מיקרוסקופית Intravital הפסים תאורה נפתר מאוד של מרכזי ז'רמינל

סיכום

ההדמיה intravital ברזולוציה גבוהה עם ניגודיות משופרת עד 120 מיקרומטר עומק בבלוטות הלימפה של עכברים בוגרים מושגת על ידי מרחבית ויסות דפוס העירור של מיקרוסקופ שני פוטונים רב המוקדים. ב100 עומק מיקרומטר מדדנו החלטות 487 ננומטר (לרוחב) ו551 ננומטר (צירי), ובכך לעקוף את מגבלות פיזור ועקיפות.

תקציר

ניטור תקשורת סלולרית על ידי מיקרוסקופית רב פוטון רקמות עמוקות intravital הוא המפתח להבנת גורלם של תאי מערכת החיסון בתוך דגימות עבות רקמות ואיברים בבריאות ובחוליים. על ידי שליטה על תבנית הסריקה במיקרוסקופ רב פוטון ויישום אלגוריתמים מספריים מתאימים, פיתחנו גישת פסי תאורה, מה שאיפשר לנו להשיג פי 3 ברזולוציה צירית טוב יותר ויחס משופר אות לרעש, כלומר לעומת זאת, בלמעלה מ 100 עומק רקמת מיקרומטר בתוך מאוד פיזור רקמות של איברים הלימפה בהשוואה למיקרוסקופיה רב פוטון סטנדרטי. מהירות הרכישה, כמו גם השפעות photobleaching וניזקים היו דומה לטכניקת צילום המבוסס על מכפיל סטנדרטי, ואילו עומק ההדמיה היה מעט נמוך יותר בשל השימוש בגלאי שדה. על ידי שימוש בגישה עם פסי התאורה, אנו מסוגלים להתבונן בדינמיקה של פיקדונות מורכבים חיסון בתאים דנדריטים זקיקים משניים ̵1; ברמה של כמה מולקולות חלבון במרכזים נבטי.

מבוא

מיקרוסקופ לייזר סריקת שני פוטונים (TPLSM), עם יתרונות משלה להדמית רקמות עמוקות הקשורות לעירור פעם אולטרה קצר אינפרא אדום ^1, יש מהפכה השקפתנו על תהליכים חיוניים ברמה תא בודד על ידי חשיפת דפוסי תנועתיות ואינטראקציה של שונים תת תא חי חיות ^2-5. עם זאת, טכנולוגיה נוכחית היא עדיין לא מספיק כדי להבהיר את מנגנוני פעילות של איברים שונים ותפקוד כתנאי מוקדם לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות, שכן הוא הופך את המידע דליל רק על הבסיס המולקולרי של תגובה תאית בתוך רקמות בבריאות ובחוליים. הטכנולוגיה נוכחית מאפשרת חלון מרחבית רק של כמה מאה מיקרונים בשל פיזור ולנופף באפקטי עיוות קדמיות ברזולוציה מרחבית ויחס אות לרעש ^6, שהן בולטות במיוחד ברקמה הקומפקטית ביותר של בעלי חיים מבוגרים. השפעות עיוות אלו פיזור ולנופף מולם בשל הטרוגנית מאודחלוקת ד איזוטרופי של מקדם השבירה ברקמות, מה שמוביל בשלב ראשון להידרדרות תלויה עומק של רזולוציה מרחבית 3D וסופו של דבר לאובדן המוחלט של אותות שמקורם פוטונים עירור בליסטיים, כלומר הפסד של יחס אות לרעש. במונחים של bioscientific ויישומי רקמות עמוקות ביו, זה אומר שהטכנולוגיה הנוכחית אינה מסוגלת לחשוף את התקשורת סלולרית באופן חד משמעי, כי ברזולוציה נמוכה תוביל לאינטראקציות באופן כוזב חיוביות ואילו הירידה של יחס אות לרעש הייתי לגרום למערכת להתעלם מכמה יחסי גומלין בין מבנים עמומים.

