חישה של שיבוש טישו גדר עם טרנזיסטור אלקטרוכימי אורגני

אפיתל במערכת העיכול הוא דוגמא של רקמת מכשול, אשר שולטת במעבר של מולקולות בין תאים שונים בגוף. האפיתל מורכב מתאי עמודים מוארכים חברו יחד על ידי קומפלקסים של חלבונים המספקים מכשול פיזי ¹ נגד פתוגנים ורעלים, תוך מתן אפשרות למעבר של מים וחומרים מזינים הדרושים כדי לקיים את הגוף. סלקטיביות זאת בשל הקיטוב של תאי אפיתל, אשר יוצר שני תחומים קרום שונים: בצד apical של התאים שנחשפו ללום והן בצד הבסיסי של התאים מעוגנים על הרקמות הבסיסיות ^2,3. צמתים הדוקים (TJ) הם קומפלקסים של חלבונים המצויים בחלק הפסגה של תאי האפיתל ומהווים חלק ממכלול גדול יותר הידוע בשם צומת הפסגה ^4. זרימת יונים על פני רקמת המחסום עשויה גם ללכת דרך transcellular (באמצעות הסלולרי) או באמצעות paracellular (בין שני תאים סמוכים) מסלול. הסכום שלהתחבורה באמצעות שני המסלולים שמכונה התנגדות transepithelial. צומת הפסגה אחראית על הרגולציה של יונים ומולקולות עוברות על פני המחסום ^5,6 דרך פתח ספציפי ותפקוד סוגר. חוסר תפקוד או שיבוש של קומפלקסי חלבונים אלה קשורים לעתים קרובות למחלה ^7-11. בנוסף, רבים פתוגנים / רעלים enteric ידועים למקד מורכב זה באופן ספציפי, ובכך להיכנס לגוף ומוביל לשלשולים, סביר להניח כתוצאה של חוסר ויסות מסיבית של זרימת יונים / מים על פני המחסום ^12-14. רקמת גדר יכולה גם להיות שונה על ידי שינוי microenvironment תאי. Cadherin הוא חלבון חיוני להידבקות תאי תאים, והוא מעורב ביצירת צומת הפסגה. סידן נדרש לקונפורמציה המבנית הנכונה של cadherin, וירידה בסידן תאי הוכח לגרום להרס של צומת תאי תאים ופתיחה הבאה שלמסלול paracellular בין התאים ^15. במחקר זה, EGTA (גליקול-BIS אתילן (בטא aminoethyl אתר)-N, N, N ', חומצה אצטית N'-טטרה), chelator סידן ספציפי, היה בשימוש כדי לגרום להפרה ברקמת מכשול, שכן יש הוכח יש השפעה מהירה ודרסטית על paracellular יון לזרום ^16,17. chelator סידן זה היה בשימוש על מחוברות וmonolayer המובחן של תא אונליין קאקו-2. בתרבית מוסיף תרבית תאים, קו תא זה ידוע לפתח את המאפיינים של מערכת העיכול ונמצא בשימוש נרחב על ידי תעשיית התרופות כדי לבדוק את הספיגה של תרופות ^18,19.

שיטות לניטור שלמות רקמות מחסום נמצאות בשפע. שיטות אלה הן בדרך כלל אופטיות, בהסתמך על מכתים immunofluorescence של חלבונים מסוימים הידועים להיות בצומת הפסגה ^20, או להסתמך על הכימות של מולקולה נותב ניאון שהיא בדרך כלל בלתי חדיר לרקמות המחסום21,22. עם זאת, שיטות ללא תווית (כלומר ללא fluorophore / כרומופור) עדיפות כמו השימוש בתווית יכולה להיגרם חפצים, ולעתים קרובות מגדיל את העלות וassay הזמן. ניטור של רקמת מחסום חשמלי, ללא תווית התפתחה לאחרונה כשיטת מעקב דינמית ^23. לדוגמא התקדמות טכנולוגית האחרונה בספקטרוסקופיה עכבה החשמלית אפשרה הפיתוח של מכשירים לסריקה זמינים מסחרי ^24,25 שיכול למדוד את התנגדות transepithelial (TER), מדידה של מוליכות יונים על פני שכבת התאים.

