הקמנו מודל גליובלסטומה orthotopic קליפת המוח בעכברים לשני הפוטונים במיקרוסקופ intravital שמשחזר אילוצי biophysical בדרך כלל במשחק במהלך הצמיחה של הגידול. חלון זכוכית כרוני החלפת הגולגולת מעל לגידול מאפשר המעקב של התקדמות הגידול לאורך זמן על ידי שני פוטונים במיקרוסקופ.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Glioblastoma עכבר דגם orthotopic שמירה על אילוצי המוח של רקמת ריאה, פיסיים ומתאים לשני פוטונים במיקרוסקופ Intravital
במאמר זה
סיכום
תקציר
multiforme glioblastoma (GBM) הוא הצורה האגרסיבית ביותר של גידולים במוח ללא טיפולים מרפאים זמינים עד כה.
מודלים Murine של פתולוגיה זו מסתמכים על הזריקה של השעיה של תאי גליומה לתוך המוח parenchyma הבא חתך של הדורה-מאטר. ואילו התאים צריכים להיות מוזרקים באופן שטחי להיות נגיש לשני הפוטונים במיקרוסקופ intravital, זריקות שטחיות לא מצליחות לשחזר את תנאי physiopathological. ואכן, שנמלט דרך מערכת ההזרקה רוב התאים הסרטניים מגיעים לשטח הנוסף, שבו הם dural להרחיב מהירים באופן חריג בהעדר אילוצים מכאניים מparenchyma.
השיפורים שלנו מורכבים לא רק בfocally השתלה אליפטית גליומה במקום הזרקת השעיה של תאי גליומה בשכבות השטחיות של קליפת המוח, אלא גם בסתימת אתר ההזרקה על ידי חמי חרוז ג'ל dextran צולבים כי הוא דבוק לsurrounparenchyma דינג ואטום לדורה מאטר-עם cyanoacrylate. בסך הכל אמצעים אלה לאכוף את הרחבה וחדירה הפיזיולוגיות של התאים הסרטניים בתוך parenchyma המוח. Craniotomy סופו של דבר סגרה עם חלון זכוכית ביצרו לגולגולת כדי לאפשר הדמיה כרונית במשך שבועות בהעדר התפתחות רקמת צלקת.
ניצול של בעלי חיים מהונדסים ניאון מורכב עם תאים סרטניים ניאון שהראינו שהדינמיקה של אינטראקציות המתרחשות בין תאי גליומה, תאי עצב (למשל עכברי Thy1-CFP) וכלי דם (מודגש על ידי הזרקה תוך ורידית של צבע פלואורסצנטי) ניתן דמיינו ידי intravital שני פוטונים במיקרוסקופ במהלך ההתקדמות של המחלה.
האפשרות לתמונה ברזולוציה גידול מיקרוסקופית בסביבת מוחין בסכנה מינימאלית מהווה שיפור של מודלים של בעלי החיים GBM הנוכחיים שאמור להועיל לתחום נוירו אונקולוגיה ובדיקות סמים.
מבוא
multiforme glioblastoma מופיע כצורה האגרסיבית ביותר של גידול במוח במבוגרים עם חציון הישרדות של 12 חודשים ושיעור הישרדות לאחר 5 שנים של 5%. ניהול קליני מסתמך על ניתוח, הקרנות וכימותרפיה משמשת לעתים קרובות בשילוב. עם זאת, ההשפעות של טיפולים אלה יישארו פליאטיבי 1-3.
