ביטוי של חלבונים רקומביננטי hemagglutinin וNeuraminidase פונקציונליים מוירוס רומן H7N9 שפעת שימוש במערכת ביטוי baculovirus

סיכום

כאן אנו מתארים את דרך להביע את פני השטח אנטיגנים וירוס שפעת בצורה נכונה מקופלים ופונקציונליים הנגזרים מנגיף H7N9 הרומן הסיני בתאי חרקים. הטכניקה יכולה להיות מותאמת להביע ectodomains של כל משטח חלבונים נגיפיים או סלולריים.

תקציר

מערכת ביטוי baculovirus היא כלי רב עוצמה לביטוי של חלבונים רקומביננטיים. כאן אנו משתמשים בו כדי לייצר גרסאות בצורה נכונה מקופלות ומסוכרות של שפעת גליקופרוטאינים משטח וירוס - hemagglutinin (HA) וneuraminidase (NA). כדוגמא, בחרנו חלבוני HA ו NA לידי ביטוי על ידי נגיף H7N9 הרומן שהתפתח לאחרונה בסין. עם זאת הפרוטוקול ניתן להתאים בקלות לחלבוני HA ו NA לידי ביטוי בכל שפעת אחרת וזני B וירוס. חלבונים רקומביננטיים HA (RHA) וNA (RNA) הם חומרים כימיים חשובים למבחנים חיסוניים כגון ELISPOT וELISA, וגם בשימוש רחב לסטנדרטיזציה חיסון, גילוי נוגדנים, בידוד ואפיון. יתר על כן, ניתן להשתמש במולקולות NA רקומביננטי למסך למעכבי מולקולה קטנות ושימושיים לאפיון של הפונקציה האנזימטית של NA, כמו גם רגישותו לתרופות אנטי. חלבוני HA רקומביננטי גם being נבדק כחיסונים ניסיוניים במודלים של בעלי חיים, וחיסון המבוסס על HA רקומביננטי היה מורשה לאחרונה על ידי ה-FDA לשימוש בבני אדם. השיטה שאנו מתארים כאן כדי לייצר את המולקולות הללו היא ישר קדימה ויכולה להקל על מחקר במעבדות שפעת, שכן הוא מאפשר לייצור כמויות הגדולות של חלבונים במהירות ובעלות נמוכה. למרות שכאן אנחנו מתמקדים בגליקופרוטאינים משטח וירוס שפעת, שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לייצר חלבונים נגיפיים משטח וסלולריים אחרים.

מבוא

כתגובה ראשונה להופעתה האחרונה של זן רומן H7N9 שפעת וירוס בסין, רכשנו פלסמידים הנושאים את רצפי הגנום לhemagglutinin (HA) וneuraminidase (NA) הגנים של שני הבידודים הראשונים. שימוש בפלסמידים אלה היינו יכול לבנות במהירות וקטורי ביטוי baculoviral לייצור של HA רקומביננטי ו NA בתאי חרקים. מערכת ביטוי זה מבוסס היטב במעבדה שלנו והוכיחה מרכזי לרבים מהפרויקטים של המחקר המתמשך שלנו ^1-8. תאי חרקים יכולים לקפל בצורה נכונה ושלאחר translationally לשנות חלבונים מורכבים. שינויים אלה כוללים glycosylation N צמוד, וזה חשוב עבור רבים גליקופרוטאינים נגיפיים. ככזה, אין זה מפתיע כי מערכת baculovirus היא די הוקמו להבעת פני השטח אנטיגנים נגיף שפעת. למעשה, רבים של מבני גבישי HA ו NA היה לפתור באמצעות חלבוני תא הביע חרקים ^9-11. יתרון נוסף שלמערכת נמצאת בתשואות גבוהה החלבון אמין שלה של עד 30 מ"ג של תרבית תאי HA / L (המבוססת על הניסיון שלנו עם יותר מ -50 חלבונים שונים HA) - תוצאה של ביטוי זיהום בנגיף מונע מאמרגן polyhedrin החזק.

