ניתוח של תרגום ייזום בתנאי לחץ ידי Polysome פרופיל

סיכום

כאן, אנו מתארים שיטה לניתוח שינויים בייזום של תרגום ה-mRNA של תאי אוקריוטים בתגובה למצבי לחץ. שיטה זו מבוססת על הפרדת המהירות בשיפועי סוכרוז של תרגום ריבוזומים מהריבוזומים שאינם תרגום.

תקציר

שליטה מדויקת של תרגום ה-mRNA היא יסוד להומאוסטזיס תא אוקריוטים, בעיקר בתגובה ללחץ פיסיולוגי ופתולוגיים. שינויים של תכנית זו יכול להוביל לצמיחה של תאים שניזוקו, סימן היכר של התפתחות הסרטן, או למוות של תאים מוקדמים כגון ראה במחלות ניווניות. הרבה ממה שידוע בנוגע לבסיס המולקולרי לבקרת translational כבר מתקבלים מניתוח polysome באמצעות מערכת חלוקה שיפוע צפיפות. טכניקה זו מסתמכת על ultracentrifugation של תמציות cytoplasmic על שיפוע סוכרוז ליניארי. ברגע שהספין הושלם, המערכת מאפשרת חלוקה וכימות של אזורי centrifuged המתאימים לתרגום שונה הריבוזומים אוכלוסיות, ובכך וכתוצאה מכך פרופיל polysome. שינויים בפרופיל polysome מעידים על שינויים או פגמים בייזום תרגום המתרחשים בתגובה לסוגים שונים של מתח. טכניקה זו מאפשרת גם להעריך את התפקיד דואר של חלבונים ספציפיים על ייזום תרגום, וכדי למדוד את פעילות translational של mRNAs הספציפי. כאן אנו מתארים הפרוטוקול שלנו לביצוע פרופילי polysome על מנת להעריך חניכה תרגום של תאים ורקמות אוקריוטים בתנאי גידול נורמלים או מתח.

מבוא

תאי אוקריוטים נתקלים כל הזמן במגוון של מצבים פיסיולוגיים וסביבתיים מזיקים מתח שדורשים תגובת תא הסתגלות מהירה. תגובת לחץ תא כרוכה באיזון מדויק בין גורמים הפועלים נגד הישרדות והפרה הישרדות. לשבש את האיזון הזה יכול להיות השלכות בלתי הפיכות המובילות את הפיתוח של פתולוגיות אדם כגון סרטן ומחלות ניווניות. במהלך השלב הראשון של תגובת הלחץ, תאים להפעיל מסלולים הפרו הישרדות שכוללים שליטה מתואמת של שינויים בביטוי גנים ברמה של תרגום ה-mRNA.

תרגום ה-mRNA באאוקריוטים הוא תהליך תאי מורכב שכרוכים באינטראקציות מתואמות בין גורמי חניכה התרגום (EIFS), חלבוני RNA הספציפי מחייבים (ריב '), ומולקולות RNA ^1. תרגום ה-mRNA מתחלק לשלושה שלבים ברורים: ייזום, התארכות, וסיום. למרות שכל שלושת השלבים כפופים לreguמנגנוני latory, מנגנוני בקרת translational למקד בעיקר בשלב הייזום של תרגום, אשר ובכך מהווה את צעד שער הגבלה של חלבון סינתזה ^2.

