Method Article

בדיקה פנוטיפית מיקרוסקופית לכימות של מיקובקטריה תאית המותאמת להקרנה בתפוקה גבוהה/תוכן גבוה

DOI:

10.3791/51114

⸱

January 17th, 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Inserm U1019 - CNRS UMR 8024, Institut Pasteur de Lille, Université de Lille

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים בדיקה פנוטיפית החלה על מסכי תפוקה גבוהה / תוכן גבוה של RNA סינתטי קטן מפריע (siRNA), תרכובת כימית, וספריות מוטציה שחפת Mycobacterium. שיטה זו מסתמכת על זיהוי של שחפת Mycobacterium שכותרתו פלואורסצנטית בתוך תא מארח שכותרתו פלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית אוטומטית.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למרות הזמינות של טיפול וחיסון, שחפת (שחפת) נשאר אחד הזיהומים החיידקיים הקטלניים הנפוצים ביותר בעולם. מאז כמה עשורים, ההתפרצות הפתאומית של זנים עמידים לתרופות מרובות ונרחבות היא איום רציני על השליטה בשחפת. לכן, חיוני לזהות מטרות ומסלולים חדשים קריטיים עבור הסוכן הסיבתי של השחפת, שחפת Mycobacterium (Mtb) ולחפש כימיקלים חדשניים שיכולים להפוך לתרופות שחפת. גישה אחת היא להקים שיטות המתאימות למסכים הגנטיים והכימיים של ספריות בקנה מידה גדול המאפשרות חיפוש מחט בערימת שחת. למטרה זו, פיתחנו בדיקה פנוטיפית המסתמכת על זיהוי של Mtb שכותרתו פלואורסצנטית בתוך תאים מארחים בעלי תווית פלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית אוטומטית. בדיקה זו במבחנה מאפשרת כימות מבוסס תמונה של תהליך הקולוניזציה של Mtb לתוך המארח היה אופטימיזציה עבור פורמט microplate 384-well, אשר מתאים למסכים של siRNA-, תרכובת כימית- או Mtb מוטציה ספריות. התמונות מעובדות לאחר מכן לניתוח רב-פרמטרי, המספק הסקת מסקנות על הפתוגנזה של Mtb בתוך תאים מארחים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בין הפתוגנים זיהומיות המתעוררים המתעוררים מחדש שדווחו בשנים האחרונות, שחפת Mycobacterium (Mtb) מחזיק מקום בולט להיות אחראי על 1.4 מיליון מקרי מוות ו 8.7 מיליון זיהומים חדשים בשנת 2011 (דו"ח שחפת גלובלית 2012, www.who.int/topics/tuberculosis/en/). למרות הזמינות של טיפולים multidrug, מספר האנשים הנגועים עדיין במגמת עלייה ועמיד multidrug (MDR) כמו גם עמידים לתרופות נרחב (XDR) Mtb מתפשטים במהירות בכל רחבי העולם1. יתר על כן, כאשר לוקחים בחשבון את נוכחותם של אנטיגנים Mtb, ברור כי שליש מהאוכלוסייה העולמית נחשב נגוע סמוי על ידי Mtb. סטטיסטית, במקרה אחד מתוך עשרה, יש אבולוציה לקראת הצורה הפעילה של המחלה עם הסימפטומים הקליניים הבאים2. לכן, אמצעים חדשים להילחם Mtb נדרשים בדחיפות. בהקשר זה, פיתחנו מבחנה פנוטיפית ויזואלית במבחנה המסתמכת על ניטור פלישת Mtb וכפל לתאים מארחים על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית אוטומטית3. ההתאמה של הבדיקה בלוחות מיקרוטיטר 384-גם בשילוב עם רכישת תמונה אוטומטית וניתוח, אפשר תוכן גבוה / תפוקה גבוהה הקרנה (HC / HTS) של ספריות בקנה מידה בינוני של תרכובות, siRNAs ומוטנטים חיידקיים. ההקרנה של ספריית RNAi רחבת הגנום בבדיקה פנוטיפית זו אפשרה ובכך לזהות את הגורמים המארחים העיקריים המעורבים בסחר Mtb ושכפול תאיים, אלא גם את ההבהרה של מסלולים מארחים המנוצלים על ידי bacillus פקעת. הסתגלות נוספת של בדיקה פנוטיפית מסוימת זו הייתה לזיהוי גורמים חיידקיים החיוניים להתמדה תוך-פאגוזומלית של Mtb. לדוגמה, מעצר התבגרות phagosome נחשב לאחד המנגנונים העיקריים המאפשרים את הישרדותו ושכפולו של Mtb במקרופג'. ניטור של לוקליזציה תת תאית של מוטציות נוקאאוט Mtb בתאים פלואורסצנטי שכותרתו חומצית מותר לזיהוי של גנים חיידקיים המעורבים בתהליך ההישרדות4. לבסוף, הדמיה בתכולת גבוהה של Mtb מציעה גם שיטה מצוינת לכמת יעילות התרופה לעיכוב תופעות שונות כמו צמיחת חיידקים תאיים3. בסך הכל, סוג זה של תפוקה גבוהה phenotypic assay מאפשר האצת גילוי סמים נגד שחפת ואת הנתונים שנאספו על ידי גישות שונות אלה לתרום להבנה טובה יותר של מניפולציה המארח המופעל על ידי Mtb.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הקרנת siRNA בגנום בעל תפוקה גבוהה

