ויזואליזציה של מתח G3BP גרגרי Dynamics בראשי תאים בשידור חי

סיכום

גרגרי מתח (SGS) הם גרגרי cytoplasmic RNA המכילים חלקיקים נתקע ribonucleoprotein (RNPs), וחשובים בתגובה תאית ללחצים שונים. דינמיקה של SGS יכולה להיות מיושמת בתאי חיים על ידי הדמיה הלוקליזציה של רכיב מתויג של SGS בתאים ראשוניים transfected אחרי המתח.

תקציר

ניתן דמיינו SGS בתאים על ידי immunostaining של מרכיבי חלבון מסוימים או הפולה + mRNAs. SGS הם מאוד דינמי והמחקר של ההרכבה וגורלם חשוב להבין התגובה התאית ללחץ. המחסור בגורמים מרכזיים של SGS כמו G3BP (חלבון קושר תחום RasGAP SH3) מוביל לפגמים התפתחותיים בעכברים ובשינויים של מערכת העצבים המרכזית. כדי ללמוד את הדינמיקה של SGS בתאים מאורגניזם, תאים ראשוניים ניתן תרבות ובצע את הלוקליזציה של transfected רכיב מתויג של SGS. אנו מתארים ניסוי הזמן לשגות להתבונן SGS המכיל G3BP1 בfibroblasts העכבר עוברי (MEFs). גם טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחקור SGS המכיל G3BP בנוירונים בשידור חי, שהוא חיוני כפי שהוצג לאחרונה כי SGS אלה נוצרים בהתפרצות של מחלות ניווניות כמו אלצהיימר. גישה זו יכולה להיות מותאמת לכל מרכיב גוף סלולארי וחלבון גרגר אחר, ובביצועעם בעלי חיים מהונדסים, המאפשר הלימוד החי של דינמיקת גרגרים למשל בהעדר גורם ספציפי של גרגרים אלה.

מבוא

גרגרי מתח (SGS) הם מוקדי cytoplasmic שאינם קרומיים נוצרו כתגובה מגן סלולרית ללחץ סביבתי, כגון טמפרטורה גבוהה, סטרס חמצוני, היפוקסיה, הלם אוסמוטי, קרינת UV, מניעת גלוקוז, או זיהום ויראלי ^1. הם יכולים להיגרם על ידי טיפול כימי עם תרכובות כמו arsenite נתרן, אשר מפעיל לחץ חמצוני. SGS לצבור ribonucleoprotein נתקעה תרגום נעצר שליח (mRNPs) קומפלקסים ^2, sequestering mRNAs ממכונות translational, וההרכבה שלהם יכולה להיות מופעלת על ידי זירחון של eIF2α (גורם ייזום אוקריוטים 2 α). SGS הם מבנים דינמיים אשר מחליפים רכיבים עם polysomes וגרגרים אחרים כמו P-הגופות. הם מהווים "מרכז מיון" שבו mRNAs מסודרים ומעובד או תרגום, reinitiation, השפלה, או אריזה לmRNPs הלא polysomal היציב ^3. ההרכבה של SGS היא ב מהירut זה תהליך הדרגתי עם אגרגטים קטנים רבים ראשוניים שלהתגבש לתוך גרגרים גדולים יותר. השימוש במעכבים כימיים המשבשים או לייצב microtubules מראה כי רשת microtubule נדרשת לדינמיקת SG כוללים תהליכי הרכבה, גיבוש ופירוק.

ההרכבה הדינמית של SGS גם מקודמת על ידי צבירה של חלבוני קושרי RNA ספציפיים (RNA-BP) כמו TIA-1 (T-cell פנימי אנטיגן-1) וTIAR (חלבון הקשורים ל-TIA-1), אשר מסוגל dimerize ולקדם polysome פירוק והניתוב של mRNAs ^ל4 SGS. G3BP (חלבון RasGAP SH3 תחום מחייב) הוא RNA-BP כזה שמתאים לSGS כאשר תאים הדגישו עם arsenite או טמפרטורה גבוהה, וביטוי יתר של G3BP dephosphorylated יכול לגרום להרכבת SGS ^5.