הסרת הטרנסממברני וendodomain של חלבוני HA ו NA מאפשרת ביטוי של גרסאות secretable, מסיסה של החלבונים ובכך מאוד מקל על תהליך הטיהור. בנוסף, ectodomains אלה hexahistidine מתויג ולכן יכול להיות מטוהר באמצעות כרומטוגרפיה זיקה באמצעות Ni ^{2 +} שרף. תחומים הטרנסממברני של חלבוני HA ו NA לתרום לhomotrimer והיווצרות homotetramer, בהתאמה. על מנת לשמר oligomerizations אלה, אנו להוסיף תחום trimerization טרמינל C-לHA-, ותחום tetramerization N-המסוף לNA הבונה (איור 1). יש לנו הראינו בוודאות כי תחום כגון trimerization מייצב פונקציונליות, ותוצאותrved אפיטופים קונפורמציה על גבעול תחום של ¹ HA. Tetramerization הנכון של NA עשוי גם לתרום לתיקון מתקפל וNA פונקציה ^10. ניתן לבקש רצפים ווקטורי baculo העברת מחסה תחומים trimerization או tetramerization מהמחברים או ממעבדות אחרות ^{בתחום, 9,10,12.}

נושא חשוב נוסף לביטוי של חלבונים מופרשים בתאי חרקים הוא הבחירה של שורת התאים תקין. בעוד frugiperda Spodoptera נגזר תאי Sf9 לתמוך שכפול baculovirus טוב מאוד ומשמשים בדרך כלל להצלת וירוס והתפשטות, יש להם היכולת להפריש כמויות גדולות של חלבון מוגבל. Trichoplusia ni נגזר BTI-TN-5B1-4 תאים (הידוע בהכינוי גבוה חמש) יש יכולת הפרשה גבוהה יותר ונמצא שורת התאים של בחירה לביטוי בפרוטוקול זה ^13,14. יתר על כן, כדאי להפחית או אפילו להסיר את סרום שור העובר (FBS) מתרבויות ביטוי. לפיכך, אנו משתמשים במדיה עם מופחת (3%) תוכן FBS לגידול המניות עובדות וירוס, ואנו מבצעים את ביטוי החלבון בתקשורת חופשית בסרום.

חלבוני HA ו NA רקומביננטי משמשים עבור רבים טכניקות החיסוניות. אולי אחד הנפוץ ביותר הוא במבחני ELISA למדידת המרה בסרום על חיסון בבני אדם או בעלי חיים ^4,6,7,15. יש וNAS משמשים גם במבחני ELISPOT כשתי מולקולות של גירוי וריאגנטים לזיהוי תאי מפרישי נוגדנים ^16. השימוש בם כפיתיונות מולקולריים מאפשר במיוחד כדי למיין עבור plasmablasts או סוגים אחרים של B-תאים שלאחר מכן ניתן להשתמש כדי לבודד נוגדנים (טיפוליים) חד שבטיים (מבז). מולקולות HA ו NA רקומביננטי משמשות עוד באפיון של בז אלה ^8. דוגמאות אחרות כוללות ללמוד את יציבות pH או סגוליות של קולט הביע ידי מבודד וירוס שונה, או אנזימטי NA ספציפי כמותית הערכהפעילות או התנגדות למעכבים. יתר על כן, רקומביננטי, HA מטוהר יכול לשמש כדי לתקנן תוכן HA של חיסוני נגיף שפעת מומתים.

חשוב לציין, RHA (ובמידה מסוימת NA) מועמדי חיסון נמצאים כעת נבדקו במודלים של בעלי חיים וניסויים קליניים בבני אדם עם חיסון מועמד אחד שמורשה על ידי ה-FDA בשנת 2013 ^2,17-19. היתרון של חיסונים אלה רומן הוא כי, בשל האופי רקומביננטי של חלבונים אלו, ניתן למנוע את תהליך העבודה האינטנסיבית של יצירת של וירוסי reassortant צמיחה גבוהים. אולי אפילו יותר רלוונטי היא העובדה שתשואת HA שלהם היא גבוהה ולשעתק מזן לזן. כמו כן, מאחר חיסונים אלה מיוצרים במערכת חופשית ביצה, הם אינם מכילים חומרים מזהמים חלבון זה הם בעייתיים עבור אנשים עם אלרגיות לביצה.