עד כה, רוב מחקרי נוירו אונקולוגיה מסתמכים על טכניקות כי הם רק מסוגלים לספק תצוגה סטטית ובוצעו על קבוצות גדולות של בעלי חיים הנושאים גידול הקריבו בזמן נקודות שונות (ראה, למשל, 4,5). הפיתוח האחרון של שיטות מעקב המבוססים על ההדמיה intravital מאפשר לימוד צמיחת גליומה ויחסי הגומלין בין תאים סרטניים והמיקרו pathophysiological על אותו בעלי החיים לאורך זמן. זו פותחת את הדרך ליצירה בלעדית של מידע שהייתה בלתי ניתן להשגה עד כה 6. בעלי חיים מהונדסים מבטא תגי ניאון בתאים של עניין עשויים להיות שימושד ללמוד אינטראקציות ספציפיות בין תאים סרטניים ותאי עצב לדוגמא במאמר זה.
במהלך העשור האחרון, שני הפוטונים במיקרוסקופ intravital 7 הפך לסטנדרטי במחקרי נוירו אונקולוגיה בסיסיים וניסויים פרה 8,9 ביכולתה לבצע תצפית intravital עמוקה של מוח עכבר זהב (> 500 מיקרומטר מתחת הדורה מאטר-) עם רזולוציה מרחבית micrometric 10. באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים intravital עם מודלים של בעלי החיים orthotopical המושתלים עם חלון גולגולתי כרוני 11, ניתן לעקוב אחר התקדמות גידול לאורך זמן באותו 9,12 עכבר.
אחד החסרונות העיקריים של מודלים של בעלי החיים שפורסמו בעבר אלה הוא, עם זאת, הם לא מחקים את המגבלות פיזיות הקובעים את צמיחת גידול כדורה מאטר, אינו אטום לאחר ההזרקה של ההשעיה תא 9,13,14. תאי גליומה עלולים לדלוף בחלל extradural הפיכת מודל גליומה orthotopic לאחד heterotopic.
מודל החיה המוצג כאן מורכב בהזרקה של אליפטית של תאי גליומה ניאון בקליפת המוח בעומק של 200 מיקרומטר ואחרי האיטום של הדורה מאטר, עם ג'ל, חמי חרוז dextran צולבים ודבק histo התואם . צמיחת הגידול מכן הוגבלה לparenchyma המוח ששומר על מגבלות פיזיות pathophysiological. חלון זכוכית כרונית המושתל מעל לגידול מאפשר גישה אופטית קלה עבור שני הפוטונים במיקרוסקופ intravital. שימוש בבעלי חיים מהונדסים מבטא תגי ניאון בתאים של עניין זה ניתן לבצע מעקב של צמיחת גליומה לאורך זמן וללמוד את האינטראקציה שלה עם microenvironment (כאן עם נוירונים וכלי דם מודגשים עם dextrans ניאון).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הליכי הניסוי בוצעו בהתאם לחוק הצרפתי ובהתאם להוראת מועצת הקהילה האירופית של 24 נובמבר 1986 (86/609/EEC) לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה. המחקר על בעלי חיים אושר על ידי הכיוון Départementale des שירותי Vétérinaires des בוש דו רון (רישיון D-13-055-21) ואושר על ידי הוועדה האתית של פרובנס קוט ד 'אזור n 14 ° (פרויקט 87-04,122,012) .
1. Spheroids הכנה
- הכנת צלחות פטרי מצופה agarose
- מערבבים 1 גרם של agarose עם של מדיום תרבות תא 100 מיליליטר לא בתוספת סרום שור העובר. להשתמש בתנור מיקרוגל (850 וטס ל40 שניות, 3 x 15 שניות לאחר מכן; מערבב את הפתרון בכל מפגש בין מיקרוגל) לרתיחת הפתרון ולפרק את agarose לחלוטין. החיטוי פתרון agarose 1% זה עבור 20 דקות ב120 ° C כדי להבטיח steri. Lity הערה: תשמור על עצמך כדי לפזר את agarose לחלוטין לפני פרוטוקול החיטוי. Inhomogeneity עלול לסכן את היווצרות הספרואידים.
- , לקח פעם אחת מהחיטוי לשפוך 10 מיליליטר של פתרון agarose 1% ב100 x 20 מ"מ צלחות פטרי. השאר 20 דקות פטרי צלחות בטמפרטורת חדר כדי לאפשר את פתרון agarose 1% כדי לחזק.