G3BP הוא RNA-BP אבולוציונית שימור שהיה בתחילה אפיין דרך האינטראקציה שלו עם חלבון הפעלת ראס-GTPase (RasGAP p120 ^6); אך אינטראקציה זו הייתה לאחרונה וביקרה ^7. משפחת G3BP כוללת שני חברים ביונקים, G3BP1 (המכונה G3BP) וG3BP2 ^8. שני חלבוני colocalize בSGS, כאשר תאים נחשפים למתח ^9. G3BPs מהווה תחום NTF2 N-מסוף הציע להשפיע על הלוקליזציה שלהם וoligomerization, ואחריו פרולין עשיר מוטיבים (PxxP), ולאחר מכן מוטיבים בטרמינל C-קשורים RNA מחייב: RNA-ההכרה המוטיב הקנונית (RRM) עם מוטיבים RNP1 וRNP2 שימור , ואחריו תיבת ארגינין-גליצין עשיר (RGG). מעניין לציין, כי הניתוח של חלקים שונים של החלבון על ידי בניית תחומים שונים התמזגו EGFP הראה כי תחום כמו NTF2 ותחום המחייב-RNA היו מגויס באופן יעיל ביותר לSGS, המצביע על חשיבותם של המאפיינים של dimerization ו-RNA מחייב ב ההרכבה של SGS. מודלים מגוונים חשפו פונקציות שונות של חלבוני G3BP במבחנה ^10-13.שיבוש של G3BP בעכברים הראו את החשיבות של חלבון זה בגידול התפתחותית והישרדות ^14, כמו גם תפקיד חשוב לG3BP במערכת העצבים המרכזית (CNS), המתאפיינת באטקסיה וליקויים בזיכרון עבודה המרחבי ^15. מחסור G3BP מוביל להומאוסטזיס פלסטיות עצבי וסידן שהשתנה, הקמת קשר ישיר בין היווצרות SG ומחלות ניווניות ^15. זה כן חשוב להיות מסוגל ללמוד את הדינמיקה של SGS בתאים ראשוניים כמו תאי עצב.

פרוטוקול זה מספק דרך פשוטה לבחון את ההרכבה של SGS המכיל G3BP1 בתאים ראשוניים תחת טיפול arsenite. זה יכול לשמש כדי לחקור הרכבה SGS בתנאים שונים, לדוגמא סוגים שונים של לחצים. זה גם יכול להיות מותאם לגרגירים או מרכיבים אחרים אחרים של SGS. ואכן, בפרוטוקול זה מתמקד בG3BP1, אבל יש סמני גרגרי מתח אחרים כמו TIA-1 / R, TTP (tristetraprolin) ^2,FMRP (פיגור שחלבון ה-X שביר תסמונת נפשית) ^16, (חלבון קושר DNA תגובת transactive 43) TDP-43 ¹⁷ או Staufen ^18. בפרט, חלבונים כמו TIA-1 / R הם, כמו G3BP, nucleating חלבוני RNA מחייבים שיכול לגרום להרכבת SGS כאשר ביטוי יתר, גם אם SGS נוצר השונים יכול להיות שונה בתפקוד, ויסות ותמלילים כרוכים בכך. Transfection של גרסה מתויג fluorophore של כל אחד מהמרכיבים המרכזיים אלה או nucleators של SGS יכול להתבצע להרכבת תמונה מסוימת SGS ודינמיקה.

פרוטוקול

כל הליכי בעלי החיים בפרוטוקול זה הם בהקפדה עם ההנחיות של הוראת מועצת הקהילה האירופית של 24 נובמבר 1986 (86-609/EEC). בית העכברים בקבוצה, המאפשרים כרצונך מודעת מזון ומים. לשמור אותם בסביבה מבוקרת (C ° 22 ± 1, ± 55 לחות 5%) עם שעות 12: שעות אור 12: מחזור כהה (אור על שעת 7:00 בבוקר).