על מנת לזהות באופן חד משמעי אינטראקציות הסלולר באופן דינמי, יש צורך ברזולוציה מרחבית השתפרה מאוד עמוק בתוך הרקמה. טכניקות Nanoscopy החזקות הציגו כיום מבוססות על אלגוריתמים מיוחדים מספריים, למשל גישות מבנה תאורה, על דלדול של המצב המעורר הראשון, כגון STED, RESOLFT, או על לוקליזציה מולקולה, למשל dSTORM, PALM, מצאו יישומים רבים בתאים קבועים, כמו גם בתרביות תאים חיות ^7. עם זאת, על מנת להרחיב את היישומים הללו לסעיפי רקמות, רקמות ואורגניזמים חיים שעדיין צריכים להתגבר על קשיים טכניים חמורים. שני פוטונים עירור STED עם אורכי גל שונים, כמו גם עם אורך גל יחיד (sw2PE-STED) לעירור ופליטה מאולץ יושמה כדי לשפר את הרזולוציה לרוחב פרוסות מוח ⁸ או במטריצות מלאכותיות עם תאים מוטבעים ^9, בהתאמה, באותו רזולוציה צירית כTPLSM סטנדרטי. שימוש אחד הפוטון STED, הדינמיקה של קוצים הדנדריטים יכולה להיות צילמה על פני השטח של קליפת המוח (עד 10-15 עומק מיקרומטר) בעכבר Thy1 EGFP מתגורר ברזולוציה של 67 ¹⁰ ננומטר. כלי תכליתי לביולוגיה התפתחותית מסופק על ידי מיקרוסקופ מובנה תאורה multifocal, המספק 2D הכפול השתפררזולוציה. עם זאת, טכניקה זו ניתן להשתמש רק באורגניזמים עם נטייה נמוכה של פיזור אור, כגון עוברי דגי זברה ^11. ובכל זאת, אף אחת מהטכניקות הללו ניתן ליישם ברקמת הפערים הפיזור של בעלי חיים מבוגרים בכמה מאות מיקרומטרים, שהם מודלים חיוניים למחקר ביו והקליני של מחלות עם הופעה לאחר לידה.

מבקר של הקירוב משמש לחישוב את צורת חזית גל העקיפה מוגבל, כלומר פונקצית נקודת התפשטות (כוחות הביטחון הפלסטיניים), לאחר ההתמקדות דרך עדשה, הרוחב של כוחות הביטחון הפלסטיניים לאורך הציר האופטי (ברזולוציה צירית) הוא לפחות פי שלוש גדול יותר רוחב כוחות הביטחון הפלסטיניים בניצב לציר האופטי (ברזולוציה רוחב) ^12. לנופף עיוותים מול הזמנות שונות לכמת ידי המקדמים של Zernike משמעותי לשנות את צורת חזית הגל של גל אלקטרומגנטים ממוקד בתחום ההדמיה רקמות עמוקות שמוביל לPSFs הרבה יותר גדול, במיוחד לאורך אופטיאל ציר ^13-15. לפיכך, שני החוקים העקיפה והשפעות עיוות חזית הגל מצביעים על הרזולוציה לאורך הציר האופטי כגורם המגביל בהדמיה רקמות עמוקות. ואילו טכניקות Nanoscopy להתמקד במנטרלות את המגבלות של השתברות, טכנולוגיה שמשפרת את הרזולוציה וחדות על ידי מנטרל הן עקיפה ואפקטי עיוות גל קדמי צירית יש צורך רק להדמית intravital ברזולוציה גבוהה. באופן אידיאלי, טכניקה זו צריכה להיות גם מהיר מספיק כדי לאפשר ניטור של דינמיקה סלולרית.

תיקון סטיות כוחות הביטחון הפלסטיניים ואובדן ניגוד באמצעות האופטיקה מתקנת בTPLSM בזמן אמת, נחקר בהרחבה והשתפר בעשור האחרון ^13,14,16-18 ולכן הבחירה הטובה ביותר הזמינים כיום המובילה לניהול טוב יותר של עירור בליסטי פוטונים ^14. ובכל זאת, בשל העובדה שרוב לנופף מול תיקון גישות בשימוש באופטיקה אדפטיבית הם איטרטיבי וכי הם חהיש צורך לחזור לאזורים קטנים (כמה 10 x 10 מיקרומטר ²⁾ בשל ההטרוגניות הגבוהה של מקדם השבירה ברקמות, מהירות הרכישה היא נמוכה באופן משמעותי מהנדרש לתנועתיות תא הדמיה ותקשורת. יתר על כן, המגבלה הפיסית בהסתגלות אופטיקה השתפרה TPLSM עדיין נקבעת על ידי עקיפה.

