים ו / או נקבות).
   • פיפטה פסטר עם הסוף התרחבה (ראה שלב 1.2 להלן)
   • כלי אחזור עובר מורכב מחוט דק, מעוקל טונגסטן מוטבע לתוך הסוף הדק של פיפטה פסטר (יכולים להיות מוחלפים על ידי חלופה ליישם; לראות 1.3 להלן)
   • פיפטה בפה עם פתח קטן (ראה שלב 1.4 להלן)
   • מחט זכוכית עשויה מזכוכית משך נימים (ראה שלב 1.5 להלן)
   אין חומרים רעילים לבני אדם נמצאים בשימוש בפרוטוקול זה. עם זאת, חוקרים צריכים להבטיח שהם לובשים כפפות או הלבוש מגן אחר כפי שנדרשו על ידי guidel ניהול הסיכוניםאינס של המוסד שלהם.
2. כדי להפוך את פיפטה התרחבה פסטר, ציון בסיבוב הראשון פיפטה פסטר 15 סנטימטר בנקודה שבי פיפטה תתחיל לצמצם עם סופר יהלומים, לעטוף את האזור קלע של פיפטה במגבת Kimwipe או נייר כדי להגן על האצבעות, ולאחר מכן בזהירות לשבור את הקצה בקו הציון. החזק את קצו השבור של פיפטה מעל להבת מבער בונזן במשך כמה שניות כדי להחליק את הקצוות. הפתיחה צריכה להיות מעט צרה יותר מהרוחב המרבי של טפטפת.
3. על מנת להפוך את הכלי לנתח תיל טונגסטן, הכנס תיל טונגסטן לסוף הזכוכית פיפטה פסטר 15 סנטימטר, ומחזיק לזמן קצר על אש מבער בונזן כדי להמס את הזכוכית, תיקון החוט במקום. שימוש במלקחיים בעדינות לעקומת קצה החוט לצורת מכור. ראה איור 3 לדוגמה לצורה מתאימה לכלי הזה.
4. כדי להפוך את פתח קטן לפיפטה בפה, למשוך את הקצה הדק של פיפטה פסטר 22 סנטימטר לשני החלקים ovאה להבה, ולשבור את הקצה של הקצה הקטן. הכנס לסוף בעל פיפטה בפה.
5. הפוך את מחט הזכוכית שתשמש לנקב לסטומרים של עניין במהלך הליך אבלציה באמצעות חולץ מחט. מחט בצורה כראוי מוצגת באיור 4. מחט זו משכה על חולץ מחט p97 סאטר באמצעות תכנית עם פרמטרים 2x (חום = 566, למשוך = 100, מהירות = 20, זמן = 250) + 1X (חום = 566, למשוך = 100, מהירות = 100, זמן = 250). התכנית הספציפית והמכשיר משמש לייצור את המחט יכולים להשתנות, אבל המחט חייבת להיות נקודה עדינה, ועם זאת גם להיות יציב מספיק כדי לא לשבור כאשר דחף נגד סיסית של העובר.

2. יום 1: זוגות התכנסות Parhyale מזווגים

1. השתמש פיפטה פסטר התרחבה (שלב 1.2 לעיל) כדי לאסוף הזדווגות פ זוגות hawaiensis מיכל התרבות הגדול, ולהעביר אותם למכל המכיל ג נפרדלהישען מי ים מלאכותי. אין זה הכרחי כי מי ים זה להיות מסונן. עדיף לאסוף זוגות הזדווגות בשעתי אחר הצהריים המאוחרים ולהשאיר את הזוגות בטמפרטורת חדר (20-23 מעלות צלזיוס) בלילה, כך שלמחרת בבוקר, רוב העוברים יהיו כבר מופרים לאחרונה והופקדו, ולכן במחשוף שלבים המוקדם מתאים אבלציה. לאסוף לפחות 20 זוגות הזדווגות כדי להבטיח שכמה נקבות תהיה נשיאת עוברי שלב מוקדם על ידי מחשוף למחרת בבוקר.