1 תרבות של תאי Murine ראשיים:. Fibroblasts העכבר עוברי (MEFs)

1. החיטוי מלקחיים דקים, כמו גם מלקחיים מעוקלים ולנתח מספריים. לאחסן במכל סטרילי. השתמש D-PBS סטרילי (פוספט שנאגר מלוח של Dulbecco). להכין מדיום MEFs מלא: בינוני הנשר שונה Dulbecco (DMEM) / F12 בתוספת 10% עוברי עגל בסרום (FBS), 1 מ"מ L-גלוטמין, פירובט נתרן 1 מ"מ, חומצות אמינו לא חיוני 1%, ו0.5 מ"מ 2-mercaptoethanol וחם על 37 ° C.
2. להרדים עכבר בהריון (ב13.5 ימים לאחר coïtum-(DPC)) על ידי נקע בצוואר הרחם. הסר את קרן הרחם מהעכבר מחוטא עם 90% EtOH. מתחת למכסת מנוע סטרילית ונקי, הניחו את הקרניים עם העוברים ב37 ° C prewarmed D-PBS. פתח את הקרניים, המקום העוברים בצלחת פלסטיק סטרילי 100 מ"מ פטרי, לנקות אותם מחומר חבל הטבור ולשטוף אותם עם D-PBS החם כדי להסיר את עודפי דם. תחת משקפת, להסיר גפיים של העובר, האיברים הפנימיים ו את החלק העליון של הראש המכיל את המוח.
3. בצלחת פטרי חדשה, ברר עוברים לחתיכות קטנות מאוד עם סטרילי כירורגים להב או מספריים (לפחות 1 דקות). במקרה של עוברים של גנוטיפים שונים, להיות זהיר לשים כל עובר בצלחות פטרי פרט ולשמור על הזנב או עליון הראש לגנוטיפ.
4. כסה את העובר עם 1x טריפסין-EDTA (טריפסין 0.25%, 1 mM EDTA). דגירה במשך 30 דקות עד 1 שעה ב37 מעלות צלזיוס חממה. הוסף 10 מיליליטר של שלםבינוני MEFs לעצור תגובת טריפסין. Pipet מעלה ומטה כדי להסיר את כל אגרגטים. בואו לשבת ההשעיה התא לתוך צינור מיליליטר 50 (מלא בינוני מלא) עבור 10 דקות, ו צנטריפוגות supernatant במשך 5 דקות ב300 XG בטמפרטורת חדר. Resuspend את הכדור במדיום מלא (6 מיליליטר לעובר 1). ניתן לספור תאי בעלי גרעין קיימא באמצעות trypan כחול (ניתן לצפות מעובר אחד בסביבות 5 x 10 ⁶ תאים). צלחת 3 מיליליטר ל60 מ"מ צלחת פטרי.
5. לשנות את המדיום למחרת ו מאפשר לתאים לגדול עד המנות ומחוברות. רבים ניתן לראות סוגי תאים, אבל רק fibroblasts ישרוד תת.
6. לפצל את התאים ולאפשר להם לגדול ב35 מנות מ"מ עם תחתית זכוכית (חשובה לניסוי זמן לשגות), עד confluency 50-70% עבור transfection. מבחן לMycoplasma ופתוגנים עכבר.