- הוסף 10 מיליליטר של PBS מעל agarose כדי לשמור על לחות. לאטום את המכסה של צלחות פטרי מצופה agarose ידי עטיפתם עם parafilm כדי למנוע אידוי. צלחות פטרי ניתן לאחסן לתקופה של עד 2 חודשים על 4 מעלות צלזיוס אם humidified כראוי על ידי שכבת PBS.
- תרבות אליפטית
- ב75 סנטימטר 2 בקבוק, תרבות תאי גליומה במדיום המומלץ שלהם כשכבה.
- החלף את PBS מאחד 1% צלחת פטרי מצופה agarose ידי 1.5 מיליליטר של "מדיום preconditioned" שנאסף מהבקבוק המכיל monolayer 2D של תאי גליומהs.
- הוצא את המדיה מהבקבוק המכיל monolayer 2D של תאי גליומה.
- לשטוף בעדינות את monolayer עם 10 מיליליטר של PBS.
- הוסף 2 מיליליטר של 0.05% מפתרון טריפסין / EDTA ו לדגור דקות בקבוק 4 ב 37 ° C. הערה: זמן הדגירה יכול להשתנות בהתאם לשורת התא בשימוש.
- הוסף 8 מיליליטר של מדיום התרבות להפסיק את הפעולה של טריפסין, בעדינות לשטוף את ההשעיה תא הערה:. יש להיזהר שלא לשטוף את האוויר בהשעית התא כפי שהוא מגביר את המוות של תאים.
- שים 6 מיליליטר של ההשעיה התא בבקבוקון סטרילי.
- צנטריפוגה 4 דקות הבקבוקון ב800 סל"ד.
- הסר את supernatant ועדינות להשעות את משקע התאים ב 3 מיליליטר של מדיום התרבות.
- זרעי ההשעיה התא בצלחת פטרי מצופה agarose מוכן.
- שים את צלחת פטרי על 37 מעלות צלזיוס באווירת 5% CO 2 למשך 2 עד 3 ימים עד הספרואידים של קוטר רצוי נוצרים.
2. השרשה אליפטית וחלון
- הכנה של מערכת ההזרקה
- נימי זכוכית נקייה (1 מ"מ קוטר) על ידי sonicating ב70% אתנול ל10 דקות. יש לשטוף פעמיים עם הצבת לפני מים בתוך חממה עד יבש.
- משוך כמה נימי זכוכית ניקו עם חולץ פיפטה על מנת להכין את המניות קטנות.
- לשבור את הקצה של הנימים משכו על ידי גירוד בגפיים על פיסת נייר הטישו כדי להשיג גפיים משופעים בגודל הרצוי: בדרך כלל בקוטר חיצוני של 300-350 מיקרומטר וקוטר פנימי של 250-300 מיקרומטר. במהלך תהליך עיצוב זה, לשלוט בקוטר של הנימים באמצעות macroscope עיני שהוא מצויד במירה סיימתי את הלימודים.
- חבר את הגפיים שאינם משופעים בנימים לסעפת 3 דרך באמצעות חתיכת צינור פלסטיק שקוטר פנימי מתאימה לקוטר החיצוני של הנימים.
- שימוש בטובין הפלסטיקגרם, לחבר את שתי דרכים אחרות של הסעפת ל 25 μl מזרק microliter ולמזרק 1 מיליליטר עמוס בשמן מינרלי histo התואם.
- כוון את בורר הסעפת להקים מסלול בין מזרק microliter ומזרק 1ml. להסיר הבוכנה של מזרק microliter ולהזריק שמן מינרלים אחורה לתוך מזרק microliter עד שהוא דולף החוצה על ידי לחיצה על הבוכנה של מזרק 1ml. החזר את הבוכנה של מזרק microliter תוך הקפדה לא להשאיר בועות אוויר בצינור.