כאן בחרנו להביע את חלבוני HA ו NA משני בידודים של נגיף הרומן הסיני H7N9 השפעת, / Anhui/1/13 וA/Shanghai/1/13 ^20,21. אלו הן דוגמאות בזמן, אבל הפרוטוקול המתואר יכול לשמש לביטוי של כל שפעת וחלבונים B HA או NA וניתן להתאים להביע כל חלבונים נגיפיים או סלולריים מופרשים אחרים. ניתן לשכפל חלבונים הטרנסממברני trimeric או tetrameric לקלטות ביטוי המשמשות לHA ו NA, בהתאמה. עם זאת, חלבונים תאיים מופרשים המסיסים ביותר, כמו האינטרפרונים לדוגמא, לא צריכים תחום נוסף לייצוב ויכולים לבוא לידי ביטוי אך ורק עם תג hexahistidine C-מסוף.

פרוטוקול

1. לדור של רקומביננטי baculovirus

1. שיבוט להעברה-פלסמידים baculovirus
   1. שיבוט H7 HA ו NA ectodomain N9 (או כל גן HA או NA אחר) לתוך פלסמידים העברת pFastBac שונה (ראה מבוא). וקטורים לHA המכיל תחום trimerization C-מסוף ותג hexahistidine, כמו גם עבור NA המכיל תחום tetramerization N-מסוף ותג hexahistidine, תוארו ^1,10,11,22 (איור 1) וניתן לבקש מ המחברים.
      הערה הסבר: ectodomains HA הביע ללא תחום trimerization יהיה מקופל בצורה לא נכונה, שמוביל לאובדן של אפיטופים נטרול קונפורמציה, במיוחד בתחום הגבעול. כמו כן, הפונקציה האנזימטית NA מסתמכת על tetramerization הראוי.
   2. לדור של bacmids
      להפוך העברה-פלסמידים baculovirus המכילים גנים HA ו NA לחיידקי DH10Bac לפי שימוש ביטוי baculovirusמערכת לפי הוראות יצרן. בודד ולטהר bacmids באמצעות ערכת Midiprep על פי הוראות יצרן (איור 2).
2. הצלה של baculovirus ואימות רקומביננטי של ביטוי חלבון
   הערה הסבר: בשלבים הבאים צריכים להתבצע על סביבה נקיה מחיידקים בזרימה למינרית. לבצע הליך זה באופן עצמאי עבור HA ו NA (או כל גן אחר של ריבית). תאי חרקים גדלים בדרך כלל ב28 ° C ללא CO _2. תאי Sf9 עבור פרוטוקול זה גדלים בתקשורת תא חרק המלאה TNM-FH בתוספת 10% FBS, 1% העט סטרפטוקוקוס ^* ו0.1% פתרון F68 Pluronic, אם לא צוינו אחרת, וpassaged 01:04 פעמיים בשבוע. חמישה תאים גבוהים גדלים בתקשורת בסרום חופשי SFX וpassaged 1:15 פעמיים בשבוע.
   ^* תוספת של אנטיביוטיקה צריכה להיחשב אופציונלית לאורך כל הפרוטוקול והותאמה על פי הנהלים בשימוש בכל מעבדה.
   1. פלייט תאי חרקים Sf9 6 צלחות גם בצפיפות של 2 x 10 ⁵ תאים / ² סנטימטר ולתת לשבת במשך 20 דקות בחממה 28 מעלות צלזיוס (ללא CO _2).
