אקליפסיה (1991) הכנת גנגליה לניתוחים אלקטרופיזיולוגיים ומולקולריים של נוירונים בודדים

סיכום

חילזון ימי Aplysia californica כבר בשימוש נרחב כמודל נוירוביולוגיה למחקרים על בסיס תאי ומולקולרי של התנהגות. כאן מתוארת מתודולוגיה לחקר מערכת העצבים של Aplysia לניתוחים אלקטרופיזיולוגיים ומולקולריים של נוירונים בודדים של מעגלים עצביים מזוהים.

תקציר

אתגר מרכזי בנוירוביולוגיה הוא להבין את היסודות המולקולריים של מעגלים עצביים השולטים בהתנהגות מסוימת. לאחר זיהוי המנגנונים המולקולריים הספציפיים, ניתן לפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות לטיפול במומים בהתנהגויות ספציפיות הנגרמות על ידי מחלות ניווניות או הזדקנות מערכת העצבים. חילזון ימי Aplysia californica מתאים היטב לחקירות של בסיס תאי ומולקולרי של התנהגות כי מעגלים עצביים שבבסיס התנהגות מסוימת ניתן לקבוע בקלות את המרכיבים הבודדים של המעגלים יכולים להיות מניפולציה בקלות. יתרונות אלה של Aplysia הובילו למספר תגליות בסיסיות של נוירוביולוגיה של למידה וזיכרון. כאן אנו מתארים הכנה של מערכת העצבים Aplysia לניתוחים אלקטרופיזיולוגיים ומולקולריים של נוירונים בודדים. בקצרה, גנגליון מנותח ממערכת העצבים נחשף פרוטאז כדי להסיר את נדן גנגליון כך נוירונים נחשפים אבל לשמור על פעילות עצבית כמו החיה שלם. הכנה זו משמשת לביצוע מדידות אלקטרופיזיולוגיות של נוירונים בודדים או מרובים. חשוב לציין, בעקבות ההקלטה באמצעות מתודולוגיה פשוטה, הנוירונים יכולים להיות מבודדים ישירות מן הגרעינים לניתוח ביטוי גנים. פרוטוקולים אלה שימשו לביצוע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות בו זמנית של נוירונים L7 ו- R15, ללמוד את תגובתם אצטילכולין וביטוי כמותי של גן CREB1 מבודד יחיד L7, L11, R15, ו R2 נוירונים של Aplysia.

מבוא

המוח האנושי מורכב בצורה יוצאת דופן עם כמעט 100 מיליארד נוירונים וטריליוני קשרים סינפטיים. ישנם מספר כמעט שווה של תאים nonneuronal כי אינטראקציה עם נוירונים לווסת את תפקידם במוח. נוירונים מאורגנים במעגלים המווסתים התנהגויות ספציפיות. למרות ההתקדמות בהבנתנו את תפקודי המוח והמעגלים העצביים, מעט מאוד ידוע על זהותם של מרכיבי מעגלים השולטים בהתנהגות מסוימת. ידע בזהויות של מרכיבים שונים של מעגלים יקל מאוד על הבנתנו הן של הבסיס התאי והן של הבסיס המולקולרי של התנהגות וסיוע בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות להפרעות נוירופסיכיאטריות.

חילזון ימי Aplysia californica כבר סוס עבודה לקביעת מעגלים עצביים ביסוד התנהגויות ספציפיות^1-14

פרוטוקול

1. הכנת גנגליה בטן, מדידות אלקטרופיזיולוגיות, ובידוד של נוירונים בודדים שזוהו מגנגליון הבטן של Aplysia californica

1. שמור על Aplysia באקווריום המעבדה עם מי ים מלאכותיים במחזור (ASW) ב 16 °C (60 °F) תחת 12:12 אור:תנאים כהים.
2. בידוד של גנגליון בטן.
   1. הרדמה בעלי חיים על ידי הזרקת 380 mM MgCl₂ פתרון במשך 5-10 דקות (שווה ערך 30-35% ממשקל הגוף של החיה).
   2. זהה את גנגליון הבטן בהתבסס על מיקומו במערכת העצבים המרכזית^24,28.
   3. הסר את הגרעינים על ידי פעולה כירורגית ולאחסן מיד במי ים מלאכותיים המורכבים 450 מ"מ NaCl, 10 mM KCl, 10 mM CaCl₂, 55 mM MgCl₂, 2.5 מ"מ NaHCO₃, ו....