חניכה תרגום היא תהליך הורה מאוד שמתחיל עם הקמתה של eIF2a.GTP.Met-tRNA _^פגשתי מורכב משולשת ולאחר מכן מחייבת שלה למקטע הריבוזום 40S, מה שמוביל להיווצרות של המתחם טרום החניכה. השלב הבא הוא הגיוס של מתחם preinitiation mRNA, הכולל את הפעילות של גורמי חניכה תרגום כגון eIF4F וeIF3. מורכב preinitiation 48S וכך נוצרו עובר שינויי קונפורמציה ספציפיים המאפשרים למנגנון הזה כדי להתחיל לסרוק את אזור 5'-מתורגם של ה-mRNA עד שהוא מזהה את הייזום קודון אוגוסט אז רוב גורמי החניכה התרגום משתחררים ויחידות משנת 60S מגויסות כדי ליצור 80S הריבוזום מורכב מוסמך לתרגום,לא שמתחיל את סינתזת חלבון נקודה (איור 1). יותר מפעם אחת 80S monosome ניתן לתרגם את אותו mRNA בזמן הפקת polysomes שנקרא (או polyribosomes). הצפיפות של polysomes על mRNA משקפת ייזום, התארכות ושיעורי סיום ובכך הוא מדד של translatability של תעתיק מסוים. עם זאת, polysome פרופיל משמש בעיקר כדי להעריך את השינויים בתרגום ה-mRNA בשלב הייזום. כאן השתמשנו מעכב הפרוטאזום כמעכב ייזום תרגום. טיפול בתאי סרטן עם תרופה זו גורם לתגובת לחץ המאופיינת בהפעלה של קינאז בשם המתח HRI שphosphorylates גורם החניכה תרגום eIF2a ^3. זירחון של eIF2a הוא אחד האירועים המרכזיים שהובילו לעיכוב של חניכה תרגום בתאי יונקים ^4.

פרוטוקול

הפרוטוקול כדלקמן ההנחיות שאושר על ידי המועצה לביקורת האתית של לאוואל.

1. הכנת תרביות תאים ומניפולציה המוח

1. תאי יונקים ודרוזופילה
   1. לגדול הלה תאי סרטן צוואר הרחם ותאים עובריים שניידר דרוזופילה כמומלץ על ידי התרבות האמריקנית אוסף סוג. עבודה עם תאים במעבר נמוך.
   2. פלייט תאים כדי להגיע למפגש 80% היום של הניסוי. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, השתמש ~ 12 x 10 ⁶ תאים לכל תנאי ניסוי. לפני קבלת תמציות לניתוח polysome, לעורר תרגום על ידי הוספה בינונית מלא טרי לפחות 90 דקות.
2. בידוד מוח: לבודד את המוח מעכברים בגילים שבין 9 ו16 ימים לאחר לידה. המתת חסד כרוך משאיפת CO ₂ אחרי הרדמה ונקע בצוואר הרחם. בעקבות הקרבה, לבודד את המוח כולו וגם מקום שאניt ב -80 מעלות צלזיוס או ישירות להעביר אותו לקר PBS 1X לשימוש מיידי.

2. מערכת ההיפוך החלוקה Gradient הכנת הצפיפות

1. שטוף את מערכת צינורות עם 0.1% SDS למשך 5 דקות.
2. שטוף את מערכת צינורות עם אתנול 70% למשך 5 דקות, ולאחר מכן עם RNaseZAP פתרון עבור 5 דקות לפני שטיפה עם מים DEPC.
3. משאבת אוויר כדי לייבש את מערכת צינורות של המנגנון.

3. הכנת עירובי סוכרוז

1. הפוך את פתרונות סוכרוז 15% ו55% ב20 מ"מ טריס-HCl pH 7.4, 1.25 מ"מ MgCl _2, 150 mM NaCl, ו1 מ"מ DTT.
2. ליצור 15-55% שיפוע סוכרוז ליניארי באמצעות ISCO דגם 160 שיפוע לשעבר, כפי שתוארו על ידי הוראות היצרן. עם זאת, חשוב לשלוט גם על מהירות משאבת peristaltic טריס על מנת למנוע יצירה של בועות או מערבולות בהדרגות. שמור הדרגתיים על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
3. במהלך הזמן שבו תכנית יצרנית השיפוע פועלת, לקרר את ultracentrifuge עד 4 ° C.