- כוון את בורר הסעפת להקים מסלול בין הנימים ומזרק 1 מיליליטר. מלא את הנימים עם שמן מינרלים עד שהוא ידלוף החוצה מהקצה תוך הקפדה לא להשאיר בועות אוויר בצינור.
- כוון את בורר הסעפת כדי ליצור חיבור בין מזרק microliter והנימים. לגרש כ -10 μl של שמן מינרלים.
- טובלים את קצה הנימים לתוך פתרון PBSובאמצעות המד של מזרק microliter, למצוץ ב5μl של PBS בנימים. שים לב שהמניסקוס בין שמן וPBS נראה בבירור.
- תקן את הנימים על micromanipulator 3 ציר המתאים תחת macroscope הניתוח. מערכת זו תשמש למקד נימים על הזריקה תחת שליטה חזותית.
- השתלה אליפטית
- קל להרדים את העכבר על ידי שאיפה של Isoflurane בחדר אינדוקציה (1.5% באוויר במהלך 1-1.5 דקות).
- להרדים את החיה עם זריקה תוך הצפק מתערובת של קטמין / Xylazine (120 מ"ג / קילוגרם, מ"ג 12 / קילוגרם). שים לב שהרדמה לעתים קרובות מפחיתה את טמפרטורת הגוף של בעלי החיים. מומלץ להמשיך בניתוח בחדר ב26 מעלות צלזיוס ולשמור על החום בבעלי החיים עם כרית חימום thermocontrolled בסיסית.
- החל משחה העין כדי למנוע התייבשות של העיניים.
- לגלח את הקרקפת של החיה.
- מקוםבעלי החיים במסגרת stereotactic באמצעות מוטות אוזן ושופר.
- נקה את העור עם יוד povidone (סבון של 3%, ואז פתרון 10%).
- לעשות חתך ארוך 1 סנטימטר אורכים באמצע הקרקפת עם אזמל. בעזרת מספריים לחתוך ולהסיר את העור מעל העצמות הקודקודית.
- עם להב סכין מנתחים בעדינות להסיר את קרום העצם מעל לגולגולת. בנדיבות להחיל cyanoacrylate על גבי העצם כדי ליצור משטח מחוספס לדבקות מלט מאוחר יותר.
- לקדוח את העצם הקודקודית תחת macroscope כירורגית כדי ליצור פתיחת גולגולת של 4 מ"מ קוטר. בנדיבות להוסיף קר כקרח PBS המכיל הפניצילין (1,000 U / ml) וStreptomicin (1 מ"ג / מיליליטר) במהלך ההליך כולו כדי למנוע חימום. הסר את שברי עצמות הקטנים עם מלקחיים וגזה סטרילית רטובה. תשמור על עצמך לקדוח לפחות 1 מ"מ מתפרי גולגולת הקודקודית, כדי למנוע דימומים.
- דק העצם בגבול של פתיחת הגולגולת שבו חלון הזכוכית יהיה אטומה. המטרה היא דוארNsure מאוחר מיצוב מישוריים של חלון הזכוכית עם שטח מגע מרבי בין המוח והזכוכית. לאט לאט להסיר את עצם שימוש במלקחיים ולנקות את הדורה מאטר, החשוף עם פתרון PBS.
- קח coverslip זכוכית עגול בקוטר 5 מ"מ, לנקות אותו עם אלכוהול ולייבש אותו בנייר טישו. נסה להשתמש coverslip כמכסה לפתיחת הגולגולת ולוודא כי משטח שטוח גדול של המוח מקבל במגע עם הזכוכית. אם יש צורך להסיר את coverslip כדי לדלל עוד יותר את העצמות בצד. המשך עד שהמוח יכול להידחס שטוח אם בעדינות הפעלה לחץ על coverslip פעם אחת במקום.