2. תרבותdaptations במקרה של נוירונים

1. היום לפני התרבות, צלחות פטרי זכוכית תחתונה מ"מ מעיל 35 עם פולי-L-ליזין (200 μl של 0.1 מ"ג / מיליליטר) מתחת למכסת מנוע סטרילית ונקי, ולהשאיר למשך לילה.
2. בבוקר שלמחרת, לשטוף עם מים טהורים סטרילי, פעמיים למשך 5 דקות ופעם אחת עבור 45 דקות עד 1 שעה. החלף עם 2 מיליליטר של DMEM בתוספת 10% בינוניים FBS ולשמור בחממה 37 מעלות צלזיוס.
3. לנתח עוברים ב18.5 DPC. מתחת למכסת מנוע סטרילית ונקי, הנח את הקרניים עם העוברים בHBSS הקר סטרילי (תמיסת מלח מאוזנת של האנק) ב100 מ"מ צלחת פטרי. יכולים לשמש גם גורי ילודים במקום עוברים על מנת לשמור על חייו של הסכר ותאפשר לה לייצר יותר צאצאים, במיוחד במקרה של בעלי חיים מהונדסים שיכול להיות קשה להשיג. בצלחות פטרי אישיות, לקחת כל עובר או יילוד וחתך את ראשו במספריים. החזק את ראשו על ידי החדרת מלקחיים מעוקלים לתוך העיניים, לחתוך את העור ולפתוח בזהירות את הגולגולת הרכה מהחלק האחורישל הראש עד לעיניים, בכל צד של הראש. חותכים את עצבי ראייה ואת גזע המוח, להסיר את המוח, ושם אותו בצלחת פטרי המכילה HBSS חדשה. תחת stereoscope, להסיר את כל קרומי המוח באמצעות שני מלקחיים דקים. הפרד את hippocampi, קליפה או כל חלק אחר של המוח בהתאם למבנה ללימודים.
4. לטבול את מבנה המוח גזור ב4.5 מיליליטר של HBSS הקר שהוכן קודם לכן ב15 צינורות מיליליטר ולשמור על קרח עד לעיכול עם טריפסין. הוסף 0.5 מיליליטר של טריפסין 2.5% ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ל20 דקות. יש לשטוף 3x טריפסין עם HBSS, להיות זהיר מאוד שלא להשליך את חלקי המוח מתעכלים.
5. Resuspend ב 500 μl (היפוקמפוס) ל 1 מיליליטר DMEM (קליפת המוח) בתוספת 10% FBS ו pipet מעלה ומטה מספר פעמים עם micropipette מיליליטר 1 מצויד עם טיפ 1 מיליליטר, ולאחר מכן מצויד עם 1 מיליליטר בתוספת 200 טיפים μl, עד שלא יהיה ללא צבירה גלויה.
6. הפץ 100-200 μl של השעיה תא לכל botto זכוכית 35 מ"ממנה מ 'המכילה DMEM בתוספת 10% FBS ולתת נוירונים לדבוק ב37 מעלות צלזיוס למשך לפחות 3 שעות. החלף על ידי בינוני מלא נוירון prewarmed (הבינוני Neurobasal בתוספת 250 מיקרומטר L-גלוטמין וNS21, שהוכן כפי שמתואר בחן et al. ¹⁹⁾ ולהשאיר על 37 ° C כדי לאפשר צמיחה עצבית. Transfect נוירונים ב5-14 ימים במבחנה (DIV) (היעילות של transfection היא גבוהה יותר אחרי כמה קשרים סינפטיים div אבל הם טובים יותר הוקמו 7-10 div).

3. Transfection של Construct EGFP-G3BP1

Transfect התאים עם וקטור המכיל cDNA של חלבון עניין שלך (כל רכיב של SGS) התמזגו סמן פלואורסצנטי (GFP, YFP, וכו '), באמצעות 3 מיקרוגרם של פלסמיד מטוהר ל35 מנה מ"מ.