4. הכנת נייד ותמציות מוח עכבר

1. הכנת תמציות סלולריים
   1. צלחת מקום (ים) בתאי קרח ולשטוף 3x עם PBS הקר 1X.
   2. קציר תאים (~ 12 x 10 ⁶⁾ במאגר 1 תמוגה מיליליטר (20 מ"מ טריס-HCl ב-pH 7.4, 1.25 מ"מ MgCl _2, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 1% P40 Nonidet, 5 מעכב U / מיליליטר RNase, בתוספת עם טבליות מעכבי פרוטאז קוקטייל מלאים מיני ללא EDTA), להעביר אותם לצינור Eppendorf, ומערבבים היטב על ידי העברתם 15x באמצעות מזרק אינסולין U100 1cc 28 G 1/2. בואו lysate התא לנוח על קרח במשך 15 דקות.
   3. שים כמה טיפות של lysate תא לשקופית להעריך תמוגה הסלולרית על ידי ההתבוננות במיקרוסקופ לעומת שלב באמצעות מטרת 10X. גרעינים רק צריכים להיות גלויים ולא קרום תא צריך להיות מעיד גלוי לתמוגה תא. כמו שליטה, להתבונןתאי unlysed.
   4. להבהיר את lysate התא על ידי צנטריפוגה ב11,000 XG עבור 20 דקות על 4 מעלות צלזיוס ולשמור lysate המסיסים המכיל polyribosomes.
2. הכנת תמציות מוח עכבר
   1. Homogenize המוח כולו המבודד (~ מ"ג 500) על ידי 10 משיכות בhomogenizer Dounce קר כקרח עם 2 מיליליטר של חיץ תמוגה ולהבהיר את homogenate על ידי צנטריפוגה ב11,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C.
   2. טען את supernatant וכתוצאה מכך על כרית של סוכרוז 50% ולהמשיך עם שקיעה לשעה 2 ב 200,000 XG באמצעות הרוטור ultracentrifuge TH-641 ב 4 ° C.
   3. Resuspend את הכדור השקוף המכיל polyribosomes ב 1 מיליליטר של חיץ תמוגה ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה. בואו שאר ההשעיה על הקרח למשך 30 דקות לפני העמסתי על הדרגות.

5. טוען תמציות על סוכרוז הדרגות וultracentrifugation

1. למדוד את הריכוזשל RNA הנמצא בתמצית cytoplasmic באמצעות ספקטרופוטומטר. לאט ובזהירות לטעון ~ 20 OD ₂₆₀ יחידות של התמצית על גבי שיפוע סוכרוז 15% ל55%. ודא שיש 2-3 מ"מ של שטח פנוי על פני השטח של צינור כדי למנוע גדות הצינורות במהלך צנטריפוגה.
2. צנטריפוגה הדרגתיים באמצעות אולטרה צנטריפוגות במשך שעה 2 30 דקות ב 230,000 XG באמצעות הרוטור ultracentrifuge TH-641 ב 4 ° C. כאשר מסתיימת צנטריפוגה, להסיר את הצינורות ומניח אותם על קרח בזהירות שלא להפריע את השיפועים.

6. היפוך חלוק של תמציות cytoplasmic לPolysomes פרופיל

1. הנח הדרגתיים סוכרוז על מערכת היפוך חלוקה צפיפות אוטומטית ולהמשיך עם חלוקה ואיסוף אוטומטיים של שברים (0.5 מיליליטר כל אחד), כפי שתואר על ידי היצרן.
2. לאסוף כל חלק (~ μl 500) לתוך צינורות Eppendorf אדם עם ניטור רציף של הספיגה ב 254 ננומטר. בparallאל של מבצע חלוקה השיפוע, פרופיל polyribosomal יהיה עריכה על נייר התרשים. לחלופין, השתמש ביחידת רכישת נתונים המצורפת למקליט התרשים יש רכישה אלקטרונית של פרופיל polysome.
3. בסוף כל סיבוב, להעביר eppendorfs נאסף על קרח יבש. בשלב זה, גם חנות שנאספו שברים ב -80 מעלות צלזיוס או ישירות משקע מתחמי החלבון-RNA באופן הבא.

7. מיצוי חלבון וניתוח

1. לכל שבר שנאסף משיפוע סוכרוז, להוסיף 2 כרכים של 100% אתנול קר ולתת קומפלקסי RNA-חלבון לזרז ב -20 לילה מעלות צלזיוס.
2. צנטריפוגה כל משקע RNA-חלבון ב11,000 XG עבור 20 דקות על 4 מעלות צלזיוס ולאחר מכן לשטוף עם 70% אתנול. יבש וresuspend המשקע בחיץ מדגם SDS-PAGE לפני שתמשיך עם כתם מערבי באמצעות נוגדנים ספציפיים (ראה איור 2).