אפנון המרחבי של תאורה (SPIN) ואפנון זמני בצד זיהוי (ספייד) הוצעו באופן תיאורטי שיחול על מיקרוסקופיה לייזר סריקה כדי לשפר את הרזולוציה. היישום המעשי שלהם בתחום ההדמיה intravital עדיין להיות הפגין ^19.

יחדיו, יש ביקוש גבוה לפיתוח של טכנולוגיות, המשפרות את הרזולוציה להדמית רקמות עמוקות בחיים בעלי חיים מבוגרים. בעבודה זו, אנו משיגים אפנון המרחבית של דפוס העירור על ידי שליטה על תהליך הסריקה ברב קרן לייזר-s רב פוטון עם פסי תאורהמיקרוסקופיה שימורים (MB-SI-MPLSM) ^20. בניגוד לגישות תאורה מובנה, שבו חתך קורה עירור הוא מווסת מרחבית, אנו משתמשים רק בתהליך הסריקה על מנת להשיג את האפנון המרחבי של העירור. על ידי הרחבת העירור לאורך גל ארוך יותר, אנו מסוגלים לשפר את שניהם ברזולוציה מרחבית ויחס אות לרעש ברקמות עמוקות של מאוד פיזור רקמות (בלוטות לימפה לדוגמא, נתיב חופשי פיזור 47 מיקרומטר ^6), ללא תלות באופטית אות שאינו ליניארי אנו מזהים, כגון הקרינה, דור שני הרמוני או בתדירות אחרת ערבוב תופעה. שימוש בגישה זו באורכי גל עירור עד 900 ננומטר אנו מסוגלים באופן דינמי מבנים חלבוניים סלולריים תמונה בקנה המידה של כמה מולקולות במרכזים נבטי של בלוטות לימפה בעכבר. לפיכך, אנו יכולים לחזות טובים יותר את האינטראקציה בין יחידות אנטיגן נושא על פני השטח של תאי דנדריטים זקיקים ותאי B בתהליך של חיטוט אנטיgen במהלך התגובה החיסונית באיברים הלימפה משניים.

פרוטוקול

התקנת Multi-מרישים לTPLSM פסים תאורה

ההגדרה המשמשת כאן היא מיקרוסקופ רב קרן מיוחדת שני פוטונים לייזר סריקה, כפי שתוארה לעיל ^6,20. המערכת מתוארת באיור 1. הגישה יכולה להיות מיושמת על מיקרוסקופים אחרים שני פוטונים לייזר סריקה, אשר מסוגלים לסנכרן רכישת מצלמה עם התנועה של מראות galvoscanner, גם אם הם מסוגלים לבצע סריקה חד קרן בלבד . במקרה זה, החסרון יהיה מהירות רכישה נמוכה יותר, עם זאת בדומה למהירות הרכישה בTPLSM מבוססת PMT הסטנדרטי. על מנת להשיג את האיכות אופטימלית עד כמה שרזולוציה וניגודיות מודאגות, בphotobleaching הנמוך ביותר והניזקים והרכישה המהירה ביותר, זה recommendable לשקול את צעדי ההסתגלות הבאות של ההתקנה:

1. בדוק את כוח הלייזר של הלייזר כי תשא: לבדוק ב100%, בהשוואה לערכים מקוריים של היצרן וPrevioבבעלותנו קריאה ולהשתמש בו כפי שהוא אם גל עירור בננומטר 700-1,000 הטווח הוא הכרחי.
2. בדוק את האינדיקציה בקרה מרחוק לטי: מפצל אלומת Sa, כלומר לבדוק 0% והגדרות 100%. אם יש קרן תשא שנותרה ב100%, ולאחר מכן לבדוק ולאפס את עמדת null מנוע דריכה. טי: מפצל אלומת Sa מורכב מצלחת נמוכה מסדר λ / 2 ומקטב, אשר מפצלת את הקורות מקוטבות בניצב לייזר על נתיבי קורה בניצב: אחד מופנה למיקרוסקופ לעירור, האחר משמש משאבת הפרמטרים אופטיים מתנד (OPO). על ידי סיבוב אוטומטי צלחת λ / 2, הסתגלות מתמשכת של טי: Sa וכוח OPO, בהתאמה, מושגת.
3. התאם את OPO לאורך הגל הרצוי ולמדוד את תפוקת החשמל. אם הכוח הוא נמוך מדי (עם 4 W טי: לייזר Sa ב800 ננומטר, אחד צריך להיות מסוגל לקבל .8-1 W של קרן OPO בסביבות 1,050-1,100 ננומטר) לייעל את אורך גל השאיבה ולבדוק את ההגדרות של הראי דואר ושל הגביש ליבה. בחר את הערכים שלהם מומלצים אופטימליים, לעתים קרובות זמינים כמו תרשימים או גרפים, ולאחר מכן לכוונן אותם עד OPO מהדהד במוצא הגל הרצוי ומגדיל את הכוח.
   1. אם הכוח הוא עדיין נמוך, להתאים את שתי המראות נגישות של OPO עם ארבע ידיות כוונון-מראה נגישים. לעשות את הצעד הזה באיטיות רבה ובתנועות קטנות מאוד, לסירוגין בין המראות הקדמיות וסופו של דבר.
4. בדוק שTi: קורות Sa ו / או OPO להכות את מראות הכניסה במיקום המתאים, המרכזי.
   1. השתמש בפיסת נייר לבן (לא מאוד מבריק או משקף!) וצופת אינפרא אדום לצפייה קרן OPO וגבוה יותר הגל Ti: הקורות Sa.
      1. ללבוש משקפי מגן בעת ​​עבודה עם ניר Ti: הקורות Sa (בדרך כלל עד 720-750 ננומטר היא גלויות לאדם הממוצע).
   2. הגדר את כוח הלייזר (ים) נמוך ככל האפשר עבור הליך היישור כדי miמזער נזק לעיניים פוטנציאליות.
   3. תמיד לשמור על אורות הסביבה של החדר, כך שהתלמיד של העין מכווץ.
   4. זכור כי כוח הלייזר הוא על ידי מנחתים מורכב מצלחת λ / 2 ומקטבים, אשר אינו בתוקף עדיין, כאשר טי בשליטה בסדר: קרן שא נכנס לסריקה בראש!
5. בדוק שסרעפת נקודת כניסה היא פגעה באמצע על ידי Ti: קרן Sa ו / או OPO; אם לא, להתאים את שתי המראות האחרונות לפני קרן הלייזר נכנסה לסריקת הראש.
   1. השתמש בצופת IR וחתיכה קטנה של נייר לבן (אך לא מבריק / רעיוני!).
   2. תמיד לסגור את הסרעפת בכניסה למיקרוסקופ, כך שעמדת קרן לייזר יכולה להישפט באופן מדויק יותר. חשוב: אל תשכחו לפתוח מחדש את הסרעפת לפני שתמשיך לשלב 6!
6. התאם את נתיב קרן אור הלייזר שיקף למיקרוסקופ בהתאם. עשה זאת במקטעים קטנים ולבצע הקורה ווא איטרטיביlking.
   1. בדוק את נתיב האור כולו, אם תפוקת האור מעדשת המטרה היא לא נאותה.
   2. יש לבדוק תמיד את נתיב האור בעת השימוש במערכת בפעם הראשונה לאחר תקופה ארוכה סרק, תיקון גדול, כל החלפה של אלמנטים אופטיים, או אם בעיות חשודות להתקיים עם הפלט.
7. ודא כי כל המשטחים אופטיים הפעילים נקיים, במיוחד שהם ללא אבק! אם המשטחים מכוסים בשכבה של אבק, חזית הגל מעוות עוד לפני שנכנס לעדשה האובייקטיבית וקרן לייזר וכתוצאה מכך אף פעם לא יספקו תמונה חדה של המדגם!
   1. במידת צורך, לנקות את המראות עם חתיכת נייר מקופלת עדשה, טבולה באתנול או isopropanol.
8. בדוק שהקרן מגיעה חזרה למראה שממוקמת ישירות מעל מראה הכניסה בסוף מדחס הדופק מבוסס פריזמה, אחרי נתיב האור מוגדר. מכאן, שהקרן באה לידי ביטוי in כדי רבב הקורה (ע).
9. בדקו אם קרן הלייזר פוגעת בסרעפת שממוקמת בכניסה של מרבב הקרן, מייד לפני צלחת λ / 2, שינוי הקיטוב של קרן הלייזר שיתאים לדרישות להעברת 50% בפס רחב והשתקפות 50% בתוך ע.