3. יום 2: התכנסות Parhyale עוברים

• בוקר למחרת, להחדיר מי ים מלאכותי מסונן (FASW) עם CO _2. כמה מהנשים תהיה בשחייה חופשית מהזכרים שלהם במהלך הלילה; לאסוף נשים מופרדות אלה ומרדימים אותם בFASW / CO _2. הזכרים מזווגים הנותרים ניתן להסיר מיכל זוג הזדווגות וחזרו לתרבות הגדולה. זוגות הזדווגות שנותרו ניתן לשמור לאוסף עובר מאוחר יותרביום או ביום שלמחרת.
• העבר את הנקבה מורדמת אחת נושאת עובר לזכוכית שעון בFASW / CO _2. כל הנקבות מופרדות צפויות הפקידו ביצים, שיהיה גלוי על ידי העין כורודה חיוור או סגולים הספרואידים דרך צלחות coxal השקופה של הנקבות (איור 1 א). כדי לקבוע אם הם עובר בשלבי מחשוף מוקדמים ובכך מתאים לאבלציה blastomere, החוקר צריך להסיר את העוברים מהכיס להרהר ולבחון אותם תחת מיקרוסקופ.
• צופה בהליך תחת מיקרוסקופ לנתח, לתפוס את צלחות coxal לאורך צד אחד של הגוף עם מלקחיים. עוברים יהיו גלויים בכיס הדגירה הגחון בין צלחות coxal אלה (איור 1).
• להכניס את הכלי הדק, מעוקל תיל (איור 3; צעד 1.3 לעיל) אל הקצה האחורי של כיס הדגירה, ועדינות להרים את החוט לקראת הסוף הקדמי של הנרתיק להרהר להפריד הגוזליםכיסויי נרתיק (אלה הותאמו נספחים הגחון נקראים oostegites ^30), שפתח את הכיס והתרופפות העוברים. עוברים שנמצאים בשעה הראשונה של שהניח כולם סגורים בתוך קרום דק מאוד ושקוף שיהיה בקלות להיות מופר על ידי כלי התיל; קרום זה נעלם על ידי כ 2-3 שעות לאחר הטלת ביצים, ועוברים אינם מאוגדים לזה או לנקבה בכל דרך מנקודה זו ואילך בכל עובר. אם חוקרים מוצאים את זה לא נוח או קשה לתמרן את כלי התיל המעוקל להסיר את העוברים מכיס הדגירה, אלטרנטיבי ליישם עשוי לשמש, כל עוד התנועות עדינות ולא בלחץ קשה מוחל על העוברים או את כיס הדגירה. כלים אחרים מתאימים להסרת עוברים מכיס הדגירה כוללים מלקחיים קהות או נימי זכוכית עם קצה אטום ומוחלק.
• השתמש פיפטה 15 פסטר סנטימטר ללא שינוי כדי לשטוף מים דרך כיס הדגירה נפתח, דוחף החוצה tהוא עובר, שאמור ליישב לתחתית של זכוכית השעון. העבר את הנקבה כדי לנקות FASW (ללא CO _2), כדי לאפשר התאוששות לפני reintroducing לתרבות המרכזית. ניתן להציב נקבות מרובות לתוך את אותה המנה התאוששות, אלא לאפשר נקבות כדי להחלים לחלוטין לפני שמחזירים אותם לתרבות הראשית, כיוון שהם עלולים להיאכל על ידי בעלי חיים אחרים אם הם עדיין מורדמים באופן חלקי.
• השתמש פיפטה 15 פסטר סנטימטר ללא שינוי להעביר את העוברים לצלחת פטרי עם FASW הנקי, ולהציג תחת מיקרוסקופ כדי לקבוע בשלב העוברי שלהם. עוברים נפרדים שנמצאים במחשוף השלישי (שלב 4 ^5), אשר מתאים להליך זה. זה צריך להיות אפשרי גם להחלת פרוטוקול זה לכל שלב מחשוף לפני היווצרות דיסק נבט (שלבי ^7-8 מאי).