8. RNA חילוץ וnalysis

1. משקע מתחמי RNA-חלבון כמו בסעיף 7.1. Resuspend כל משקע RNA-חלבון במאגר תמוגה מכיל 0.1% SDS. לעכל את מרכיב החלבון של המשקע עם 2 מ"ג / מיליליטר proteinase K ל30 דקות באמבט מים C ° 55.
2. לחלץ רכיבי RNA של המשקע על ידי הוספת נפח של 1 "פנול: כלורופורם", 2 כרכים של כלורופורם, ו0.1 נפח של 2-pH M NaOAc 4 וצנטריפוגה ב 10,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. משקע RNA מהשלב וכתוצאה מהמימי של כל דגימת לילה בשעה -20 ° C על ידי הוספת נפח של 1 isopropanol ו0.2 מיקרוגרם / μl של גליקוגן. ספין המשקע עבור שעה 1 ב 10,000 XG ב 4 ° C. שטוף את כדור RNA עם 70% אתנול קר.
3. Resuspend את כדור RNA לנפח קטן של מים חופשיים RNAse. להעריך את הכמות ואיכות של RNA באמצעות ספקטרופוטומטר.

תוצאות

כאמור, polysome פרופיל מאפשר הניתוח של שינויים של חניכה תרגום בתנאי לחץ. איור 1 היא תצוגה פשוטה של ייזום תרגום אשר כפי שתואר קודם לכן הוא תהליך רב שלבי מעורבים הרכבה מסודרת של מתחמי ייזום תרגום. תחת תנאי גידול רגילים, מתחמי ייזום תרגום מומרים לpolyribosomes גילויו על ידי פרופיל polysome מעיד על חניכה תרגום פעילה (איור 2; שלא טופל). תחת תנאי לחץ לעומת זאת, חניכה תרגום חסומה וכתוצאה מכך ההצטברות של monosomes 80S והפחתה של פסגות polysome (איו...

דיון

ניתוח פרופיל polysome על הדרגתיים סוכרוז מאפשר מדידה של חניכה תרגום על ידי ניתוח הצפיפות של polysomes מבודד תאים או רקמות ^9,11-14. טכניקה זו היא הטובה ביותר (אם לא ייחודית) הגישה למדידת ייזום תרגום in vivo. הוא משמש כדי לפקח על מצב translational של גידול תאים בתא מחזור ^15, וכדי להעריך את ההשפעות של סוגים שונים של לחץ כוללים זיהומים נגיפיים, היפוקסיה ^13,16, קרינה ^17, ותרופות כימיות ¹⁸ משמשים בטיפול, בייזום תרגום. עם זא...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Cells
HeLa תאי סרטן צוואר הרחם	אוסף תרביות מסוג אמריקאי (Manassas, VA; ATCC)	CCL-2
שניידר Drosophila תאים עובריים	אוסף תרביות מסוג אמריקאי (Manassas, VA; ATCC)	CRL-1963
מדיום תרבות ותוספי
מזון שניידר s Drosophila	סיגמא-אולדריץ'	SO146-500ml
DMEM	Life טכנולוגיות	11995-073
מדען FBS	פישר	SH30396-03
פניצילין/סטרפטומיצין	טכנולוגיות חיים	15140122
פתרונות סוכרוז
D-סוכרוז	מדען	פישר BP220-212
גליצרול	סיגמא-אולדריץ'	49767
ברומופנול כחול	פישר מדען	B3925
מאגר ליזה
Tris HCl	Fisher Scientist	BP153-500
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670-100G
NaCl	Tekniscience	3624-05
DTT	סיגמא-אולדריץ'	D 9779
Nonidet P40 (Igepal CA-630	MJS Biolynx	19628
SDS	Tekniscience	4095-02
מעכב RNase (מעכב ריבונוקלאז רקומביננטי RnaseOUT)	טכנולוגיות חיים	10777-019
נוגדי פרוטאזות (מלא, מיני, ללא EDTA)	רוש	11,836,170,001
מיצוי RNA
פרוטאינאז K	טכנולוגיות חיים	AM2542
פנול:כלורופורם	פישר מדען	BP1754I-400
כלורופורם	פישר מדען	C298-500
גליקוגן	טכנולוגיות חיים	10814-010
איזופרופנול	אקרוס אורגני	327270010
נוגדנים
נגד נוגדן FMRP	פורנייה et al., Cancer Cell International, 2010