   1. ראשית, לסגור את הסרעפת כך שעמדת הקרן יכולה להישפט באופן מדויק יותר ולבצע הליכה קורה בין שני דיאפרגמה, כלומר אחד בכניסה למיקרוסקופ, ושנייה בכניסת BM. עבור מיקרוסקופים סריקה חד קרן אחרות הסרעפת צריכה להיות ממוקמת בכניסה לסורק-XY.
   2. אם הקרן לא פגעה במרכז של הצמצם הסגור למטה, להתאים את המראה הנ"ל, ממוקם ישירות לפני הסרעפת כניסת BM. חשוב: אל תשכחו לפתוח מחדש את הסרעפת לפני שתמשיך לשלב 10.
10. עם הסרעפת נפתחה מחדש, לבדוק אם קרן הלייזר פוגעת במראות בBMעמידתם בנקודות. השתמש ברצועה צרה של נייר כדי שלא לחסום את חלק אחר של נתיבי האור המורכבים של BM!
11. בדוק אם הקרן פוגעת באמצע מראות יציאה: המראה עליון עבור קיטוב מקביל "P", במראה תחתון עבור "S" בניצב קיטוב. אם לא, להתאים את מראה הכניסה לפני BM.
12. בדוק אם "S" ו "P" אלומה מקוטבת מאפשר קבוצות להיכנס לקוביית המקטב והחפיפה הולמת בכניסה לסורק-XY. דלג על השלבים הבאים במקרה מיקרוסקופ סריקה חד קרן משמש.
13. בדוק אם אור הלייזר עובר באופן מרכזי את הסריקה ועדשות הצינור ומקבל במרכז של העדשה האובייקטיבית "מישור מוקד אחורי. חשוב: בשלב זה יש לעשות עם קרן הלייזר בעמדת מרכז, לא בעמדת חניה!
    1. להחליף את העדשה האובייקטיבית עם כלי מכוון ("עין שור") ולבדוק אם קרן הלייזר פוגעת במטרה באמצע, ואםתאורה היא אפילו.
    2. אם זה נראה את המקרה, לסגור את הצמצם לפני בע"מ ולבדוק אם תבנית התאבכות מעגלית מופיעה, עם עיגול שחור באמצע (מינימום הפרעה).
       1. התאם את מראה הכניסה אם יש שינוי משמעותי ביחס למרכז העין של השור.
14. עכשיו תחליף את העין של השור עם עדשה אובייקטיבית, למשל עם עדשת טבילה במי 20X.
    1. בדוק את נורית שדה הפלט עם פיסת נייר לבן. זה צריך להיות בהיר, אחיד ומיקום מרכזי.
    2. למדוד את תפוקת החשמל: בOPO 100% עם 100% שאיבת Ti: Sa (4 W), אחד צריך לקבל כ. 100-150 mW אחרי העדשה ב1,100 ננומטר (במיקרוסקופ משמש כאן). סמכויות לייזר נמוכות לא יספיקו לביצוע רב קורה SI-TPLSM. לסריקה חד קרן SI-TPLSM, 5-10 mW מספיקים. קרן הלייזר חייבת להישאר בעמדת המרכז מבלי להיות Scanneד!
15. אם ביצוע MB-SI-TPLSM, ליישר את המראות בBM כדלקמן:
    1. הנח מדגם homogenously fluorescing, למשל שקופיות הקרינה אדומות, על הבמה ולמקד את קרן הלייזר בתוך המדגם אך סמוך למשטח העליון (כלומר קרוב לחזית העדשה האובייקטיבית ").
    2. הגדר את המיקרוסקופ למצב של ריבוי הקורה ולבחור את מספר הקורות, בתחילת, רצוי רק קרן אחת, וקיטוב, "P" למשל.
       1. מצא את קרן הלייזר על ידי ההדמיה שקופית הניאון: להגדיר את התריס "P" לפתוח ולהפעיל את מצלמת CCD ברציפות תוך התמקדות הקורה.
       2. להבטיח את הקרן היא בעמדת המרכז, ושהסורק כבוי. ודא שהקרן לא נסרקה!
       3. מצא את הקורה על ידי מחפש נקודת אור בסמוך למרכז של שבב המצלמה.
       4. למקד את הקרן עד לנקודה היא הבהירה וחד ביותר, כלומר מטוס התמונה של מיקרוסקופ תואם את עמדתו של שבב המצלמה; להקטין את כוח הלייזר, כך שהנקודה היא לא רוויה. עם מערכת מיושרת היטב זה אומר שהכח הלייזר חייב להיות מינימום קרוב, כאשר עובד במצב חד קרן (כ 0.6 כוח לייזר mW צריך לעבוד).
       5. אם המקום הוא באופן משמעותי מחוץ למרכז, להזיז אותה קרוב יותר למרכז על ידי התאמת המראה מול בע"מ (או של הסורק לסריקה חד קרן).
       6. כאשר גם יישור הקיטוב האחר קרן, כלומר, "S", עכשיו לעבור למצב 2-קורה, לפתוח את התריס "S" ולבדוק את המיקום של הקורה (רק קרן אחת שניתן לראות ולו רק התריס "S" הוא פתוח ).
       7. בסיום, לעבור למצב 4 הקורה ולהשתמש במצב "P" הקיטוב (תריס "P" פתוח). עכשיו שני beamlets יופיע.
       8. סדר שני beamlets להיות מקביל לחלוטין לקצה התחתון של התצוגה של המצלמה, ולהגדיר אותם להיות 2.8 מיקרומטר לגזרים.