   2. מערבבים 2 מיקרוגרם (conc. 0.5-2 מיקרוגרם / ul) של bacmid רקומביננטי עם של מדיום TNM-FH (סרום חופשי, 1% העט סטרפטוקוקוס) 100 μl. מערבבים 6 μl של סוכן transfection עם של מדיום TNM-FH (סרום חופשי, עט סטרפטוקוקוס) 100 μl. לשלב את שני כרכים, מערבב בעדינות ולתת לשבת במשך 20 דקות בטמפרטורת חדר (תערובת transfection). כולל חיקוי transfection אחד כשליטה (איור 3).
   3. הסר supernatant מתאי Sf9 מצופה (תאים כעת להיצמד לצלחת) ולהחליף עם 2 מיליליטר של מדיום סרום ללא TNM-FH מכיל עט סטרפטוקוקוס (1%). הוסף את הכרך השלם של תערובת transfection (מצעד 1.2.2) ולטלטל את צלחת 6 היטב בקפידה במשך 5 שניות. דגירה בחממה 28 ° C ללא CO ₂ למשך 6 שעות (איור 3).
   4. החלף wi תקשורתתקשורת ה טרי מלאה TNM-FH (מכיל 10% FBS, 1% העט סטרפטוקוקוס ו0.1% F68 Pluronic). דגירה בחממה 28 ° C ללא CO ₂ למשך 6 ימים. בדקו מדי פעם תאים תחת מיקרוסקופ. תאים נגועים מופיעים בדרך כלל גדולים יותר, עגול יותר, מוגדלים גרעינים, ולהתחיל לנתק (איור 4).
   5. קציר של תאים ואישור של ביטוי חלבון
      1. קציר תאי הודעה 6 ימים transfection ידי צנטריפוגה XG ב 2000 במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. Supernatant מכיל baculovirus רקומביננטי - זה ישמש להפקת מייד מניות עובדות, או יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך שנים.
      2. כדי לבדוק את ביטוי חלבון לאסוף כדורים וגלולים ב500 μl של PBS. מערבבים 50 μl של ההשעיה עם 50 μl של חיץ טעינה-SDS (המכיל סוכן צמצום). הפעל SDS-PAGE ולבצע ניתוח כתם מערבי עם נוגדן אנטי hexahistidine כדי לאשר ביטוי גנים. כוללים תאים ממדומיםtransfection כפקדים שליליים (איור 3).
   6. הכנה של מניות עובדות
      1. צלחת 5 x 10 ⁵ Sf9 תאים / ² סנטימטר בבקבוק סנטימטר T175 ² ולתת לשבת במשך 20 דקות לאפשר להם לצרף למנה. החלף תקשורת TNM-FH להשלים עם תקשורת TNM-FH המכילה 3% FBS (1% העט סטרפטוקוקוס, 0.1% F68 Pluronic).
      2. להדביק תאים עם של supernatant ההצלה 100 μl. דגירה בחממה 28 ° C ללא CO ₂ למשך 6 ימים ולבדוק מדי פעם אם תאים מקבלים נגועים (כמתואר בשלב 1.2.5.).
      3. ספין ב2,000 XG בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות ולאסוף supernatant. זהו עכשיו מניית P2 שלך. מלאי זה יכול להיות מאוחסן ללא הגבלת זמן ב 4 ° C. חזור על תהליך ההדבקה באמצעות של מניית P2 100 μl להדביק תאים. המניה שנוצרה נקראת P3 או מניות עובדות, אשר יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס או להשתמש בם ישירות לביטוי חלבון. מניית P3 מכילה בדרך כלל 10 ^{7 -10 9 פלאק ויצר יחידות / מיליליטר.}

