מאמר זה מספק מדריך צעד אחר צעד למתאם טכניקת ניתוח תנודות k-Space תמונת ספקטרוסקופיה (kICS) למדידת מקדמי דיפוזיה של כותרתו fluorescently חלבוני קרום פלזמה בתאי יונקים חיים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
קל מדידה של מקדמי דיפוזיה של חלבונים בממברנה פלזמה מתויגים-EGFP באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם תמונת k-Space
במאמר זה
סיכום
תקציר
דיפוזיה ומידור של חלבוני קרום פלזמה לרוחב מוסדרים בחוזקה בתאים ובכך, לומדות את התהליכים האלה יגלו תובנות חדשות לפונקציה פלזמה קרום חלבון ורגולציה. לאחרונה, מתאם תמונת k-Space ספקטרוסקופיה (kICS) 1 פותח כדי לאפשר מדידות שגרתיות של מקדמי דיפוזיה ישירות מתמונות של חלבוני קרום פלזמה מתויגים פלורסנטי, שנמנעו מהטיות שיטתיות הוצגו על ידי photophysics בדיקה. למרות הבסיס התיאורטי לניתוח הוא מורכב, השיטה יכולה להיות מיושמת על ידי nonexperts באמצעות קוד זמין באופן חופשי למדידת מקדמי דיפוזיה של חלבונים. kICS מחשבת פונקציית מתאם זמן מערימת תמונת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לאחר שינוי פורייה של כל תמונה למרחב גומלין (k-). בהמשך לכך, מיצוע מעגלי לוגריתם, טבעי ולהפוך ליניארי מתאים לפונקציית המתאם מניב את מקדם הדיפוזיה. זהנייר מספק מדריך צעד אחר צעד לניתוח התמונה והמדידה של מקדמי דיפוזיה דרך kICS.
ראשית, תמונה ברצף במסגרת שיעור גבוהה של חלבון קרום פלזמה שכותרתו fluorescently נרכש באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לאחר מכן, באזור של עניין (ROI) הימנעות אברונים תאיים, נע שלפוחית או בולטות אזורי קרום נבחר. ערימת ההחזר על ההשקעה מיובאת לקוד זמין באופן חופשי וכמה פרמטרים שהוגדר (ראה סעיף שיטה) נקבעים לניתוח kICS. התכנית לאחר מכן יוצרת "מדרון של מדרונות" עלילה מפונקציות קורלציה זמן k-המרחב, ומקדם הדיפוזיה מחושב מהשיפוע של העלילה. להלן הליך kICS צעד אחר צעד כדי למדוד את מקדם הדיפוזיה של חלבון בממברנה באמצעות תעלת המים aquaporin-3 הכליות מתויגות עם EGFP כדוגמא הקנונית.
מבוא
ארגון ארבעה ממדי החלל ובזמן והניידות לרוחב של חלבוני קרום פלזמה בחוזקה מוסדרות ועשויים לשחק תפקיד בתפקוד חלבון, פעילות ואינטראקציות בין חלבונים. דיפוזיה רוחבית של חלבוני קרום פלזמה, באופן מסורתי נחקרה על ידי חישוב מקדמי דיפוזיה עבור חלקיקים בודדים מהזמן לשגות הדמיה של נקודה קוונטית או לצבוע את חלבוני קרום הפלזמה שכותרתו 2-4. גישה זו דורשת החדרת תג תאי בחלבון הפלזמה הממברנה לנקודה קוונטית או תיוג צבע, אשר יכול לסכן את קיפול חלבונים ותפקוד ובכך, לא ניתן להשיג עבור חלק מחלבונים. הנפח הסטרי של נקודה קוונטית הוכח להאט דיפוזיה של החלבון 5 ויותר מכך, רק חלק זעיר של החלבונים באוכלוסייה מסומנים עם נקודות קוונטיות, וזה לא ידוע אם חלק קטן הזה הוא נציג לסך בריכה של חלבוני קרום פלזמה. טרה חלקיק יחידהמדידות cking (SPT) של מקדמי דיפוזיה סדרת תמונה של חלבוני שכותרת נקודה קוונטית מכרוכות במיפוי עמדות שיא הדמיה של חלקיקים עם שני גאוס ממדי מתאים אחרי אלגוריתמי ניתוח נרחבים. הניתוח הוא המחשוב מאוד אינטנסיבי, הדורש עקומה שאינה ליניארי נרחב הולמת בכל מסגרת תמונה של רצף הזמן לשגות לקירובים של פונקצית התפשטות נקודת מיקרוסקופ (בדרך כלל שני Gaussians מרחבי ממדי) וקישור הבא של עמדות חלקיקים למסלולי חלקיקים המתאר את תנועה של מולקולות בודדות 6,7.