הקרנה שבוצעה במודל אנושי מסוג II pneumocytes A549 קו התא על זיהום עם Mtb H37Rv המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). הליך זה מתואר באיור 1א.

  1. Resuspend ספריית siRNA מיובש המאוחסן לוחות אמא (96-באר צלחות) עם 1x siRNA חוצץ להגיע לריכוז של 4 מיקרומטר, ולאחר מכן להעביר 10 μl של התערובת לתוך צלחת בת 384-well (צלחת הבת 1).
  2. הוסף 10 μl של חיץ 1x siRNA בצלחת הבת 1 כדי לדלל siRNA על ידי 2-פי 2. לאחר ההשעיה מחדש של siRNA, הצלחות אטומות באטם אלומיניום קלוף וניתן לאחסן אותן ב-20 °C (6 חודשים) לפחות 6 חודשים ועד 2-3 שנים, אך זמן האחסון עשוי להשתנות בהתאם להמלצות היצרן של ספריית siRNA.
  3. לדלל siRNAs בצלחת הבת 1 לתוך צלחת הבת 2 כדי להגיע לריכוז של 500 ננומטר. לאחר ההשעיה מחדש של siRNA, הצלחות אטומות באטם אלומיניום קלוף וניתן לאחסן אותן ב-20 °C (6 חודשים) לפחות 6 חודשים ועד 2-3 שנים, אך זמן האחסון עשוי להשתנות בהתאם להמלצות היצרן של ספריית siRNA.
  4. לפני השימוש, להפשיר את צלחת הבת 2 בטמפרטורת החדר.
  5. קח 2.5 μl של siRNA מצלחת הבת 2 ומניחים לתוך צלחת 384-wellsay.
  6. באותה צלחת 384-wellsay בשלב 1.5, להוסיף 2.5 μl שליטה שלילית וחיובית siRNA לבארות שלהם בהתאמה.
  7. לדלל את reagent transfection ב 1x D-PBS כדי להניב פתרון מספיק כדי לספק 0.1 μl transfection reagent בכל באר מראש את פתרון transfection מדולל בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
  8. הוסף 7.5 μl של תערובת פתרון reagent / PBS transfection לכל באר בצלחת ההסתערות והדגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  9. הוסף 40 μl של תאים A549 (1,500 תאים / טוב) מושעה RPMI 1640 בינוני בתוספת 10% סרום שור עוברי (FBS). לשמור על תאים לתקופה של 3 יום דגירה ב 37 °C (69 °F) באטמוספרה המכילה 5% CO2. תאים אלה מתחלקים כל 24 שעות, ולכן כ -12,000 תאים נמצאים בבארות שלושה ימים לאחר ההחלקה.
  10. לשטוף בת שבועיים GFP-ביטוי Mtb H37Rv תרבות החוצה עם D-PBS (חינם מ MgCl2 ו CaCl2) על ידי צנטריפוגה ב 4,000 x g במשך 5 דקות להשליך את הכביסה. חזור על שלב זה 3x. (עבור GFP-Mtb H37Rv תנאי תרבות ראה פרוטוקול 3).
  11. להשעות את גלולת חיידקים ב 10 מ"ל של RPMI 1640 בינוני בתוספת 10% FBS ו decant במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר כדי לאפשר אגרגטים חיידקיים משקעים.
  12. לאסוף את supernatant חיידקי ולמדוד OD600 (OD600 צריך להיות בין 0.6-0.8) ו GFP-פלואורסצנטיות (ערך RFU) באמצעות קורא microplate כדי לקבוע את ריכוז החיידקים. חשב את titer של המתלה באמצעות קו רגרסיה הפניה המציג ערך RFU = f (ערך CFU) שנוצר לפני הניסוי על תרבות אחרת שהוכנה באותם תנאים. הכן השעיה חיידקית המכילה 2.4 x 106 חיידקים / מ"ל, אשר מתאים ריבוי של זיהום (MOI) של 5.
  13. הסר את המדיום בצלחת 384-wellsay ולהוסיף 25 μl של השעיה חיידקית שהוכנה טרי.