- לנקות שוב את coverslip עם אלכוהול, לייבש אותו בנייר טישו, ולשמור אותו לגזרים.
- עם מחט מד 26 לעשות חור בדורה מאטר, במרכזה של פתיחת הגולגולת עדיין הימנעות כלי דם ראשיים. הקפד שלא לפגוע במוח parenchyma כמטרת שלב זה הוא רק כדי לפתוח את הדורה-מאטר.
- נקה בעדינויות את wi-הדורה מאטרה פתרון PBS להסיר דם מדמם. כסה עם חתיכת נייר הטישו בעת ההכנה להזרקת אליפטית.
- עם מערכת ההזרקה אליפטית מוכנה בשלב 2.1, למצוץ אליפטית עגול הולם את קוטר הנימים הפנימי (כ 200-250 מיקרומטר) מצלחת פטרי מוכנה בשלב 1.2. אליפטית צריכים לבוא יחד עם בערך 5 מדיום התרבות μl. זה צריך לנפול לקצה נימיות תחת כובד משקלה.
- הסר את נייר הטישו הרטוב המשמש לכיסוי פתיחת הגולגולת ולמקם את החיה מתחת למערכת ההזרקה.
- מנמיכים את פיפטה ההזרקה עד שהוא נוגע החור שנעשה בדורת מאטר-. לאחר מכן, הורד אותה שוב על ידי 250 מיקרומטר. חכה 30 שניות.
- לאט לאט להזריק אליפטית באמצעות הבוכנה של מזרק microliter (2-3 μl) תוך שאיבה החוצה הנוזל העודף עם חתיכת נייר הטישו דקה. חכה 30 שניות ולאחר מכן בעדינות להרים את פיפטה ההזרקה ידי 50 מיקרומטר לכיוון פני השטח. חכה שוב 30 שניות וrepeat הליך ההרמה על ידי צעדים של 50 מיקרומטר עד פני השטח. זמני המתנה נמנעה ממיצוי של אליפטית שהייתי מקל לפיפטה.
- לאשר את קיומו של אליפטית במוח באמצעות macroscope הקרינה.
- מערבבים 100-300 מיקרומטר קוטר חרוזים ג'ל dextran צולבים עם פתרון PBS בצלחת פטרי. חכה 1min ולדוג כמה חרוזים התייבשות. מניחים אותם על העצם הסמוך לפתיחת הגולגולת.
- תחת שליטת מאקרוסקופי, לבחור חרוז אחד בקוטר דומה לגודל של פתיחת הדורה-מאטר. חותכים את חרוז ג'ל dextran צולבים בשני חצאים באמצעות מלקחיים.
- בעדינות לשים את חמי חרוז ג'ל dextran צולבים לתוך חור ההזרקה עם הפנים קמורים כלפי אליפטית. יש להיזהר שלא להסיר את אליפטית ולחץ בעדינות כלפי מטה עד הגבול של קעור לקבל במגע עם הדורה מאטר-שמסביב.
- לשים טיפה של דבק cyanoacrylate בשקופית זכוכית; טובל את הקצה של קיסם לdrop לקחת כמות קטנה של דבק. מהירות לאטום את הקצוות של חמי חרוז ג'ל dextran צולבים לדורת מאטר, הסמוך על ידי רקיעת דבק מסביב. תשמור על עצמך לבצע תנועות מהירות ומדויקות על מנת להימנע מהדבקת dextran ג'ל, חמי חרוז צולבים לקיסם. הימנע מעודף של דבק שיכול להתפשט ולעכב אם לא למנוע הדמיה פעם אחת יבש. חכה 2 דקות לדבק להתייבש ולאחר מכן לנקות את פתיחת הגולגולת ועצמות המקיפות עם פתרון PBS.