טכניקת מתאם תמונה שפותחה לאחרונה, מתאם תמונת k-Space ספקטרוסקופיה (kICS) מאפשרת מדידות פשוטות היחסית של מקדמי דיפוזיה של חלבונים מתויגים fluorescently קרום פלזמה. האפשרות לחשב באופן שגרתי מקדמי דיפוזיה של חלבונים בממברנה שכותרתו עם חלבוני ניאון על ידי kICS היא כלי ייחודי המחזיקמספר יתרונות על פני קוונטים מסורתיים מנקדים ניתוח SPT: אין כניסה של תגים תאיים וזמן רב תיוג תאי נדרש (ניתן להשתמש בשורות תאים לבטא חלבוני ניאון); מקדמי דיפוזיה מופקים מכלל המאגר של חלבוני ניאון בהשוואה לקבוצת משנה שכותרתו עם נקודות קוונטיות; הניתוח הוא פשוט ללא הצורך לעקוב אחר חלבונים יחיד והניתוח יכול להתבצע באמצעות קוד קיים, ללא צורך בתכנות משתמש נוסף. השיטה היא מהירה כי זה טכניקת מיצוע המאפשרת חישוב וחישוב מהירים של מקדמי דיפוזיה. מדידות דיפוזיה המהירה אלה לאוכלוסיית החלבון משלימות את מידע תחבורה המולקולרי מפורט יותר שהושג לקבוצת משנה של כלל האוכלוסייה על ידי שיטות SPT מדקדק.
זמן kICS קורלציה רצפי תמונת מיקרוסקופ פלואורסצנטי שראשון הפכו למקום פורייה, ובכך מפריד flתנודות uorescence עקב photophysics מאלו כתוצאה מההובלה מולקולרית 1. כתוצאה מכך, kICS יכול לקבוע את צפיפות המספר, מהירות זרימה, ודיפוזיה של כותרתו fluorescently מולקולות בעת היותו בלתי משוחד על ידי photobleaching המורכב או מהבהב של fluorophores. זה עושה kICS כלי שימושי לקביעת מהירות דינמיקת דיפוזיה של חלבוני קרום תא fluorescently שהכותרת ללא הצורך בכתיבת האלגוריתמים מותאמים אישית. חלבונים חוץ מכותרתו fluorescently, יכול להיות מיושמים גם kICS לחלבוני קרום קוונטים שכותרת נקודה 8.
מאמר זה מספק מבוא צעד אחר הצעד כיצד להשתמש kICS לחלץ מקדמי דיפוזיה של חלבוני קרום פלזמה מתויגים-EGFP ידי המדגים כיצד למקם את היבול, את אופן השימוש בקוד וכיצד להעריך את החלקות שנוצרו, שממנו דיפוזיה מקדמים מחולצים. כדוגמא, נתונים המתקבלים על ידי ספינינג סט דיסק מיקרוסקופיה בהשתקפות פנימית למחצה כוללת לזרוחמצב NCE (TIRF), של חלבון תעלת המים aquaporin-3 כליות (AQP3) מתויגים עם EGFP מוצג.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
רכישה של חלבונים מתויגים EGFP בקרום הפלזמה לניתוח kICS יכולה להיעשות על מיקרוסקופ epifluorescence, התקנת TIRF או על מיקרוסקופ דיסק מסתובב מוגדר לרכוש תמונות של הקרום של עניין. גודל פיקסל המצלמה, כמו גם את הזמן בין מסגרות תמונה הוא זקוק לניתוח. רצפי תמונה של 100-1,200 מסגרות במסגרת שיעור של 4-30 הרץ יכולים לשמש לניתוח. במהלך הרכישה, חשוב לשמור על הקרום בפוקוס לאורך כל תקופת ההדמיה ולהתמקד בחלק של הקרום השטוח שבו הקרינה היא מפוזרת באופן אחיד. העברת שלפוחית, בולט אזורי קרום ואברונים בתא יכול להיות קצוץ מאוחר יותר בתהליך הניתוח. יש לבחור בזמן הרכישה, כך שאין להיסחף או תנועה של התא.