1. Transfect MEFs בשיטה מסחרית, בעקבות הפרוטוקול של היצרן (ראה טבלה של חומרים / ריאגנטים).
2. Transfect נוירונים עם סידןשיטת פוספט הותאמה מ שיה ואח' ²⁰ בקצרה.:
   1. הכן את הפתרונות: DMEM שטיפה: DMEM המכיל 25 מ"מ KCl; פתרון transfection: DMEM שטיפה המכילה 1x DMKY (HEPES 5 מ"מ, MgCl ₂ 10 מ"מ, פנול אדום); ופתרון הלם: HeBS 1x, DMKY 1x, וDMSO 2% (v / v); ולשמור אותם על 37 ° C.
   2. הסר את המדיה מהנוירונים, התסנין, ולשמור אותו על 37 ° C. לשטוף עם DMEM לשטוף לאחר מכן להחליף עם מדיום transfection ולשמור על 37 מעלות צלזיוס במהלך תקופת ההכנה של משקעים DNA פוספט-פלסמיד סידן.
   3. בצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר, להוסיף (לפי סדר זה) מים בראון (μl 50 הנפח סופי), 5 μl של CaCl ₂ 2.5 M, ו3 מיקרוגרם של ה-DNA פלסמיד. ירידה זו תערובת על גבי 50 μl של HeBS 2x כבר הציג בצינור פוליפרופילן תחתית עגול. מערבבים את הצינור על ידי סיבוב יחד עם השחרור. בואו צורת המשקע בטמפרטורת חדר במשך 30 דקות.
   4. הוסף את precipitatדואר dropwise על גבי תאי העצב ולהשאיר על 37 מעלות צלזיוס במהלך 30-50 דקות.
   5. החלף עם פתרון הלם דקות 1, ולאחר מכן לשטוף עם DMEM לשטוף וסופו של דבר להחזיר את מדיום preconditioned. שמור את התאים על 37 ° C.

4. ויזואליזציה של G3BP מכילה SGS הרכבה וDynamics

1. החלף את המדיום של התאים המכיל פנול אדום על ידי אדום בינוני ללא פנול.
2. השתמש במיקרוסקופ confocal מצויד בקרינה עבור הרכישות. הפעל את מערכות מיקרוסקופ: מנורת כספית, מחשב, ולייזרים. לחמם את החדר ל37 מעלות צלזיוס לפחות 20 דקות לפני תחילת הרכישות.
3. ביטוי היתר של G3BP גורם להיווצרות הספונטנית של סוג של SGS. התאים עשויים כך שנצפו להרכבה של SGS 24 תקין שעות לאחר transfection ללא אינדוקציה לחץ. לחלופין, לחץ יכול להיגרם כדי לגרום להרכבה של SGS נוסף. הוספת arsenite נתרן 0.5 מ"מ וכוכבt הרכישה מייד לאחר התוספת של המתחם (גרגרים יוקמו גם בתוך שעה 1).
4. להוסיף שמן למטרת הטבילה (להשתמש 40X או 63X מטרות) ולהתקין צלחת פטרי על המטרה בבעל מיקרוסקופ 35 מ"מ המותאם, התייצב על בעל הבמה. בדוק שהצלחת שטוחה אחרת הרכישות יהיו שונה. להדליק את אור הקרינה פי fluorophore הרלוונטי ולדמיין תאי transfected. כבה את הקרינה פעם בתא של עניין הוא בתחום על מנת למזער הלבנת וcytotoxicity.
5. בכרטיסייה "לרכוש", בחר בלייזרים בהתאם לגל העירור של fluorophore התג (488 ננומטר בפרוטוקול שלנו אשר משתמש G3BP מתויג-EGFP) ובחר את האורך המותאם פליטה לPMT (צינור מכפיל). להתאים את כוח הלייזר (בדרך כלל לא יותר מ -10%) כדי למזער את הרעש וoversaturation כמו גם רעיל, ולהגדיר את הרווח לקזז כדי לשנות את יחס האות לרעש.סריקה מהירה (1,000 הרץ) על מנת לצמצם את משך הזמן של אקספוזיציה לייזר (קו ממוצע 2, ממוצע פריים 1). אם תרצה, להגדיר את הפרמטרים למחסנית Z כדי להיות מסוגלים לשחזר את התמונה ב-3D (צעד Z של 1 מיקרומטר הוא בדרך כלל בסדר עם תאים). לקבוע את מרווח הזמן בין כל רכישה: מרווחים קטנים יותר נאפשר להשיג סרט קוהרנטית יותר, אבל זה עשוי לגרום photobleaching ורעילות (מרווח של 20 שניות היה בשימוש בניסויים שתוארו). משך הרכישה כוללת עשוי להשתנות בהתאם לסוג הלחץ. SGS המכיל G3BP רבים נוצרים בקצב מהיר מאוד תחת טיפול arsenite והם גם נראים לעין לאחר 1 שעות של טיפול: במקרה זה, לבחור במהירות תאים לסרט ולהתחיל את הרכישות מייד אחרי המתח, עם משך זמן כולל של רכישות של 15 - 20 דקות במידה רבה מספיק כדי לבחון את ההרכבה של כמה SGS.
6. שמור את התמונות ולשחזר את הערימות וסרט באמצעות תוכנת ImageJ.