  14. דגירה צלחת 384-wellsay ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 שעות באווירה המכילה 5% CO2.
  15. הסר את המדיום בעדינות לשטוף את התאים עם בינוני RPMI בתוספת 10% FBS 3x.
  16. כדי להרוג את החיידקים החוץ תאיים הנותרים, לטפל בתאים עם 50 μl של מדיום RPMI-FBS טרי המכיל 50 מיקרוגרם / מיליליטר של אמיקצין ב 37 °C (70 °F) במשך 1 שעות באטמוספרה המכילה 5% CO2.
  17. הסר את amikacin המכיל בינוני ולהוסיף 50 μl של בינוני RPMI טרי בתוספת 10% FBS. דגירה צלחת 384-wellsay ב 37 °C (60 °F) במשך 5 ימים באווירה המכילה 5% CO2.
  18. לפני רכישת התמונה, להוסיף 10 μl של מוכן טרי 30 מיקרוגרם / מיליליטר של DAPI ב PBS (ריכוז סופי 5 מיקרוגרם / מיליליטר) ואת הדגירה במשך 10 דקות ב 37 °C (70 °F).
  19. טען את הלוח למיקרוסקופ קונפוקל אוטומטי.
    figure-protocol-1
    לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
  20. הגדר את פרמטרי החשיפה. הקלט פלואורסצנטיות DAPI באמצעות לייזר עירור 405 ננומטר עם מסנן פליטה 450 ננומטר ופלואורסצנטיות GFP באמצעות לייזר עירור 488 ננומטר עם מסנן פליטה 520 ננומטר.
    figure-protocol-2
    לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
    figure-protocol-3
    לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
  21. בחר את הבאר ואת השדות בכל באר שיש לרכוש, אשר נקראים לאחר מכן פרמטרי פריסה ושכבת משנה.
    figure-protocol-4
    לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
    figure-protocol-5
    לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
  22. צור את קובץ הניסוי באמצעות הפרמטרים משלבים 1.20 ו- 1.21 והפעל את הרכישה האוטומטית.
    figure-protocol-6
    לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
    figure-protocol-7
    לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
  23. העבר תמונות לשרת מרוחק.
    figure-protocol-8
    לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
  24. הערך תמונות באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. זהה גרעיני תאים מערוץ DAPI באמצעות אלגוריתם לזיהוי גרעינים והאזור החיידקי מערוץ GFP באמצעות אלגוריתם מאפייני עוצמת פיקסלים (איור 4A).

הערה: פרוטוקול זה מותאם במיוחד כדי לחקור את ההשפעה של השתקת גנים על צמיחת Mtb תאיים. Mtb הוא חיידק בצמיחה איטית אשר מתחלק כל 20 שעות בתנאים אופטימליים. לאחר 5 ימים לאחר ההדבקה כמות Mtb חוץ תאי עדיין נמוך בהיעדר תמוגה התא ולא השפיע על איכות הניתוח. פרוטוקול זה חייב להיות אופטימיזציה במונחים של אורך הטיפול האנטיביוטי וזמן הדגירה כדי להיות מותאם מסכי siRNA באמצעות חיידקים בצמיחה מהירה כמו Mycobacteria smegmatis ו Escherichia coli כי הם שוחררו בהרחבה יכול להדביק תאים חדשים.