תוצאות

משקלם של בעלי החיים ששימשו במחקר זה נע בין 100-200 גרם. בעקבות הפרוטוקולים המתוארים, ערכנו מדידות אלקטרופיזיולוגיות וניתוח מולקולרי של נוירונים של גרעיני בטן מבודדים מבעלי חיים הנעים בין 2-5 גרם ל -200-300 גרם.

סטנדרטיזציה של טיפול פרוטאז חשוב למדידות אלקטרופיזיולוגיות מוצלחות של נוירונים בגרעינים. בתחילה, ריכוזים מרובים פרוטאז (Dispase) משכי זמן שימשו פוטנציאל פעולה מתפרץ מ R15 נוירון נרשמו^26,31. מדידות אלה הושוו להקלטה ישירה (ללא טיפול פרוטאז) מהגרעונים שלמים. ריכוז הפרוטאז (0.1% .......

דיון

הנוירון R15 מעורב בוויסות מערכות לב וכלי דם, עיכול, נשימה ורבייה³⁰. פעילות מתפוצצת קצבית באופן קבוע של AP היא תכונה של R15. כפי שמוצג בסעיף התוצאות, הקלטה מזווגת של R15 ו- L7 מראה כי הכנת הגרעינים שמרה על פעילות של נוירונים R15. נוירונים R15 ו- L7 הגיבו כראוי לאח. הכנה גרעינית זו יכולה להישמר עד 8-10 שעות ופעילות אלקטרופיזיולוגית יכולה להיות במעקב רציף. לכן, אפשר לחקור את ההשפעות האלקטרופיזיולוגיות של חשיפה נוירוטרנסמיטר קצר (נחשף באופן מקומי לנוירון מסוים או לאמבטיה) במשך תקופה ארוכה של זמן. יתר על כן, אפשר ל.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Aplysia	מתקן המשאבים הלאומי של Aplysia, אוניברסיטת מיאמי
NaCl	SIGMA	S 3014-1KG
KCl	SIGMA	P 9333-500G
CaCl2• 2H2O	SIGMA	C5080- 500G
MgCl2• 6H2O	Fisher Scientific	BP 214-501
NaHCO4	SIGMA	S 6297-250G
HEPES	SIGMA	H 3375-500G
פרוטאז	GIBCO	17105-042
Trizol	Ambion	15596-026
Chloroform	MP Biomedicals	2194002
100% אתנול	ACROS	64-17-5
GlycoBlue	Ambion	AM9515
3 M NaOAc, pH 5.5	אמביון	AM9740
מים ללא נוקלאז	אמביון	AM9737
MessageAmp II aRNA Amplification Kit	אמביון	AM1751
qScript cDNA SuperMix	Quanta Biosciences	95048-100
כוח SYBR ירוק PCR מאסטר מיקס	מערכות ביולוגיות יישומיות	4367659
מלקחיים	כלים מדעיים עדינים	11252-20
מספריים	כלי מדע עדינים	15000-08
נירוסטה סיכות מיניוטין	Fine Science Tools	26002-10 או
26002-20
Veriti Thermal	Cycler Applied Biosystems	Veriti Thermal Cycler
5430R צנטריפוגה	Eppendorf	5430R צנטריפוגה
7900HT מהיר בזמן אמת PCR	יישומי Biosystems	7900HT מגבר PCR
	BRAMP-01R	NPI אלקטרוניקה
Digidata ממיר	Instrutech ITC-18	HEKA ELEKTRONIK
מיקרו מניפולטור	תיקון כוכב	מדעי

מהיר בזמן אמת