          >
          1. אם הם לא מיושרים כראוי, להתאים את המראה הראשון של BM.
          2. לא ליישר את הבורג באמצע, במקום להשתמש בשני ברגים היקפיים להעביר את המראה עד שתי הקורות הן 2.8 אממ לגזרים ומושלמים מסודרים אופקי.
       9. עכשיו לעבור למצב של 8 קרן בקיטוב "P", ולהתאים את המראה השני בע"מ (גם בלי הנקודה האדומה) עד 4 beamlets נמצא במרחק שווה ב2.8 אממ, ומסודר במקביל לקצה התחתון של התמונה.
       10. חזור על פעולה ב16 - ומצב 32 קורה, כדי להתאים את מראות BS 3 ו -4, בהתאמה. זה חשוב לbeamlets להיות במרחק שווה, כי SI-אלגוריתמים, הפשוט ביותר להיות אלגוריתם דקות מקסימום (חילו), מבוססים על הנחה זו.
16. החלף את המדגם אחיד ניאון עם אחד הטרוגני מובנה, למשל שורשי Convallaria חוצי מוכתמים.
    1. עבור לעמדת החניה של קורה העירור, Which ממוקם בדרך כלל בערכים גדולים של קואורדינטות הסורק, למשל (10,000; 10,000).
    2. סרוק את תמונה (רב קורה) עם מצלמת CCD. בדוק שהתמונה מופיעה חדה, אחיד וישרה.
    3. כוון את המצלמה אם התמונה מופיעה מסובבת: לסובב את גוף המצלמה axially סביב הציר האנכי ביד (להיות עדין!) עד שהתמונה מיושרת.
17. הפעל את הסורק-XY על מנת לשלוט בתהליך הסריקה על מנת ליצור את דפוס העירור, תמונת פסים כלומר.
    1. במקרה של סריקה רב קורה, הזז את מראה y הסורק, כלומר. בניצב לקו beamlet, בצורה כזאת, כדי ליצור תמונה מפוספסת ריבועית.
    2. אם שדה הראייה שנוצר כמתואר בשלב 17.1. הוא קטן מדי, להאריך את שגרת הסריקה על ידי הזזת מראה x הסורק לעמדה להבטיח כי קו הקורה בואו מוכפל וbeamlets נמצא במרחק שווה לאורך הקו כולו. חזור על התנועה המדויקתמראה y הסורק לאחר מראה x הסורק הוא עבר כדי ליצור את תמונת פסים הגדולה יותר.
    3. במקרה של סריקה חד קרן, לסירוגין תנועת ראי y הסורק עם תנועת ראי x סורק שוב ושוב בעמדות במרחק שווה - שהוגדרו על ידי המדען - על מנת ליצור את תמונת פסים הרצויה.
    4. הקפד להשתמש לתנועת ראי y סורק הפקודה למהירות קבועה (האצה / האטה מופחתת) ולמראה חד x הסורק במהירות המרבית (האצה / האטה לכל היותר).
18. באופן אוטומטי לרכוש ולשמור את התמונה המפוספסת עם המצלמה (שדה גלאי). לכן, לסנכרן את המצלמה עם הסורק ולהשתמש בסורק כהדק מאסטר.
19. חזור על רכישת תמונות מפוספסות (פרוטוקול סריקה שתואר בפרוטוקול 17) על ידי הזזת מראה x הסורק בעמדות שונות באופן הבא:
    1. בחר מספיק צעדים חזרה ואורך הצעד המתאים ביןשתי תמונות פסים הבאות כדי לכסות את המרחק בין שני beamlets ברציפות (במקרה זה 2.8 מיקרומטר וצעד אחד מראות הסורק שווה 25 ננומטר); זה עשוי להיות כדאי, כדי לאפשר חפיפה קטנה, כלומר 0.3-0.4 מיקרומטר נוסף.
    2. הגדר את x-Shift לערך שמתאים למגבלת הרזולוציה הרוחב באורך הגל המסוים. כדוגמא, באמצעות 10 שלבים של מראה x הסורק במשמרת ו12 או 13 משמרות להוביל לטוב ביותר גם צירי ותוצאות ברזולוציה רוחב במערכת זו. בדוק עם שקופיות מובנים, למשל שקופיות שורשי Convallaria, שמספרי העבודה הטובים ביותר במערכת בשימוש.
    3. ייעל את שני הערכים הללו עד שתמונת Convallaria הופכת החדה ביותר: להשתמש בכלי פרופיל קו על תמונות SI המחושבים ולהשוות את הרוחב של פרופילי הקו (המהווה את אות הקרינה מקירות תא Convallaria).
    4. לרכוש כל תמונה מפוספסת מסונכרנת עם תנועת הסורק ולשמור אותו בנפרד, לדוגמא: כקבצים בינאריים TIFF או.
20. פתח סט של תמונות פסים מלא כמו מטריצות, כלומר מטריצת 3D, בשגרת ההערכה ולהשתמש גם אלגוריתם דקות מקסימום או אלגוריתם פורייה-להפוך ליצירת מטריצת 2D של הרזולוציה הגבוהה SI-התמונה. האלגוריתמים תוארו בעבר בפירוט ^20.