2. הקרנה תרכובת בתפוקה גבוהה

ההקרנה בוצעה על Mtb H37Rv תאים מארחים נגועים. הליך זה מתואר באיור 1B.

  1. להפשיר את צלחות אמא 384-באר המכיל את הספרייה המורכבת solubilized ב DMSO 100%. העבר 0.5 μl של תרכובות צלחות בת 384-well המכיל 10 μl של RPMI 1640 בינוני בתוספת 10% FBS.
  2. לשטוף בת שבועיים GFP-ביטוי Mtb H37Rv תרבות החוצה עם D-PBS (חינם מ MgCl2 ו CaCl2) על ידי צנטריפוגה ב 4,000 x g במשך 5 דקות להשליך את הכביסה. חזור על שלב זה 3x (עבור GFP-Mtb H37Rv תנאי תרבות ראה פרוטוקול 3).
  3. להשעות את גלולת חיידקים ב 10 מ"ל של RPMI 1640 בינוני בתוספת 10% FBS ו decant במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר כדי לאפשר אגרגטים חיידקיים משקעים.
  4. לאסוף את supernatant חיידקי ולמדוד OD600 (OD600 צריך להיות בין 0.6-0.8) ו GFP-פלואורסצנטיות (ערך RFU) באמצעות קורא microplate. חשב את titer של המתלה באמצעות קו רגרסיה הפניה המציג ערך RFU = f (ערך CFU) שנוצר לפני הניסוי. ריכוז אופייני הוא 1 x 108 חיידקים / מיליליטר.
  5. קציר 6 יום מקרופאגים אנושיים ראשוניים ישנים ב 4 x10 5 תאים / מיליליטר ב RPMI 1640 בינוני בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו 50 ng /ml רקומביננטי אנושי M-CSF (עבור תאי מונוציט דם היקפיים אנושיים טיהור ובידול מקרופאגים ראה פרוטוקול 4).
  6. דגירה את התאים הראשיים מדולל עם bacilli ב MOI שונים, החל 1-5, בהשעיה עם רעידות קלות ב 90 סל"ד במשך 2 שעות ב 37 °C (69 °F).
  7. לשטוף את התאים הנגועים על ידי צנטריפוגה ב 350 x g כדי להסיר את החיידקים חוץ תאיים. לאחר כל שלב צנטריפוגה, resuspend גלולה ב RPMI 1640 בינוני בתוספת 10% FBS. חזור על שלב זה 2x.
  8. להשעות את התאים הנגועים ב RPMI 1640 בינוני בתוספת 10% FBS ו amikacin ב 50 מיקרוגרם / מיליליטר ולהדגיר את ההשעיה עם טלטול קל במשך 1 שעה ב 37 °C (67 °F).
  9. הסר את מדיום תרבית התא המכיל amikacin על ידי צנטריפוגה ב 350 x g ולשטוף את התאים הנגועים עם מלא RPMI 1640 בינוני בתוספת 10% FBS ו 50 ננוגרם / מיליליטר M-CSF אנושי רקומביננטי. חזור פעם אחת.
  10. הוסף 40 μl של השעיית מקרופאגים נגועים באותה צלחת מבחנים בשלב 2.1, אשר כבר מכיל 10 μl של דילולים מורכבים. הריכוז הסופי של DMSO בכל באר הגיע כעת 1%.
  11. דגירה צלחות assay במשך 5 ימים ב 37 °C (60 °F) באווירה המכילה 5% CO2.
  12. הכתים את התאים החיים בצבע פלואורסצנטי אדום-רחוק חדיר לתאים.
  13. טען את הלוח למיקרוסקופ קונפוקל אוטומטי.
    figure-protocol-9
    לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
  14. הגדר את פרמטרי החשיפה. רשום פלואורסצנטיות אדומה רחוקה באמצעות לייזר עירור 640 ננומטר עם מסנן פליטה 690 ננומטר ופלואורסצנטיות GFP באמצעות לייזר עירור 488 ננומטר עם מסנן פליטה 520 ננומטר.
    figure-protocol-10
    לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
    figure-protocol-11
    לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
  15. בחר את הבאר ואת השדות בכל באר שיש לרכוש, אשר נקראים לאחר מכן פרמטרי פריסה ושכבת משנה.
    figure-protocol-12
    לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
    figure-protocol-13
    לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
  16. צור את קובץ הניסוי באמצעות הפרמטרים משלבים 2.14 ו- 2.15 והפעל את הרכישה האוטומטית.
    figure-protocol-14
    לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
    figure-protocol-15
    לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
  17. העבר תמונות לשרת מרוחק.
    figure-protocol-16
    לחץ כאן כדי להציג תמונה גדולה יותר.
  18. הערך תמונות באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. זהה אזור תאים מערוץ אדום רחוק באמצעות אלגוריתם מאפייני עוצמת פיקסל ואזור חיידקי מערוץ GFP באמצעות אלגוריתם מאפייני עוצמת פיקסלים (איור 4B).