2. ביטוי חלבון וטיהור

הערה הסבר: תאי Sf9 לתמוך בצמיחה של baculovirus טוב מאוד. עם זאת, היכולת שלהם להפריש כמויות גדולות של חלבון רקומביננטי היא מוגבלת. לכן אנו משתמשים בקו אחר חרקים תא, חמישה תאים גבוהים, לביטוי של חלבונים רקומביננטיים מופרשים. תאים אלה אינם תומכים בשכפול baculovirus לכותרות גבוהות מאוד ¹³ אבל יש להם יכולת הפרשה גבוהה.

1. גדל חמישה תאים גבוהים
   לגדול חמישה תאים גבוהים במדיום תרבית תאי חרקים SFX בס"מ T175 ² צלוחיות. מעבר בכל יום אחר 1:3. לתרבות 200 ביטוי מיליליטר תצטרך לגדול 5 צלוחיות ומחוברות.
2. קצירת והדבקה של חמישה תאים גבוהים
   1. ניתוק חמישה תאים גבוהים מ -5 ס"מ T175 ² צלוחיות על ידי הקשה על צלוחיות עם היד שלך. לאסוף suspe התאnsion ולהעביר לתוך צינורות 50 צנטריפוגה מיליליטר.
   2. ספין ב1,200 XG במשך 7 דקות בטמפרטורת חדר. הסר supernatant באמצעות אחסון ולאחד את כדורים על ידי resuspending ב15 מיליליטר של מניית P3.
   3. בואו לשבת במשך 15 דקות במכסת מנוע הזרימה (איור 5).
   4. העבר 200 מיליליטר של מדיום תרבות Hyclone SFX לתוך בקבוק נקי, סטרילי 1,000 מיליליטר ייקר (ללא buffles, אטום עם רדיד אלומיניום לפני מעוקר, לא צריך היה בשימוש במשך תרבויות חיידקים לפני).
   5. מעביר את ההשעיה P3/cell לתוך הבקבוק שייקר. לאטום עם רדיד אלומיניום סטרילי ובקבוק העברה לתוך שייקר. לנער ב70 סל"ד ב28 מעלות צלזיוס במשך 72-96 שעה.
3. קצירת חלבון רקומביננטי מsupernatants ביטוי תא גבוה חמש
   1. 72-96 supernatants שעות שלאחר זיהום העברת התרבות ל500 דליי מיליליטר צנטריפוגה. ספין ב5,500 XG עבור 20 דקות ב 4 ° C. בינתיים לשטוף את צלוחיות שייקר 3x עם מים מזוקקים פעמיים(DDH ₂ O).
   2. העברת 3 מיליליטר תרחיף Ni-שרף לתוך צינור 50 מיליליטר עם 45 מיליליטר של PBS (אחד זקוק לתרבות מיליליטר 200). לנער היטב ולהסתובב ב3,000 XG בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות. למזוג את PBS ולשמור את הכדור. מערבבים את supernatant תא החרק עם גלולה Ni-השרף ולהעביר לתוך צלוחיות שייקר כבר נשטפו. לדגור על C ° 4 ל2-4 שעות, ואילו רועד (איור 6).
   3. הר 10 עמודת פוליפרופילן מיליליטר במהדק בעמדת תמיכה. הסר את שני כובעים, ולמקם את כוס מתחת לעמודה לאסוף זרימה דרך (פסולת). קח הבקבוק שייקר מתוך ייקרתי ולהתחיל להעביר את תערובת supernatant / תרחיף על הטור, זה יהיה לשמור על Ni-השרף ורק את supernatant יזרום דרך. להעביר את כל הנפח מעל העמודה (איור 7).
   4. שטוף את 4x השרף עם 15 מיליליטר של חיץ כביסה (50 מ"מ Na ₂ HCO _3, 300 mM NaCl, imidazole 20 מ"מ, pH 8). בואו כל ניקוז הכביסה החיץמהעמודה ולסגור אותו עם הכובע (צד תחתון).
   5. הוסף 2 מיליליטר של חיץ elution (50 מ"מ Na ₂ HCO _3, 300 mM NaCl, 300 imidazole מ"מ, pH 8) ולתת לשבת במשך 5 דקות. פתח עמודה ולאסוף את eluate. חזור על פעולה 3 פעמים נוספות (עם סך של 8 מיליליטר של חיץ elution). Eluate המכיל ריכוזים גבוהים של חלבון בדרך כלל תערוכות קצף כאשר מזועזע (איור 7). שמור eluate על קרח רטוב בכל הזדמנות אפשרית.
4. חילופי חיץ וריכוז
   1. יחידות Prespin 15 מיליליטר אולטרה צנטריפוגה (30 kDa חתוכים לHA / NA, אך עשויות להשתנות בהתאם לגודל החלבון מטוהר) עם PBS (pH 7.4-7.6) ב3,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. זורק לזרום וeluate עומס על טור הספין. מלא עם 5 מיליליטר של קור סטרילי, קרח PBS וספין ל60 דקות ב 3,000 XG ב 4 ° C.
   2. זרימת פריקה דרך שוב, למלא עם 15 מיליליטר של PBS הקר כקרח וספין ל60 דקות ב 3,000 XG ב 4 ° C. חזור על פעולה זו proceדורה עוד פעם אחת.
   3. קח את טור הספין מתוך צנטריפוגה ולאסוף להתרכז החיץ החליף (בדרך כלל 200 μl). זה מרוכז מאוד חלבון רקומביננטי. יש לשטוף את טור הספין עם 400 μl של קרח הקר סטרילי PBS ולהוסיף את זה לתרכיז. שמור את התרכיז על קרח בכל העת.