אלקטרוניקה אורגנית יצרה הזדמנות ייחודית להתממשק העולם של מוצרי אלקטרוניקה וביולוגיה ^{26,27 28,29} באמצעות פולימרים מוליכים שיכול לנהל שתי נושאות אלקטרוניות ויוניות. שיטה חדשה לאיתור פרצות ברקמת מחסום באמצעות ^30-32 OECT הוצגה לאחרונה. מכשיר זה היה תוקף כנגד טכניקות הקיימותed להעריך שלמות מחסום רקמות, כולל immunofluorescence, מבחני חדירות באמצעות לוציפר צהוב, וספקטרוסקופיה עכבה באמצעות Cellzscope. במקרה של כל התרכובות הרעילות שנבדקו, OECT נמצא לפעול ברגישות שווה או טובה יותר, ועם רזולוציה של זמן מוגבר, בהשוואה לטכניקות שצוינה לעיל. במכשיר זה, PEDOT: PSS, פולימר ניצוח כי הוכח להיות יציב וביולוגי ^33,34, משמש כחומר הפעיל בערוץ טרנזיסטור. OECT מורכב מאלקטרודות ניקוז והמקור משני צדי ערוץ פולימרים מוליכים. זה ממוקם אז במגע עם אלקטרוליט, המהווה חלק בלתי נפרד מהמכשיר. אלקטרודת שער היא שקועה בתוך אלקטרוליט (איור 1), וכאשר מתח שער חיובי מיושם בשער, קטיונים מאלקטרוליט נאלצים לתוך הערוץ, ובכך dedoping פולימר הניצוח וכתוצאה משינוי במקור הניקוז נוכחית. דevice לכן מאוד רגיש לשינויים של הרגע בשטף היוני בשל הגברה של טרנזיסטור. שכבת תאים גדלה על הוספת תרבית תאים הושמה בין האלקטרודה השער וערוץ הפולימרים המוליכים. הנוכחות של שכבת תאים שלמה משמשת כמחסום לקטיונים להיכנס לתוך פולימר הניצוח, ולכן, בנוכחות monolayer שלם, הירידות הנוכחיות הניקוז (איור 2: מעבר מהאזור לב). בנוכחות של תרכובת רעילה, רקמת מכשול בהדרגה לאבד את היושרה שלה, ומאפשרות קטיונים להיכנס לסרט הפולימרים והגדלת הנוכחי הניקוז (איור 2: אזור ג). בעזרת טכניקה זו, הפרה ברקמת מחסום נתפס על ידי האפנון של זרם הניקוז, המקביל למודולציה של השטף על פני השכבה. מכשיר זה מסוגל למדוד וריאציות דקות בשטף היוני עם רזולוציה חסרת תקדים של זמן ורגישות בזמן אמת. wil טכנולוגיה זוl להיות עניין בתחום של רעלים לבדיקות סמים, אבחון מחלה או מחקר בסיסי כמודל המחסום ניתן להתאים בקלות. שיטה זו גם תסייע להפחית את הניסויים בבעלי החיים, שכן היא מאפשרת האימות של במבחנה מודלים להחליף בבדיקות vivo.

1. PEDOT: PSS פתרון הכנה

1. 50 מיליליטר של PEDOT: PSS, להוסיף אתילן גליקול (מגביר מוליכות) ביחס נפח של 1:4 (אתילן גליקול לPEDOT: PSS), 0.5 μl / מיליליטר של חומצת Dodecylbenzenesulfonic (DBSA) כחומרים פעילי שטח, ו10 מ"ג / מיליליטר 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GOPS) כמקשר צולב כדי לקדם את ההידבקות של פולימר הניצוח לשקופית הזכוכית.