הערה: פרוטוקול זה יכול להיות מותאם להקרנת ספריית מוטנטים Mtb על ידי החלפת תרכובות על ידי מוטנטים המבטאים חלבון פלואורסצנטי (מוטציה אחת טובה / אחת) (איור 1C, ראה גם ברודין ואח '. 4). מוטציות פלואורסצנטיות הן הזרע הראשון בארות (20 μl של השעיה חיידקית לכל באר). חיידקים הם התאוששו לאחר מכן על ידי 30 μl של השעיית תאים. לאחר צנטריפוגה ב 350 x גרם במשך 1 דקות, הצלחת היא דגירה ב 37 מעלות צלזיוס באווירה המכילה 5% CO2. זמן הדגירה ו- MOI תלויים במהלך ההסמכה. לדוגמה, עבור הדמיה של אירועים תאיים מוקדמים כגון חומציות phagosome, התאים יכולים להיות נגועים במשך 2 שעות עם MOI החל 1-20. Lysosomes מוכתמים באמצעות צבע Lysotracker ב 2 μM עבור 1.5 שעות ב 37 °C (69 °F) באווירה המכילה 5% CO2 ולאחר מכן קבוע עם 10% פורמלין או 4% paraformaldehyde (PFA). תמונות קונפוקל נרכשות ולבסוף מנותחות באמצעות סקריפטים לניתוח תמונה הכוללים אלגוריתמים מתאימים לזיהוי ליזוזומים ולוקליזציה תת-תאית4.

3. חלבון פלואורסצנטי ירוק המבטא שחפת מיקובקטריום H37Rv (GFP-H37Rv) תנאי תרבות

עבור אחסון לטווח ארוך, GFP-H37Rv הוקפאו D-PBS (סביב 1 x 108 mycobacteria לכל בקבוקון).

  1. Resuspend בקבוקון אחד קפוא של GFP-H37Rv בבקבוקון ארלנמייר המכיל 50 מ"ל של 7H9 מרק בינוני בתוספת העשרה OADC מידלברוק 10%, גליצרול 0.5%, Tween-80 0.05%, והיגרומיצין B (50 מיקרוגרם / מיליליטר).
  2. דגירה 8 ימים ב 37 °C (69 °F).
  3. מדוד OD600 של תרבות GFP-H37Rv.
  4. לדלל את התרבות GFP-H37Rv כדי להשיג OD600 = 0.1 טרי 7H9 מרק בינוני בתוספת מידלברוק OADC העשרה 10%, גליצרול 0.5%, Tween-80 0.05% ו Hygromycin B (50 מיקרוגרם / מיליליטר).
  5. דגירה GFP-H37Rv ב 37 °C (77 °F) במשך 8 ימים נוספים לפני השימוש עבור ההסתעפות.