תוצאות

היווצרות גרגר מתח היא חשובה בתגובה של תאים ללחץ, ומאפשרת הסתגלות סלולרית עם תרגום נתקע, עד שהלחץ יש לו פינה, הקשורים למניעת מות תאים מתוכנת. היתרי assay זה ללמוד את SGS בתאים ראשוניים, על ידי ביצוע הלוקליזציה של מרכיבי חלבון SGS המרכזיים (איור 1). G3BP, גורם מפתח של ההרכבה SGS, הוא בהווה ולא diffusively בציטופלסמה של MEFs או נוירונים (איור 2 א וג) בתרבית, והוא בבירור נוכחים בגרגרים בדידים תחת טיפול arsenite בMEFs כמו גם 2A הנוירונ...

דיון

השלבים הקריטיים ביותר בדאגת פרוטוקול transfection ועוד במיוחד רכישות הזמן לשגות, שצריך להיות במעקב צמוד על מנת להפחית את cytotoxicity.

תרבות של תאים ראשוניים היא לא חלק קשה, כל עוד תנאים סטריליים נשמרים והזהירות לנקוט על מנת למנוע נזק במהלך שלבי הנתיחה ותא דיסוציאציה. MEFs יכול להישמר קפוא במעברים מוקדם. transfection Neuron עם סידן זרחה הוכח לעבוד גם ²¹ ופרוטוקול זה הותאם מ שיה ואח'. ^...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
DMEM/F12	Gibco	21331	חימום מוקדם ב-37 מעלות; C
נתרן פירובט	גיבקו	11360
חומצות אמינו לא חיוניות	גיבקו	11140
L-גלוטמין	גיבקו	25030
טריפסין	גיבקו	15096
תחתית זכוכית B-35	גריינר	627860/627861	מטופל או לא (מטופל: מגביר את ההתקשרות של תאים נצמדים)
פולי-ליזין	Sigma-Aldrich	P2636
DMEM	Gibco	31966	חימום מוקדם ב-37 מעלות; C
HeBS	Sigma-Aldrich	51558
Neurobasal	Gibco	21103	חימום מוקדם ב-37 מעלות; C
2-מרקפטואתנול	Gibco	31350
מלקחיים	Biotek	DU-110-A	דק מאוד, טיפים 0.1 מ"מ (שימושי להסרת קרומי המוח)
מלקחיים מעוקלים	Biotek	P-110-BUF	דק מאוד, טיפים 0.1 מ"מ
מספריים קטנים	Biotek	CM-85-BS	יכול להיות שימושי להסרת היפוקמפוס
Polyplus transfection מגיב JetPEI	Ozyme	101-10	MEFs, עקוב אחר הפרוטוקול קדימה
מיקרוסקופ קונפוקלי סריקת לייזר הפוך	Leica	SP5

טרנספקציה של