- השתלת חלון
- שים בקוטר 5 מ"מ עגול coverslip מעל craniotomy (ראה 2.2.12). הקצוות של coverslip חייבים להיות על הגולגולת דליל בחלקו החיצוני של פתיחת הגולגולת. Coverslip חייב להיות במגע עם הדורה מאטר, והעצם דליל בקצוות. זה מאוד חשוב שיהיה מגע ישיר בין הדורה מאטר, וcoverslip הזכוכית אחרת רקמת צלקת עלולה להתפתח ולעכב בהירות אופטית.
- עם רקמה, לספוג את PBS על הקצות coverslip הדואר כך פתרון שאינו מכסים באופן מלא את פתיחת הגולגולת בעת החלת לחץ קטן במרכז של coverslip. זה יבטיח כי עצם, זכוכית והמוח דבוק יחד בצד של האזור של עניין.
- לשמור על לחץ קטן במרכז coverslip עם מלקחיים תוך יישום העדינות cyanoacrylate בגבול בין העצם וcoverslip. הדבק באופן ספונטני יתפשט עד לממשק עם פתרון PBS. פתרון יפעל כמחסום ניתנה הידרופוביות של הדבק. איטום צריכה להיות יעיל בפחות מדקה, אבל לקחת בזהירות רבה שלא להזיז את coverslip עד שהוא קבוע. זה אחרת היה לגרום לדליפת cyanoacrylate בדורת מאטר, ומכאן להוביל לכישלון של הניתוח.
- במקרה דבק היה להתפשט על גבי הזכוכית, להסיר אותו באמצעות סכין מיקרו אזמל ידי ביצוע תנועות ספירלה כפי שהוא עשוי אחרת להפחית את הבהירות אופטית. תיזהר לא לשבור את coverslip הזכוכית דוריןg ההליך בשל לחץ מוגזם.
- איחוד קיבעון הזכוכית על ידי יישום מלט שיניים בקצוות של coverslip לכיוון הגולגולת הסמוכה. הקפד לכסות את הגולגולת חשופה כולו עד לקרקפת. שימוש בבטון נוסף, לבנות את הקירות צדדיים סביב coverslip כדי ליצור את הבריכה הנדרשת לטבילה של המטרה. מלט השיניים ירפא בפחות מ 10 דקות.
3. טיפול והכנה להדמיה לאחר ניתוח
- טיפול שלאחר ניתוח
- הסר את העכבר מהמסגרת stereotactic, להזריק Dexamethazon (0.2 מ"ג / קילוגרם) וRimadyl sc (5 מ"ג / קילוגרם) על פני אזורי האגן והשכיב אותה בכלוב עם רקמת קן חם.
- לפקח על בעלי החיים עד להשפעות של הרדמה נעלמו. באופן כללי 2 עד 3 שעות לאחר ניתוח, עכברים הם ניידים באופן מלא. ודא שיש לו בעלי החיים גישה קלה למזון ומים. לספק את החיה עם גלוקוז agarose המכיל (agarose3%, 3% גלוקוז).
- לפקח על המשקל של בעלי החיים בכל יום ולהזריק Dexamethazon (0.2 מ"ג / קילוגרם) וRimadyl sc (5 מ"ג / קילוגרם) ל10d הראשון שלאחר ניתוח. לשיקולים אתיים, להרדים את העכברים כאשר ההפסד עולה על 15% מהמשקל המקורי שלה. לחץ תוך גולגולתי עולה עם גודל גידול שמוביל לליקויים מוטוריים לבעלי החיים. זוהי שורת תאים הסרטני תלויה ומתרחשת בעיכובים שונים שלאחר ניתוח. יש לנקוט זהירות מיוחדת כדי לאפיין את נקודת הסיום של הניסוי עם הקו הסלולרי בשימוש.
- הכנה להדמיה
- קל להרדים את העכבר על ידי שאיפה של Isoflurane בחדר אינדוקציה (1.5% באוויר במשך 1-1.5 דקות).