2. ייצור OECT (איור 3)

1. הגדרת אנשי קשר מקור ניקוז זהב התאדו תרמית באמצעות יתוגרפיה ההמראה:
   1. ספין photoresist מעיל בשקופית זכוכית נקייה רגילה ב3,000 סל"ד במשך 30 שניות. ממדי זכוכית הם 3 בx 1 פנימה
   2. להגדיר דפוסים ידי photolithography. ממדים עשויים להשתנות, עם זאת הממדים המפורטים כאן הוצגו להוביל לרגישות האופטימלית. לאחר מכן להשתמש במפתח.
   3. להתאדות ננומטר 5 ושל כרום וזהב 100 ננומטר, בהתאמה.
   4. המראת photoresist בacהאמבטיה אטון עבור שעה 1, ומשאירה את המצע עם שטח אנשי קשר Au רק המקור וניקוז.
2. האורך הרצוי של PEDOT: ערוץ PSS הוא 1 מ"מ. זו מושגת על ידי דפוסי שימוש בטכניקה לתלישה parylene-C (Pa-C):
   1. טען 3.5 גרם של Pa-C בהתקנת הציפוי. באופן אחיד להתאדות 2 מיקרומטר של parylene-C על גבי המצע עם אנשי קשר של Au.
   2. תבנית הערוץ על ידי photolithography:
      1. ספין photoresist המעיל ב3,000 סל"ד במשך 30 שניות.
      2. השתמש במסכה כדי להאיר ערוץ ומגע זהב 20 שניות לUV, photoresist נחשף יהפוך מסיס במפתחים.
      3. השתמש במפתח כדי לפתוח את אזור הערוץ בphotoresist.
   3. לחרוט Pa-C באזור הערוץ על ידי צעד 15 דקות פלזמה (O ₂ (50 SCCM) _ו4 פרנק שוויצרי (פלזמה 3 SCCM) ב160 W) כדי לפתוח את הערוץ ואת מגעי הזהב.
3. להפקיד את PEDOT: פתרון תערובת PSS על ידי ציפוי ספין ב500 סל"ד 45 שניות. אופים במשך 30 שניות ב110 ° C.
4. מתקלף Pa-C כדי לחשוף את PEDOT: ערוץ PSS של המצע שמתחת. ערוץ זה צריך מעט חפיפה עם אנשי קשר Au נעשה בפרוטוקול 1.
5. דגימות אופים במשך שעה 1 ב140 ° C בתנאים אטמוספריים.

3. עצרת מכשיר

1. הפוך PDMS על ידי ערבוב שני פתרונות (מסופקים בדרך כלל יחד בערכה) ב1:10 יחס של ריפוי פתרון בפתרון בסיס. לאפות שעה 1 120 מעלות
2. לעצב גם באמצעות ניקוב חורים ולחתוך ריבוע מסביב לאזור הרצוי.
3. דבק PDMS גם על גבי הערוץ, להביא לאזור ערוץ בסך של כ 6 מ"מ ^2. ודא כי מגעים המקור וניקוז אינם מכוסים.
4. הפוך תמיכת פלסטיק עם חור בזה (ניתן להשתמש בבעל ללהכניס את תרבות תאים) ולאחר מכן להדביק אותו על גבי PDMS. תן לזה הלילה יבש.
5. בדוק היטב שאין נזילה ידי prefilling עם ואטאה.
6. הלחמה חוטי חשמל על קשר מקור ניקוז עם פח.

4. תרבית תאים

1. הכן תקשורת תרבית תאים באופן הבא:
   1. בDMEM, להוסיף גלוטמין 1%, 10% שור סרום עוברי, 0.5% פניצילין, סטרפטומיצין, ו0.1% גנטמיצין.
   2. לעקר את תרבות התקשורת הסלולרי באמצעות מכשיר סינון סטרילי.
2. לשמור על קאקו-2 תאים בין המעבר 49 ו68 על 37 מעלות צלזיוס באווירת humidified של 5% CO _2, בתקשורת ובתרבות תא.
3. לחלק תאים פעם בשבוע באמצעות טריפסין וזרע ב1.5 x 10 ⁴ תאים / להוסיף.
4. שינוי בתקשורת תרבות תא פעמיים בשבוע במשך 3 שבועות.