עכברי חיסון והכנה לIntravital הדמיה

הניסויים בבעלי החיים אושרו על ידי ועדות המדינה המתאימות לרווחת בעלי החיים (LAGeSo, Landesamt für גזונטהייט und Soziales, ברלין) ובוצעו בהתאם להנחיות ותקנות (G0153/08 רישיון ניסוי בבעלי החיים) הנוכחיות.

21. האינדוקציה של תגובת מרכז נבטי בבלוטות לימפה popliteal והכנת תחום ההדמיה בוצעה כפי שתוארה לפני ^4. לטהר את תאי B immunomagnetically מהטחול של-8 B1 ^{+ / +} Jκ ^{- / -}ותאי B של B1-8 ^{+ / +} Jκ ^{- / -} ה-GFP ⁺ עכברים.
22. הזרק לווריד 3 x 10 ⁶ תאי B NP-ספציפיים עם טוהר> 95% באמצעות ⅛ B1-8 ^{+ / +} Jκ ^{- / -} ה-GFP ⁺ ו⅞ nonfluorescent B1-8 ^{+ / +} Jκ ^{- / -} בC57Bl / 6 נמענים .
23. יום אחד, לאחר העברה לתא לחסן את המקבלים עם 10 מיקרוגרם של NP-CGG (גלובולין ɣ nitrophenyl עוף) לתחליב בadjuvant של פרוינד המלא (CFA) בפנקס מזון האחורי הימני.
24. ברי התווית Fab של נוגדני anti-CD21/CD35 עם אסתר ATTO590-succinimidyl.
    1. כדי להדגיש את הרשת של תאי דנדריטים זקיקים (FDC) במרכז נבטי in vivo, להזריק 10 מיקרוגרם של שברי Fab כותרת fluorochrome לשודד אחוריות הימני של hr העכברים 12-24 לפני ניתוח intravital מתבצע.

השלבים הבאים צריכים להיות consideאדום להכנת הצומת לימפה popliteal להדמית intravital (היום 8-10 לאחר חיסון):