כדי להשיג את תסריטי קוד kICS לMATLAB, פנה לפול וייסמן (Paul.Wiseman @ McGill.ca). בפעם הראשונה קוד kICS משמשת, MAT הפתוחLAB ולחץ על קובץ, נתיב ולאחר מכן קבע, לאחר מכן לחץ על הוספה בתיקיות משנה ולמצוא את התיקייה במחשב שבו קוד kICS ממוקם. לאחר מכן לחץ על OK, לשמור ולסגור. כעת המשכתי עם הניתוח של גידולים מתוארים בנקודות הבאות.
1. ייבא את התמונה ברצף של ריבית לתוכנית ההדמיה ניתוח כסטאק TIFF
שמור את הקובץ בשם: stack1.tif.
- בחר אזור מלבני של עניין (ROI) בחלק השטוח של הקרום לא כולל אברונים בתא מרגשים ובולטים אזורי הממברנה. גודל היבול נבחר כך מספיק נתונים סטטיסטיים המופקים עבור k טוב 2 מגרשים.
- לחתוך את האזור ולשמור את היבול כקובץ TIFF בתיקייה מתאימה. אם יש כמה יבולים מאותו הסרט, השתמש בתוספת מספר, "stack1crop.tif" לדוגמא ", stack1crop2.tif", "stack1crop3.tif".
- מניחים את התיקייה המכילה את הגידולים מקומייםבמחשב, לא בשרת, בעת עושה ניתוח kICS.
2. ייבא את הגידולים לתוכנת אחת ניתוח אחד כדי לבצע את ניתוח
- MATLAB הפתוח והסוג "icsgui" בחלון הפקודה ולחץ על ENTER. ICS GUI הוא שם ההפעלה עבור תכנית ממשק מתאם ספקטרוסקופיה תמונת המשתמש גרפית.
- בGUI ICS לחץ על כרטיסיית "kICS". צילום מסך של חלון הניתוח מוצג באיור 1.
- מצא את התיקייה עם שם התיקייה "קוד MATLAB" ונווט עד הקובץ בשם הקובץ "סקריפטים" ולפתוח את זה על ידי לחיצה הכפולה עליו. לחלופין, לחץ לחיצה ימנית על הקובץ ובחר באפשרות "לפתוח עם MATLAB" או ללכת לקובץ, פתח בMATLAB ולפתוח את קובץ התסריטים. קובץ זה נקרא עורך.
- בגלילה לעורך "kICS טען ערכות נתונים", ואז להעתיק או שם קובץ של סוג ומיקום תיקייה לשורת הפקודה שמתחילהעם "C: Users Documents AQP3dynamics stack1crop.tif" img = למשל. בשורת הפקודה שלהלן את מיקום התיקייה לקבוע את מספר המסגרות להיות מנותחים - למשל [1:500]. השתמש באותן הגדרות עבור כל הסרטים ברציפות בסדרת הנתונים. אם יש סחיפת התמקדות במסגרות מאוחר יותר, אלה צריכים להיות נכללים בניתוח.
- בעורך לחץ על "שמור" ולאחר מכן לחץ על "להעריך תא". בסיס הנתונים כעת נטען לתוך לתוך תוכנת הניתוח.
- בחלון kICS ניתוח בGUI, הזן את ההגדרות עבור הניתוח:
- בטל תיבות "תא T".
- הזן את המספר של זמן מפגר להיות מנותח. מספר פיגורי זמן (τ) יהיה השפעה על עלילת דיפוזיה וחייב להיבחר כך שעלילת דיפוזיה היא ליניארי. התחל עם כניסת 25 ולאחר מכן ירידה למקום שבי עלילת דיפוזיה היא ליניארי. τ הוא מספר בזמן מפגר ניתוח kICS משווה ולעתים חולפים זמן הוא ב הזמןetween מסגרת אחד למשנו. הערך הקטן ביותר שנותן עלילה ליניארית יש לבחור. המספר המרבי של זמן מפגר נבחר כך ליניארי בכושר מתקבל, בחירת ערך גבוה יותר יהיה לייצר נתונים שלא ניתן להתקין קו.