- להרדים את החיה עם זריקה תוך הצפק מתערובת של קטמין / Xylazine (100 מ"ג / קילוגרם, 10 מ"ג / קילוגרם). כגון הרדמה בדרך כלל מאפשרת 45 דקות של התבוננות. כדי לבצע פגישות הדמיה ארוכות יותר, עכבר ממוקם מתחת לאיפה מתמדת של Isoflurane באוויר (0.25-0.75%).
- החל משחה העין כדי למנוע התייבשות של העיניים.
- שים את החיה על מסגרת stereotactic ולחסום את הגולגולת עם earbars.
- כדי להמחיש את כלי הדם, צבע פלואורסצנטי ניתן להזריק לווריד.
- אם החלון מופיע מלוכלך, ניתן לנקות אותו בעדינות על ידי הסרת הפסולת עם להב דק והפינה של רקמות. אין להשתמש באלכוהול כדי לנקות את החלון כפי שהוא לא תמיד בקנה אחד עם מלט שיניים וזה יכול לקרר את המוח מתחת לחלון.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ברגע שהפרוטוקול הניתוחי מבוצע (איור 1), ניתן לראות בעלי חיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מעל שבועות עד הקרבה. תגובה דלקתית יכולה להיות שנצפתה לאחר הניתוח, הנעלם בתוך שבוע או שבועות. גידול יכול להיות שנצפה על ידי שיטות מיקרוסקופיה שונות, כולל macroscopy ניאון ושני פוטונים במיקרוסקופ (איור 2). תמונות דוגמא המתוארות כאן מומשו על macroscope הקרינה ומיקרוסקופ שני פוטונים מצמידים את לייזר femtosecond פעם אינפרא אדום מתכונן ובית שונה כדי לאפשר מיקום של...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
גישה זו מאפשרת השימוש בשיטות הדמיה אופטיות כדי לפקח על ימים ושבועות הצמיחה של גליומה המושתלת orthotopically. בעלי החיים זהים בהמשך יכולים להיות נתונה לכמעט כל שיטת הדמיה מוחית במהלך הפתולוגיה; עדיין ההכנה הספציפית במיקרוסקופ שני פוטונים מציעה הזדמנות הייחודית להשיג רזולוציה subcellular בתוך המוח של בעלי החיים חיים. הפרוטוקול שלנו מציג את היתרון לאכוף את צמיחת הגידול לparenchyma המוח ולא במיוחד durally כפי שזה קורה אם תאי גליומה יכולים לעזוב את מערכת העצבים המרכזית דרך הדורה הפגומה...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
המחברים בחום מודים לד"ר KK Fenrich, ד"ר MC. Amoureux, פ וובר וא 'Jaouen לדיונים מועילים; מ 'Hocine, ג Meunier, מ' Metwaly, ס 'Bensemmane, J. Bonnardel, צוות של מתקן בעלי החיים בIBDML וצוות של פלטפורמת ההדמיה PicSIL בIBDML לקבלת תמיכה טכנית. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי du הסרטן (האינקה-DGOS-INSERM6038) לGR, סוכנות הידיעות Nationale de la משוכלל ונדיר (ANR JCJC PathoVisu3Dyn), הפדרציה לשפוך la משוכלל ונדיר sur le Cerveau (FRC) לFD, על ידי מלגות מהפדרציה דה לה משוכלל ונדיר Médicale וCancéropole PACA לCR.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מקדחה | דרמל (גרמניה) | 398 | כל מקדחת עצם כירורגית באיכות גבוהה תספיק |
| מקדחה בור (#1/4 קרביד עגול בר) | World Precision Instruments (ארה"ב) | 501860 (#1/4) | נמכר גם על ידי Harvard Apparatus |
| Tissue Scissors | World Precision Instruments (ארה"ב) | 14395 | |
| פינצטה של Dumont M5S | World Precision Instruments (ארה"ב)501764 | ||
| צמנט דנטלי | GACD (ארה"ב) | 12-565 & 12-568 | |
| Cyanoacrylate | Eleco-EFD (צרפת) | Cyanolit 201 | |
| נימי זכוכית ללא נימה | Clark Electromedical Instruments (בריטניה) | GC100-15 | |
| מזרק מיקרוליטר (25 ומיקרו; l) | המילטון (ארה"ב) | 702 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments (ארה"ב) | נגזרת Kite-R | |