4. טיהור תאי מונוציט בדם היקפי אנושי מדם שלם או הכנת מעיל באפי

  1. לדלל את כיס הדם 2x ב 1x D-PBS (ללא MgCl2 ו CaCl2) המכיל 1% FBS.
  2. בודדו את המונוציטים לפי צנטריפוגה הדרגתית בצפיפות Ficoll ב- 400 x g למשך 20 דקות.
  3. אסוף את המונוציטים המבודדים.
  4. לשטוף את המונוציטים 3x עם 1x D-PBS (ללא MgCl2 ו CaCl2) המכיל 1% FBS על ידי צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. לרכז את התאים עד 1 x 107 תאים / מיליליטר.
  6. לטהר מונוציטים באמצעות חרוזי CD14 מגנטיים על פי פרוטוקול היצרן (ראה חומרים).
  7. לאחר טיהור CD14-monocytes, זרע את התאים ב 1.5 x 106 תאים / מיליליטר ב RPMI 1640 משלים עם 10% FBS ו 40 ng/ml של האדם מקרופאגים מושבה מגרה פקטור (hM-CSF) ודגר במשך 4 ימים ב 37 °C (60 °F) באטמוספרה המכילה 5% CO2.
  8. לאחר 4 ימים להחליף את המדיום עם טרי RPMI 1640 השלים עם 10% FBS ו 40 ng/ml של hM-CSF ו דגירה במשך 2 ימים ב 37 °C (67 °F) באטמוספרה המכילה 5% CO2.
  9. לאחר 6 ימים, התאים יכולים לשמש לבדיקה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הקרנת siRNA בגנום בעל תפוקה גבוהה

Mtb הוא מסוגל ליישב תאים חיסוניים במבחנה, כמו גם כמה תאים אפיתל ריאות אחרים. לדוגמה, Mtbהוא מסוגל להדביק ולפגוע בתאי אפיתל A549 המשמשים בדרך כלל כמודל עבור pneumocytes סוג אנושיII 5-7. Dectin-1 דווח כקולטן תא מארח מעורב ספיגת Mtb, תגובת proinflammatory והשפעה אנטיבקטריאלית על צמיחה מיקובקטריאלית תאית בתאי A5498. מצב siRNA המתואר בפרוטוקול 1 הוביל ל-85% מיעילות ההשתקה (נתונים לא הוצגו). השתקת ביטוי Dectin-1...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים כאן את השיטות הנדרשות לבדיקה פנוטיפית באמצעות זן Mtb H37Rv מבטא GFP כדי להדביק תאים מארחים בעלי תווית פלואורסצנטית, מה שהופך אותו מתאים למסכי תוכן גבוה / תפוקה גבוהה. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על מגוון רחב של תרכובות, בדיקות פלואורסצנטיות ומוטנטים Mtb. עבור כל פרוטוקול שתואר לעיל, ניתן היה לבצע שלבי קיבעון ואימונולה לפני רכישת התמונה. אנו משתמשים במיקרוסקופ קונפוקל פלואורסצנטי אוטומטי המצויד בעדשת מים 20X (NA 0.70) או 60X (NA 1.2) כדי לרכוש תמונות. המיקרוסקופ הקונפוקל מצויד בלייזרים עירור ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תמיכה כספית לעבודה זו סופקה על ידי הקהילה האירופית (ERC-STG INTRACELLTB Grant n° 260901, מענק MM4TB n° 260872), סוכנות לאומית דה Recherche, פדר (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed), ואת האזור נורד פאס דה קאלה. אנו מודים בהכרת תודה על הסיוע הטכני של גספר דלויסון, אליזבת ורקמייסטר, אנטונינו בונג'ובאני ופרנק לאפונט מפלטפורמת BICeL.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ומיקרו; צלחת שקופה שחורה, 384 בארותGreiner Bio-One781091127.8/86/15 מ"מ עם מכסה,
צלחת CellCarrier 384 בארותמטופלת TC PerkinElmer6007550שחור, תחתית שקופה, עם מכסה, TC מטופלת
V-bottom לבן, צלחת 384 בארותGreiner Bio-One781280 
סרט איטום, נושם, סטריליקורנינג3345 
ליפופקטמין RNAiMaxLife Technologies13778150מגיב טרנספקציה
דימתיל סולפוקסידסיגמא-אולדריץ'34943 
RPMI 1640 + GlutaMAX-ILife Technologies61870-010מדיום תרבית תאים
D-PBS 1x [-]MgCl2/[-]CaCl2Life Technologies14190-094Dulbecco' s Phosphate Salin Buffer
D-PBS 1x [+]MgCl2/[+]CaCl2Life Technologies14190-091Dulbecco' s פוספט סאלין מאגר
סרום בקר עובריLife Technologies2610040-79 
Ficoll Paque PLUSDutscher17-1440-03Ficoll לטיהור תאי מונוציטים בדם היקפי
CD14 MicroBeads,Miltenyi130-050-201טיהור של מונוציטים CD14+
אנושי M-CSF, פרימיום גר' (1000 μ ז)Miltenyi130-096-493מושבת מקרופאגים גורם מגרה
LS עמודותMiltenyi130-042-401עמודות לבידוד מונוציטים CD14+
Tween 80Euromedex2002-Aתרבית מיקובקטריות
גליצרול טוהר גבוה Euromedex50405-EXתרבית מיקובקטריה
  העשרת מידלברוק OADCBecton-Dickinson211886תרבית מיקובקטריות
7H9Becton-DickinsonW1701Pתרבית מיקובקטריות
Versene 1xLife Technologies15040033פתרון דיסוציאציה של תאים לא אנזימטיים
DAPILife TechnologiesD1306צבע גרעינים
Hoechst 33342Life TechnologiesH3570צבע גרעינים
Syto60Life TechnologiesS11342צבע גרעין/ציטופלזמה
פורמליןסיגמא-אולדריץ'HT5014תמיסת קיבוע תאים
siRNA המכוונת לדקטין-1סנטה קרוזsc-63276 
*siGenome* מאגר siRNA לא ממוקד דהרמקוןD-001206-14 
ריפמפיציןסיגמא-אולדריץ'R3501אנטיביוטיקה
איזוניאזיד (INH)סיגמא-אולדריץ'I3377-50Gאנטיביוטיקה
Hygromycin BLife Technologies10687-010אנטיביוטיקה
אמיקאציןסיגמא-אולדריץ'A1774אנטיביוטיקה
מיקרוסקופ קונפוקלי אוטומטי OPERAPerkinElmerרכישת תמונה
קולומבוס 2.3.1 מסד נתונים של שרתיםPerkinElmerהעברה, אחסון וניתוח נתונים
Acapella 2.6 תוכנתPerkinElmerניתוח מבוסס תמונה
תוכנת GraphPad Prism5GraphPadניתוח סטטיסטי
Excel 2010מיקרוסופטניתוח סטטיסטי
אנושי תוכנת