- הזן את k 2 הערך המרבי (ראה עיגול 1 באיור 1), זה בדרך כלל 20-50. K 2 עלילה טובה היא עלילה שבה קיימות נקודות נתונים רבות אשר מופצות לאורך קו. התחל עם כניסת 70 ולאחר מכן ירידה לאחר שהעריך את מגרשי k 2 ודיפוזיה ובחר את הערך הנמוך ביותר שבו נקודות נתוני המקבץ סביב קו ישר. ערך 2 k הוא גודל הריבוע של k-הווקטור המרחבי במרחב פורייה.
בתחילה, הניתוח יש לחזור עד לערכים הטובים ביותר נקבעים, ואז להשתמש באותן הגדרות עבור כל הסרטים ברציפות בסדרת נתונים, אבל תמיד לבדוק שההגדרות שנבחרו לתת בכושר טוב לנתונים: k טוב 2 חלקותועלילת דיפוזיה ליניארי. - לחץ על "הגדרות חנות ולהמשיך".
- לחץ על "כן" כדי להציג את כל הגרפים.
- לחץ על "סדרה טען תמונה" (ראה עיגול 2 באיור 1), ולאחר מכן לחץ על "סביבת עבודה".
- בחר "imgSerCrop", ולאחר מכן לחץ על "יבוא מסביבת העבודה".
- הזן את הגדרות אוסף מערכת הדמיה. ב" גודל פיקסל "תיבה להזין את גודל פיקסל מוקרן למערכת ההדמיה שבה ערימות התמונה נרכשות. לAQP3-EGFP, 0.111 היו בשימוש. בתיבה "הזן את השעה (ים) בין מסגרות", 0.1150 שימשו לAQP3-EGFP.
- לחץ על "בחר ROIs", הזן "1", לחץ על אישור ו" להשתמש בתמונה כולה ".
- לחץ על "ניתוח Do kICS" ולחץ כן לעשות "סינון נייח". תוצאות ייפתחו באופן אוטומטי כתמונות.
- למזער את חלון הגדרות, למזער את Windo מידע תאw, ולמזער את חלון photophysics. בחלון הדינמיקה, בדוק שעלילת דינמיקת תערוכות יניארי התאמה של הנתונים לקו עם שיפוע שלילי, כלומר נקודות נתונים לתאם ודיפוזיה חופשית ניתן להניח. רשום את מקדם הדיפוזיה לפיגור זמן המסוים וk 2 הגדרות (זה לא הכרחי לציין את סטיית התקן של הכושר). נקודות נתונים בk 2 המגרשים חייבים להיות התקבצו סביב הקו בזמן נתון מפגר.
- סמן את התיבה "שמור דמויות פתוחות כתמונות", לאחר מכן לחץ על "שמור דמויות פתוחות כתמונות" כדי לשמור לגרום קבצים. לשמור בתיקייה חדשה תחת C: Users Documents AQP3diffusion. לחץ על "הנתונים הנוכחיים ברורים" ותמשיך עם ניתוח של היבול הבא.
3. הממוצע של המקדם הדיפוזיה מחושבת מחושב כדי לקבל סקירה כללית של הנתונים שנותחו
- הזן את מקדמי דיפוזיה הבודדים מהחזר על השקעה בspreadsheet (הקפד לציין τ וk 2 ערכים), השתמש בשמות של הגידולים כאמור לעיל.
- לחשב את מקדם הדיפוזיה הממוצע וסטיית התקן באמצעות תכנית גיליון אלקטרוני.
- לבצע בדיקת קולמוגורוב-סמירנוב או סטודנטים מבחן t להעריך הבדלים סטטיסטיים באמצעות רמה מובהקת של 5%. השוואות Quantitave בין תאים (לדוגמא שטופלה לעומת nontreated) יכולות להתבצע.