25. הרדימי עכבר על ידי הזרקת ה-IP של קטמין / xylazine, כמות בהתאם למשקלם.
26. בדיקת הרפלקסים לפקח עומק ההרדמה במשך כל תקופת ההדמיה.
27. לגלח את הרגליים, גב ואגף ימני של עכבר קפדני ולהשתמש שיער מתוך קרם להסרת שיער שיורית לחלוטין.
28. תקן trochanter תקין עיקרי: לאתר שבב גרמי עם אצבעות, להגדיר חתך בעור קטן עם מספריים עד fascia בצורת משולש לבן קטן מופיע.
29. הצמד שבב גרמי מתחת fascia זה עם פינצטה המחודדת של העוצר.
30. לתקן את עמוד השדרה באזור גב תחתון באמצעות פינצטה שיניים.
31. תקן את הרגל אחורית ימנית על עוצר ולהדק את הבורג.
32. זנב קלטת כדי לשמור על הרגל במצב הנכון.
33. בצד הזנב של הירך, ליצור חתך בעור, באזור שבו ente וריד popliteal הבולטrs הרקמות, להפריד את העור מהרקמה הבסיסית עם פינצטה הבוטה ובצע את וריד popliteal מפרוקסימלי לדיסטלי.
34. לחשוף את הבלוטות לימפה באמצעות פינצטה בוטה, נסה להימנע מחיתוך על מנת להגן על כלי הלימפה בסדר (לשמור על הבלוטות לימפה בPBS במהלך החשיפה).
35. ליצור מעגל של שומן ואקום סביב הבלוטה לימפה, למלא שלולית זה עם PBS.
36. שים את תלוש לכסות בעמדתה ולמקם את מדחום הבדיקה (לשמור על טמפרטורה על 37 מעלות צלזיוס, אחרת מהירות התא באופן דרמטי להשתנות).
37. לאורך הקצה העליון של להחליק את המכסה להוסיף עיגול של שומן ואקום.
38. שים את סליל החימום בעמדתה בגריז הוואקום, ליצור חותם באופן דומה כמו בעבר ולהוסיף מים / PBS על להחליק את מכסה הזכוכית לטבול האובייקטיבי ל.
39. לאחר הדמיה, העכבר נשמר בהרדמה, תוך הגדלת המינונים של קטמין / xylazine למנה קטלנית, ואחריו נקע בצוואר הרחם.

תוצאות

רזולוציה מרחבית בבלוטות הלימפה

הממדים של התפקוד היעיל נקודת ההתפשטות (ePSF) מתאימות לרזולוציה מרחבית של מיקרוסקופ ^12. מדדנו שלוש ממדי פונקציה זאת על ידי רכישת אות דור הרמוניות השנייה של סיבי הקולגן בבלוטות לימפה על ידי MB-SI-TPLSM שלנו בהשוואה לטכניקות הוקמו שני פוטונים במיקרוסקופ סריקת לייזר, כלומר TPLSM גילוי שדה (באמצעות מצלמות CCD) ו TPLSM זיהוי נקודה (באמצעות PMTs).

דיון

המטרה של הדמיה אופטית intravital היא דינמי ופונקציונלי כדי להמחיש תנועתיות ואינטראקציות הסלולר על מנת להבין רקמות ותפקוד איברים בבריאות ובחוליים ^5. טכנולוגיה רבת עוצמה ביותר להשגה, מיקרוסקופית לייזר סריקה רב פוטון זה, עדיין יש להתגבר על מגבלות הקשורות לנופף עיוותים קדמיות, פיזור, רכישה איטית, photobleaching וניזקים, המגבילים את הרזולוציה המרחבית שלו, בניגוד, כמו גם ברזולוציה הזמן שלה .

ישנם שני פתרונות...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ATTO590 – NSH לצימוד	ATTO Tec, גרמניה	AD-590-35
CD21/35 – שבר פאב – ATTO590	DRFZ, ברלין		תגובת הצימוד בוצעה במעבדה המרכזית של המוסד שלנו.
B1-8 Jk-/- EGFP+	פרופ' אן הברמן, אוניברסיטת ייל, קליפורניה, ארה"		ב ניתן למצוא גם במעבדות ג'קסון (JAX).
EasySep בחירה שלילית עכבר העשרת תאי B	StemmCell Technologies, גרמניה	19854
חרוזי פוליסטירן (605), 0.2 ומיקרו; m	Life Technologies, גרמניה	F8803
<חזק>ציוד
TriMScope I	LaVision Biotec, בילפלד, גרמניה
OPO (גרסה ידנית)	APE, ברלין, גרמניה
Ti:Sa Laser Chameleon Ultra II	קוהרנטי, דיסבורג, גרמניה
עדשת אובייקטיבית לטבילה במים, 20X, NA 0.95, IR, WD 2 מ"מ	אולימפוס גרמניה, המבורג, גרמניה