5. מדידות עם OECT

1. חבר חוט Ag / AgCl לSourceMeter לשימוש כאלקטרודת השער. לטבול את הקצה בתקשורת תרבית תאים, המשמשת כאלקטרוליט, כפי שמודגם באיור 1 א.
2. חבר חוטים ממקור וניקוז כדי לאהוא SourceMeter (הגדרת ערוץ כפולה).
3. החל מתח דופק ריבועים חיובי (V _GS) בין השער והמקור (ששמש כאלקטרודה השוואתית: קרקע). מתח קבוע שלילי בין הניקוז והמקור (V _DS) מוחל ונוכחי המתאימים (אני _DS) נמדד.
4. השתמש באיסוף נתוני תכנית הריצה מחשב. פרמטרים OECT נכנסו בתכנית רכישה מותאמת אישית צריכים להיות כדלקמן: V _DS = -0.2 V, V _GS = 0.3 V, על זמן = 2 שניות V _GS, את הזמן = 28 שניות.
5. קראו את זרם מקור ניקוז (אני _DS) ושער הנוכחי (אני _GS). לבצע את המדידה במשך כמה דקות על מנת להבטיח אות בסיס יציבה.

6. שילוב תאים עם OECT למדידה

הערה: לפני הניסוי, על שלמותה של שכבת התאים עשויה להיות מאומתת על ידי מדידת TER עם מכשיר ספקטרוסקופיה עכבה. TER של כל inse תא 3 שבועות הישנים קאקו-2rt צריך להיות מעל 400 ^{Ω. 2} סנטימטר.

1. במהלך פסק הזמן של מדידת OECT: הסר את אלקטרודת השער מאלקטרוליט, לשלב להכניס את תרבות תאים, ולהחליף את אלקטרודת השער בפנים להכניס את תרבות תאים.
2. לבצע את מדידת קו בסיס עם התאים במשך כמה דקות על מנת להבטיח אות יציבה. בסיס זה ישמש כלחישוב הערך המנורמל המתאים לmonolayer שלם (0).

7. הכנה והקדמה של תרכובת רעילה

1. הכן פתרון 1 M של EGTA במי DI, כדי להתאים את ה-pH של הפתרון ל7.4 עם בסיס טריס הראשון.
2. הוספת פתרון EGTA בנפח המתאים כדי להשיג את הריכוז הרצוי (למשל בין 5 מ"מ ו100 מ"מ) תוך לקיחה בחשבון את עוצמת הקול. EGTA יש להוסיף בתא הבסיסי במהלך פסק הזמן.
3. למדוד באופן רציף ל90 דקות כמו בפרוטוקול 5. אם המדידה היא being מתבצע בטמפרטורת חדר, את היציבות של התאים לא תישאר קבועה לאחר 90 דקות.
4. בסופו של הדבר, לגרד את שכבת התאים לגרום להרס של שכבת המחסום ומידה כנגד 15 דקות שלמים, בשלב זה יכול להיעשות על ידי הסרת המסנן ולטבול את אלקטרודת השער בתקשורת. בסיס זה ישמש כלחישוב הערך המנורמל המתאים לmonolayer נהרס.

במהלך השלב הראשון של מדידה, הניקוז הנוכחי עשויים להשתנות במידה מסוימת, אבל ברוב המקרים זה צריך להישאר יציב (איור 2, חתך). אם האות אינו יציב, הטרנזיסטור אמור להיות מושלך והוחלף. בדיקת יציבות זו גם מבטיחה כי כל הפסדים ראשוניים במוליכות של המכשיר אינם משפיעים על המדידה שלאחר מכן. לאחר כמה דקות של מדידה, להכניס את עם תאי יוצרי רקמת המכשול מונח על גבי הערוץ. הנוכחי הניקוז צריך להקטין באופן מיידי (איור 2, סעיף ב '.). אם זרם הניקוז אינו פוחת, זה יכול להצביע על כך שהתאים לא תקין יצרו מכשול, או ניזוקו במהלך מניפולציה, והמסנן צריך להיות מושלך והוחלף. על ידי הוספת תרכובת רעילה לרקמות המכשול, האפנון של זרם הניקוז צריך להגדיל בהדרגה או באופן מיידי, בהתאם למתחם המשמש והריכוז (איור 2,סעיף ג.).