3. אפיון ובקרת איכות

1. מדידת ריכוז חלבון
   קח aliquot של התרכיז ולמדוד אותו על ידי שימוש בשיטת כימות החלבון שלך של בחירה. הגדר ריכוז חלבון עד 1 מ"ג / מיליליטר על ידי הוספת PBS ולהקפיא aliquots קטנים ל-80 ° C. מחזורי הפשרת הקפאה יפגעו במבנה החלבון ויכולים להוביל לצבירה.
2. SDS-PAGE והכתמת Coomassie
   הפעל 500 ng של החלבון שלך על SDS-PAGE ולבצע מכתים Coomassie. עבור מכתים מהיר ונוח להשתמש מגיב Coomassie בשילוב עם פרוטוקול מיקרוגל. חלבוני HA מופיעים בדרך כלל ב64kDa אילו חלבוני NA צריכים לרוץ בגודל של כ 56 kDa (8A דמויות ו-B). באמצעות הפרוטוקול תאר אתה לא צריך לראות את כל מוצרים פגומים. אם השפלה מתרחשת זה בדרך כלל סימן לזיהום שמרים / פטריות בביטוי. במקרה זה לחזור על התהליך ולוודא כדי לשמור על הכל סטרילי.
3. כתם מערבי / ELISA
   על מנת לאמת את זהות חלבון אנו ממליצים לעשות כדי כתם מערבי או assay ELISA עם נוגדנים ספציפיים. באופן אידיאלי, מבחני ELISA מבוצעים עם נוגדן אשר נקשר לאפיטופים קונפורמציה (נוגדני גבעול אנטי HA למשל ^1). באמצעות נוגדן כזה הקיפול הנכון של החלבון יכול להיות אישר (איור 8C).
4. מדידת NA פעילות
   קיפול נכון של NA הנגיפי גם יכול להיקבע על ידי מדידת פעילות NA. אנו ממליצים לבצע בדיקה זו באמצעות assay NA * STAR זמין המסחרית (פשוט בצעו את הנחיות המשתמש).

תוצאות

מולקולות HA מA/Shanghai/1/13 וA/Anhui/1/13 הביעו היטב עם תשואות של כ 20 תרבות מ"ג / ליטר. מולקולות NA של שני הזנים הראו רמות ביטוי מתונות החל מתרבות מ"ג / ליטר 0.2 לA/Shanghai/1/13 ל0.7 מ"ג / ליטר לA/Anhui/1/13. היו כל ארבע הכנות החלבון מעט מאוד כדי לא זיהומים (8A דמויות ו-B) עם יש להיות של טוהר גבוה יותר מאשר NAS אשר יכול להיות מוסברת על ידי רמת הביטוי. A/Shanghai/1/13 HA נותח נוסף באמצעות ELISA עם אדם הגבעול-reactive מנטרל הרחב מב CR9114 ^23.<...

דיון

למרות שהביטוי של חלבוני HA ו NA נגיף שפעת בתאי חרקים באמצעות מערכת ביטוי baculovirus הוא ישר קדימה, בדרך כלל, יש כמה נקודות חשובים שיש לשקול. זה חשוב, כפי שציין בהקדמה, שectodomains של HA ו NA באים לידי ביטוי בשילוב עם תחומים trimerization או tetramerization, בהתאמה. תחומים אלה מבטיחים קיפול נכון של המולקולות בדרך כלל נעזרות בתחום הטרנסממברני, שאינו נוכח אם רק ectodomain באו לידי ביטוי. לדוגמא, הביטוי של ectodomain HA ללא תחום trimerization מוביל לoligomerization והתערערות אפיטופי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם החומר/ציוד	מספר קטלוגי	של החברה	הערות/תיאור
מערכת ביטוי Baculovirus Bac-to-Bac	Invitrogen	10359-016	עקוב אחר הוראות היצרן
TNM-FH מדיום חרקים	Gemini Bioproducts	600-311
HyClone SFX-Insect	Thermo Fisher	SH30278.02
Cellfectin II מגיב	Invitrogen	P/N58760
Pluronic F68	Sigma	1000702664
SimplyBlue SafeStain	Invitrogen	LC6060
Ni-NTA	Agarose Qiagen	1018240
Amicon מסננים אולטרה צנטריגואליים Ultracel 30K	Millipore	UFC902024
עט Strep	Gibco	15140-122
עמודי פוליפרופילן (5 מ"ל)	Qiagen	34964
יעילות מקסימלית DH10Bac חיידקים	Invitrogen	10361-012
PureLink HiPure מסנן פלסמיד ערכת Midiprep	Invitrogen	K210015
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399-100G	למאגרי שטיפה ושטיפה
תאי	Sf9 ATCC	CRL-1711
High Five cells	Invitrogen	B85502