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gandhi, N. R., et al. Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis: a threat to global control of tuberculosis. Lancet. 375, 1830-1843 (2010).
  2. Barry, C. E., et al. The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies. Nat. Rev. Microbiol. 7, 845-855 (2009).
  3. Christophe, T., Ewann, F., Jeon, H. K., Cechetto, J., Brodin, P. High-content imaging of Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages: an in vitro model for tuberculosis drug discovery. Future Med. Chem. 2, 1283-1293 (2010).
  4. Brodin, P., et al. High content phenotypic cell-based visual screen identifies Mycobacterium tuberculosis acyltrehalose-containing glycolipids involved in phagosome remodeling. PLoS Pathog. 6, (2010).
  5. Bermudez, L. E., Goodman, J. Mycobacterium tuberculosis invades and replicates within type II alveolar cells. Infect. Immun. 64, 1400-1406 (1996).
  6. Dobos, K. M., Spotts, E. A., Quinn, F. D., King, C. H. Necrosis of lung epithelial cells during infection with Mycobacterium tuberculosis is preceded by cell permeation. Infect. Immun. 68, 6300-6310 (2000).
  7. McDonough, K. A., Kress, Y. Cytotoxicity for lung epithelial cells is a virulence-associated phenotype of Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun. 63, 4802-4811 (1995).
  8. Lee, H. M., Yuk, J. M., Shin, D. M., Jo, E. K. Dectin-1 is inducible and plays an essential role for mycobacteria-induced innate immune responses in airway epithelial cells. J. Clin. Immunol. 29, 795-805 (2009).
  9. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
  10. Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6, 569-575 (2009).
  11. Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. J. Biomol. Screen. 14, 151-160 (2009).
  12. Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16, 775-785 (2011).
  13. Song, O. R., et al. Confocal-based method for quantification of diffusion kinetics in microwell plates and its application for identifying a rapid mixing method for high-content/throughput screening. J. Biomol. Screen. 15, 138-147 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Intracellular Mycobacteria QuantificationHigh throughput ScreeningConfocal MicroscopyGFP expressing MycobacteriumHost Cell InfectionsiRNA Library ScreeningChemical Compound ScreeningAutomated Image AnalysisBacterial Area Per CellDose Response Curve

Related Articles