הנתונים נאספו באמצעות SourceMeter ותכנית רכישה מותאמת אישית. מתכנית זו פרמטרים שונים התקבלו, המנוהלים בתכנית ניתוח נתונים כדי להשיג את אמצע האפנון-מתאים לכל אחד דופק שער. אמצע האפנון תואם את הערך של הזרם באמצע השיא (איור 4). ערכי אמצע האפנון שהושגו במהלך החישה של monolayer שלם היו מנורמלים ל0 תוך אמצע האפנון מתקבל לאחר השריטה היה מנורמל 1. תוצאות מנורמלות משמשות כדי להשוות נתונים מהתקנים שונים (איור 5). מהנתונים אלה בתגובת המנה של ריכוזי הבדל של תרכובת רעילה לאורך זמן ניתן לראות.

איור 1. סכמטי של אורגני אלקטרוכימי טרנזיסטור משולב עם הוספת תרבית תאים) ממבט מצד. ב) להציג לראש הערוץ (אפור) וקשר (ממדים צהובים) בשקופית זכוכית באורך ערוץ של 6 מ"מ ורוחב ערוץ של 1 מ"מ . נתון זה שונה מ30 Jimison.

.. איור 2 סקירה כללית של מדידה באתרו של תגובה הנוכחית ניקוז לפולסים שער מרובעים לאורך זמן בתנאי מדידה הם: V DS = -0.2 V, V GS = 0.3 V, V GS על זמן = 2 שניות, פסק הזמן = 28 שניות.) מתאים OECT שהופעלו קודם לאינטגרציה עם תאים, כדי להבטיח את היציבות של המכשיר. ב) המתאים integמנה של רקמת המחסום יוצרת תאים, הבטחת אות יציבה שוב לפני תחילת בדיקה של תרכובת רעילה. ג) מקבילה לתוספת של EGTA לתאי רקמת מחסום, שים לב להתפתחות של האות לאורך זמן.

איור 3. תהליכי ייצור של OECT. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 4. OECT לנקז תגובה נוכחית לדופק שער ריבוע אחד. מדוד תנאי ment הם כדלקמן: V DS = -0.2 V, V GS = 0.3 V, V GS על זמן = 2 שניות, פסק הזמן = תאי 28 שניות.) תגובת מעבר OECT לפני (קו מקווקו) ואחרי (קו כחול) התוספת של רקמת מחסום יוצרים גדל על מסנן. ב) תגובת מעבר OECT לאחר התוספת של תרכובת רעילה ברקמות מכשול (קו כתום) וללא רקמות מכשול (קו מקווקו).

איור 5. תוצאה מנורמלת טיפוסית מOECT. התגובה המנורמלת של OECT על מבוא של מכשיר (עיגול ריק), שכבת תאים (צלב שחור), 5 מ"מ EGTA (העיגול הכחול כהה) ו10 מ"מ EGTA (עיגול ציאן) הציגה ב t = 0, נמדדו על פני תקופה של 50 דקות.om/files/ftp_upload/51102/51102fig5highres.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

פרויקט זה נתמך על ידי FP7-People-2009-RG, מארי קירי פרויקט מס 256,367 (CELLTOX) וההצעה האירופית המועצה למחקר ERC-2010-STG לא 258,966 (IONOSENSE), כמו גם מענק משותף מConseil האזורי דה פרובאנס אלפ קוט ד 'אזור וCDL פארמה לST. אנו מודים לג'ורג' Malliaras לדיונים שימושיים הנוגעים לעיצוב OECT ותפקוד.