- פתח את הגיליון האלקטרוני הגרסה של חלקות דיפוזיה שנוצרה על ידי תוכנת הניתוח עבור כל יבול, ומחשבים את ממוצע הנתונים עבור כל מצב עבור כל זמן השהיה. ליצור עלילת דיפוזיה ממוצע חדשה להצגת במסמכים או מצגות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
לרכישת ערימות תמונה מתאימות להיות מנותח עם kICS, ניתן להשתמש מיקרוסקופ מערכות שונות. אפשר לנתח רצפי תמונה ממיקרוסקופ עלית הקרינה, כמו גם דיסק התקנת TIRF או ספינינג. הממברנה חייבת להיות שטוחה ללא כל האברונים בתא מרגש גדולים או העברת שלפוחית / אובייקטים. מאמר זה מציג תמונה ברצף הזמן לשגות של AQP3 מתויג עם EGFP בתאי MDCK חיים צילמו על מיקרוסקופ דיסק מסתובב עם פוקוס מוגדר קרום הפלזמה במסגרת שיעור של 9.2 הרץ. המוקד הוקם בקרום הפלזמה הבסיסי (תחתון). לאחרונה פורסמו נתונים בAJP נייד
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מאמר זה הציג סקירת צעד אחר צעד מפורטת של איך ליישם את שיטת ניתוח kICS לקבוע מקדמי דיפוזיה מתמונות מיקרוסקופית של חלבונים מתויגים עם חלבוני ניאון. הניתוח אינו תלוי בבחירת בדיקה עם טווח דינמי רחב מאוד בצפיפות תיוג ולכן יכול להיות מיושם גם לחלבונים שכותרתו עם נקודות קוונטיות, כמו גם צבעים וחלבונים ניאון כגון EGFP.
כדי לחשב את מקדמי דיפוזיה תקף לחלבונים, יש כמה שלבים קריטיים, אשר היה מותאמים. זה חיוני לחלבוני שכותרתו...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מלגה לונדבק Junior קבוצת לידר לLNN. PWW מכיר בתמיכה במימון מענק ממדעי הטבע והנדסת מועצת מחקר של קנדה (NSERC). אנו מודים גם מולקולרי מרכז bioimaging הדנית באוניברסיטת דרום דנמרק לגישה לספינינג מיקרוסקופ דיסק.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
מקורות
- Kolin, D. L., Ronis, D., Wiseman, P. W. k-Space image correlation spectroscopy: A method for accurate transport measurements independent of fluorophore photophysics. Biophysical Journal. 91, 3061-3075 (2006).
- Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 26, 373-399 (1997).
- Bannai, H., Levi, S., Schweizer, C., Dahan, M., Triller, A. Imaging the lateral diffusion of membrane molecules with quantum dots. Nat Protoc. 1, 2628-2634 (2006).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat Methods. 5, 695-702 (2008).
- Pinaud, F., et al. Dynamic partitioning of a glycosyl-phosphatidylinositol-anchored protein in glycosphingolipid-rich microdomains imaged by single-quantum dot tracking. Traffic. 10, 691-712 (2009).
- Wieser, S., Axmann, M., Schutz, G. J. Versatile analysis of single-molecule tracking data by comprehensive testing against Monte Carlo simulations. Biophys J. 95, 5988-6001 (2008).
- Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. Journal of Structural Biology. 151, 182-195 (2005).
- Durisic, N., et al. Detection and correction of blinking bias in image correlation transport measurements of quantum dot tagged macromolecules. Biophys J. 93, 1338-1346 (2007).
- Umenishi, F., Verbavatz, J. M., Verkman, A. S. cAMP regulated membrane diffusion of a green fluorescent protein-aquaporin 2 chimera. Biophys J. 78, 1024-1035 (2000).
- Levin, M. H., Haggie, P. M., Vetrivel, L., Verkman, A. S. Diffusion in the endoplasmic reticulum of an aquaporin-2 mutant causing human nephrogenic diabetes insipidus. The Journal of biological chemistry. 276, 21331-21336 (2001).
- Semrau, S., Schmidt, T. Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data. Biophys J. 92, 613-621 (2007).
- Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application. Biophys J. 65, 1135-1146 (1993).
- Marlar, S., Arnspang, E. C., Koffman, J. S., Løcke, E. M., Christensen, B. M., Nejsum, L. N. Elevated cAMP increases aquaporin-3 plasma membrane diffusion. Am J Physiol Cell Physiol. 306, (2014).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