4. תאים בודדים ablating: יום 2

1. מלא צלחת פטרי מרופדת Sylgard בשכבה רדודה של FASW. השתמש pi פסטר 15 סנטימטר ללא שינויpette להעביר עובר אחת לצלחת.
2. בעזרת מלקחיים בוטים, בעדינות מגלגל את העובר כדי לזהות את התא להיות ablated (2A דמויות ו2B). גרם מבשר שורת הנבט יכול להיות מזוהה כmicromere הקטן ביותר, היושב על גבי Mav macromere הקטן ביותר. בנוסף, גרם לא ישירות לפנות לתא צמוד, המהווה את micromere ישירות מולו, כמיליליטר micromeres מבשר המזודרם ונתח mr גבול תא באמצע של העובר. Mr הוא blastomere מימין גרם, ו מיליליטר הוא micromere משמאל גרם. Macromeres אחותו של מר, מיליליטר, וחדר הם מבשרי האאקטודרם אה, אל, ופרקים בהתאמה.
3. עם מלקחיים בLEFיד לא אם החוקר הוא ימני (או ביד ימין אם החוקר הוא שמאלי), לכוון את העובר עם התא של עניין לימין (או לשמאל אם החוקר הוא שמאלי), ו בעדינות לתפוס את העובר בין המלקחיים כדי לייצב אותו.
4. באמצעות מחט משכה זכוכית (שלב 1.5 לעיל; איור 4), בעדינות לנקב את התא של עניין. אל תכניס את המחט עמוקה מדי, כדי שלא לדחוף את המחט לתוך תאי שכנים או מתחת לתא של עניין. המחט רק צריכה לנקב את סיסי וקרום תא בסיסי, ואין צורך להאריך עמוק לתוך התא להיות ablated.
5. להחליף את המחט נהגה לנקב את העובר לסוף כוס פיפטה בפה עם קנס הוציאה קצה פיפטה פסטר (שלב 1.4 לעיל). החזק את קצה פיפטה כדי לסגור את החור נוצר בתא של עניין, ולהחיל שאיבה עדינה מאוד.
6. מאוד ללחוץ בעדינות את העובר עם המלקחיים. כמו התוכן של blastoסתם נדחף אל מחוץ לסיסי דרך החור שנוצר בשלב 4.4, למצוץ אותו לתוך פיפטה הפה כדי לאפשר מבט פתוח של העובר. אם החור גדול מספיק, גרעין התא ניקב ניתן לראות לצוץ גם כן. זו בדיקה טובה כדי לוודא את תוכן התא כולו הוסר, ולא יכול להיות מחדש.
7. אנא קראו בעיון את העובר כblastomere של עניין מוסר. הגבול של התא ניקב יהיה לסגת לעבר החור בסיסי, מה שהופך את צמתים של תאי הבסיס נראים לעין. המשך להפעיל לחץ עד שכל blastomere עניין הוסר. שימוש במלקחיים לגלגל את העובר מצד לצד וחזותי לאשר כי כל blastomere של עניין הוא נעלם.
8. באמצעות פיפטה פסטר 15 סנטימטר ללא שינוי, להעביר את העובר כדי לנקות FASW + (מ"ג FASW + 1 / מיליליטר Amphotericin B, 100 יחידות / מיליליטר פניצילין ו100 מ"ג / מיליליטר סטרפטומיצין).
9. הרם עוברים-ablated blastomere בבארות בודדותצלחת 48 היטב נקייה בFASW +, שינוי 50% מFASW-בתוספת האנטיביוטיקה + יומית. בידיים שלנו עוברים לשרוד ולהתפתח היטב, אבלציה אף שלאחר מכן, בטווח של טמפרטורות 18-28 º C. חוקרים צריכים להעלות העוברים שלהם בטמפרטורה אשר יש להם משטח נקי (אך לא בהכרח סטרילי) שעליו להעלות את העוברים עם הפרעה מינימאלית. כדי להיות מסוגל להשוות את העיתוי של אירועים התפתחותיים בעוברים-ablated blastomere עם פקדים, אנחנו מפנים את הקורא למידע היערכות התפתחותית מפורט שזמין עבור עוברים הועלו ב18 º ⁴ C, C º 25 ^4, ו26 º C ^5,6.

תוצאות

בעקבות אבלציה מוצלחת של מחשוף הסינגל השלישי פ micromeres hawaiensis כפי שתואר בפרוטוקול זה, micromeres שנותר לעבור בהדרגה את עמדותיהם במקצת, כדי לכבוש את השטח הכבוש בעבר על ידי blastomere ablated באופן חלקי. לדוגמא, כאשר גרם מוסר, השכנה mr לסטומרים ומ"ל להסיט מעט ובאו לחלוק גבולות תא לרוחב שהיו בעבר בקשר ישיר עם g (השווה איור 2 א ו 2 ג). בעקבות אבלציה מוצלחת...