| T (פקק תלת-כיווני - Luer lock) | World Precision Instruments (ארה"ב) | 14035-10 | |
| מסגרת סטריאוטקטית (מתאם עכבר) | World Precision Instruments (ארה"ב) | 502063 | |
| כיסויי זכוכית | Warner Instruments (ארה"ב) | CS-5R (64-0700) | |
| ג'ל דקסטרן צולב (Sephadex) G50 גס 100-300 ומיקרו; m חרוזים | זמינים מספקים שונים כולל סיגמא (גרמניה) | ||
| משחת עיניים | TVM (צרפת) | ג'ל | |
| מקרוסקופ פלואורסצנטי | Leica MZFLIII (גרמניה) | נמכר גם על ידי חברות אחרות | |
| מיקרוסקופ דו-פוטוני | Zeiss LSM 7MP (גרמניה) | נמכר גם על ידי חברות אחרות (Nikon, …) | |
| לייזר פמטו-שנייה מתכוונן אינפרא אדום (Maï-Taï) | ספקטרה פיזיקה (ארה"ב) | נמכר גם על ידי חברות אחרות |
מקורות
- DeAngelis, L. M. Brain tumors. N Engl J Med. 344, 114-123 (2001).
- Ricard, D., et al. Primary brain tumours in adults. Lancet. 379, 1984-1996 (2012).
- Prados, M. D., et al. Phase III randomized study of radiotherapy plus procarbazine, lomustine, and vincristine with or without BUdR for treatment of anaplastic astrocytoma: final report of RTOG 9404. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 58, 1147-1152 (2004).
- Piao, Y., et al. Glioblastoma resistance to anti-VEGF therapy is associated with myeloid cell infiltration, stem cell accumulation, and a mesenchymal phenotype. Neuro Oncol. 14, 1379-1392 (2012).
- Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59, 472-485 (2011).
- Studwell, A. J., Kotton, D. N. A shift from cell cultures to creatures: in vivo imaging of small animals in experimental regenerative medicine. Mol Ther. 19, 1933-1941 (2011).
- Ustione, A., Piston, D. W. A simple introduction to multiphoton microscopy. J Microsc. 243, 221-226 (2011).
- Ricard, C., et al. Short-term effects of synchrotron irradiation on vasculature and tissue in healthy mouse brain. J Synchrotron Radiat. 16, 477-483 (2009).
- von Baumgarten, L., et al. Bevacizumab has differential and dose-dependent effects on glioma blood vessels and tumor cells. Clin Cancer Res. 17, 6192-6205 (2011).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2, 932-940 (2005).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. , 680(2008).
- Lathia, J. D., et al. Direct in vivo evidence for tumor propagation by glioblastoma cancer stem cells. PLoS One. 6, (2011).
- Madden, K. S., Zettel, M. L., Majewska, A. K., Brown, E. B. Brain tumor imaging: live imaging of glioma by two-photon microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
- Winkler, F., et al. Imaging glioma cell invasion in vivo reveals mechanisms of dissemination and peritumoral angiogenesis. Glia. 57, 1306-1315 (2009).
- Van Meir, E. G. Ch. 12. CNS Cancer, Cancer Drug Discovery and Development. , Humana Press. 227-241 (2009).
- Ulrich, T. A., de Juan Pardo, E. M., Kumar, S. The mechanical rigidity of the extracellular matrix regulates the structure, motility, and proliferation of glioma cells. Cancer Res. 69, 4167-4174 (2009).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