דיון

אנו מתארים פרוטוקול לאבלציה ידנית וההסרה פיזית מלאה של לסטומרים אחד מהשלבים המוקדמים של מחשוף פ amphipod hawaiensis. אנו מדגימים שימוש בפרוטוקול זה על ידי הסרת תאים גרם מבשר שורת החיידק הבודד מעובר בשלב שמונה תאים, ומראים כי אבלציה הייתה מוצלחת אם תאשר היעדרות של תאי בת של g בעובר מאוחר יותר. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להסיר כל micromeres מהעובר בשלבים מוקדמים מחשוף. כדי להשתמש בפרוטוקול זה כדי להסיר macromeres בשלב זה, או לסטומרי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
15 ס"מ פיפטה פסטר	ויטון	53499-630 VWR	להעברת עוברים שלמים ובלסטומר ממנה לצלחת.
22 ס"מ פסטר פיפטה	וויטון	53499-632 VWR	להכנת קצות פיפטה לפה.
צלחות פטרי 3 ס"מ	Thermo Scientific	25382-334 VWR	השתמשו בחלקם ללא שינוי כדי לאסוף ולאחסן עוברים; צפו חלקם בשכבה של סילגארד (ראו להלן) כדי ליצור משטח עבודה לאבלציה של בלסטומרים.
48 בארות	צלחות Greiner Bio-One	82051-004 VWR	לתרבית עוברים לאחר אבלציה.
מסנני בקבוק 0.2 ומיקרו; m	Nalge Nunc International	28199-296 VWR	ליצירת FASW (ראה להלן).
מבער בונסן	VWR	89038-530 VWR	ליצירת כלי חוט טונגסטן ופיפטה עדינה של הפה.
סופר יהלומים	Musco Sports Lighting	52865-005 VWR	ליצירת פיפטות פסטר בעלות פה רחב לאיסוף זוגות.
מלקחיים	כלים מדעיים עדינים	11050-10 כלים מדעיים עדינים	להחזקת נקבות מורדמות במהלך הוצאת עוברים מכיס הגידול. אלה לא חייבים להיות מלקחיים של דומונט עדינים - הקצוות יכולים להיות קהים לפחות כמו אלה של המלקחיים שעבורם מופיע המספר הקטלוגי כאן.
Fungizone-Amphotericin B	Sigma	A2942 Sigma Aldrich	הוסף ל-FASW לריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל, והשתמש בתמיסה זו לתרבית עוברים שעברו כריתת בלסטומר.
נימי זכוכית באורך 4 אינץ', 1/0.58 OD/ID (מ"מ)	מכשירי דיוק עולמיים	1B100-4 מכשירי דיוק	עולמיים להכנת מחטים לניקוב הבלסטומר שיש להסיר.
שעון זכוכית בקוטר 300 מ"מ	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית	70543-30 מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית	לשימוש בהוצאת עוברים מכיס הגידול של נקבות מורדמות.
מי ים מלאכותיים מיידיים באוקיינוס (ASW)	Instant Ocean	IS160 Aquatic EcoSystems	מייצרים ASW על ידי המסת מלח במים נטולי יונים למליחות של 1.022-1.024.
מי ים מלאכותיים מסוננים מיידיים (FASW)	Instant Ocean	IS160 Aquatic EcoSystems	שימוש ב-0.2 ומיקרו; מסנני m לעיקור ASW. יש להתאפר בכמויות קטנות (< 250 מ"ל) לפי הצורך.
Kimwipes	Kimberly-Clark	21905-026 VWR	לשבירת הקצה העדין של פיפטות פסטר שהותאמו לאיסוף זוגות.
מתאם פיפטה לפה	Drummond Labware	A5177-5EA Sigma Aldrich	הכנס את קצה פיפטת פסטר המשוך דק לקצה זה, שישמש להסרת תוכן תאים מוחצן במהלך הליך האבלציה.
צינורות פיפטה בפה	Aldrich	Z280356 Sigma Aldrich	חתכו את זה כדי להיות ארוך מספיק כדי לתלות בנוחות סביב הצוואר במהלך הליך האבלציה.
מושך מחט	Sutter Instrument Company	P97 Sutter Instrument Company	לייצור מחטים מנימי זכוכית לניקוב הבלסטומר שיש להסיר.
תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין	Mediatech	45000-650 VWR	הוסף ל-FASW לריכוז סופי של 100 יחידות/מ"ל פניצילין ו-100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין, והשתמש בתמיסה זו לתרבית עוברים שעברו הסרת בלסטומר.
נורת גומי	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית	100488-418 VWR	לשימוש בפיפטות פסטר להעברת עוברים ממנה לצלחת.
סילגארד 184	ק. ר. אנדרסון, בע"מ	NC9659604 פישר סיינטיפיק	מייקאפ לפי הוראות היצרן. יוצקים שכבה בעובי 2-5 מ"מ לתוך צלחת פטרי בגודל 3 ס"מ ליצירת משטח עבודה לאבלציות בלסטומרים.
חוט טונגסטן בקוטר 0.004 אינץ'	מערכות A-M	719000 מערכות A-M	השתמש בזה כדי ליצור כלי להוצאת עוברים מכיס הגידול של נקבות מורדמות.