A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

ביצה בתולעת assay (EIW) הוא שיטה יעילה לכמת-הטלת התנהגות. שינויים בנחת ביצה יכולים להיות תגובה התנהגותית של האורגניזם המודל<em> Elegans Caenorhabditis</em> לחומרים מזיקים סביבתיים כגון אלה המיוצרים על ידי חיידקים פתוגניים.

Abstract

התנהגות הטלת ביצי סי אלגנס מושפעת רמזים סביבתיים כגון osmolarity ¹ ורטט ^2. בהיעדר המוחלט של מזון ג elegans גם יחדל הטלת ביצים ולשמר את ביציות מופרות ברחם ³ שלהם. עם זאת, ההשפעה של מקורות שונים של מזון, בעיקר חיידקים פתוגניים ובעיקר אנטרוקוקוס faecalis, על התנהגות הטלת ביצים לא מאופיינת היטב. ביצה בתולעת assay (EIW) הוא כלי שימושי כדי לכמת את ההשפעות של סוגים שונים של חיידקים, במקרה זה א faecalis, על התנהגות הטלת ביצים.

מבחני EIW כרוכים לספור את מספר הביצים נשמרים ברחם של ג elegans ^4. Assay EIW כרוך הלבנת מבוימת, הרה המבוגר ג elegans כדי להסיר את העור המת ולהפריד את ביצי עודפים מבעלי החיים. לפני הלבנת, תולעים חשופים לחיידקים (או כל סוג של אות סביבתית) לתקופה קצובה של זמן. אחרי הלבנה, אחד היא בקלות רבה תוכל לספור את מספר ביצי עודפים בתוך הרחם של התולעים. ב assay זה, גידול בשייר כימות ביצה לאחר E. ניתן למדוד את חשיפת faecalis בקלות. Assay assay EIW הוא התנהגות שעשויה לשמש מסך לפוטנציאל חיידקים פתוגניים או הנוכחות של רעלים סביבתיים. בנוסף, assay EIW עשוי להיות כלי למסך לתרופות המשפיעות על נוירוטרנסמיטר איתות מאז התנהגות הטלת ביצים היא מווסתת על ידי נוירוטרנסמיטרים כגון סרוטונין ואצטילכולין ^5-9.

Introduction

Caenorhabditis elegans, תולעת עגולה מיקרוסקופית, נטול חיים, היא אורגניזם מודל משמש באופן מסורתי כדי ללמוד תהליכים התפתחותיים ואיתות תא בגלל האנטומיה שלו שקופה, הפיתוח מאופיין היטב, מלא ברצף הגנום, דור בזמן הקצר, וההומולוגיה גנטית לבני אדם . לאחרונה, ג elegans הפך אורגניזם מודל בתחום הרעלים סביבתיים ומולדת חסינות ^{10, 11.}

תולעי hermaphroditic דישון עצמי האלה הפכו לבגרות מינית בתוך שנים עד שלושה ימים מיום הבקיעה מן הביצה. במהלך מחזור החיים שלו, ג elegans עובר דרך ארבעה שלבי זחל (L1-L4), לפני שהגיע לבגרות. אחד המבודד אנדרוגינוס יכול לייצר, בממוצע, 300 צאצאים בתוך שלושה ימים של פוריות שיא. בreproductively הבוגר ג elegans הרמפרודיטים, ביצים מופרות נשמרות בתוך הרחם במשך כמה שעות לפני שהניחו.מספר הרגיל של ביצים מאוחסנות ברחם בכל זמן נתון (בשיא פוריות) הוא ¹² בין עשרה לחמש עשר. מספר הביצים ברחם הוא פונקציה של שניהם בקצב ייצור של ביצה והשיעור של הנחת ביצה. ביצים מופרות הם גורשו מן הרחם על ידי התכווצות שרירי פות של שישה עשר מסודרים סביב הפתיחה של הפות ^13. motorneurons הרמפרודיט הספציפי (HSN של) וסינפסה VC motorneurons על שרירי פות המשפיעים התכווצות שרירים ובכך הטלה התנהגות ^5,7,13,14. גירוש של ביצים מהרחם מתרחש עקב פעילות מתואמת של נוירונים ושרירים.

תרבויות מעבדה של ג elegans גדלים בדרך כלל בדיאטה של nonpathogenic חיידקי Escherichia OP50. בסביבה הטבעית, ג elegans בא במגע עם מגוון רחב של מקורות מזון, כגון חיידקים פתוגניים, שיכול להיות מזיק. בעת חשיפה לחומרים מזיקים בהסביבה, ג elegans לשמור על ביצים עד שהסביבה הופכת להיות חיובית יותר. יש להניח שימור ביצה זו הוא מאמץ כדי להגן על הצאצאים שלהם.

בביצה זה בתולעת (EIW) assay, ג elegans חשוף לחיידקים פתוגניים פוטנציאל, אנטרוקוקוס faecalis, שנמצא בסביבה. חשיפה לצורות פתוגניים של א ' faecalis יכול לגרום לדלקת מעיים מתמשכת ואף למוות בג elegans ^15. חשיפה לצורות אחרות של חיידקים פתוגניים הוכח להשפיע שימור ביצת ^16,17, עם זאת ההשפעה לא לכמת. בנוסף, ההשפעה של מתינות פתוגניים זנים של E. faecalis, זנים שאינם קטלניים באופן מיידי, על התנהגות הטלת ביצים לא נחקרו.

מבחני EIW כרוכים לספור את מספר הביצים נשמרים ברחם של ג elegans ^4. למרות שג elegansהם שקופים, ביצים מצטברות ברחם יכולות להיות קשים לכמת בבעלי חיים בשלמותה. Assay EIW כרוך הלבנת ההרה המבוגר ג elegans שנחשפו לחיידקים לתקופה קצובה של זמן. פתרון אקונומיקה ממסים את הציפורן החיצונית עוזב את הביצים מאחור. את הביצים הן שבירה להשפעות של אקונומיקה בשל הנוכחות של קליפת ביצה מגן. אחרי הלבנה, אחד היא בקלות רבה תוכל לספור את מספר הביצים ששוחררו מהרחם של התולעים על הלבנת.

Assay תאר הוא שיטה פשוטה וזולה, ומהירה לכמת את מספר הביצים ברחם בזמן אחד, ובכך לכמת את ההשפעות של א ' faecalis בשייר ביצה. assay זה יכול לשמש כדי לכמת את ההשפעה של סוגים אחרים של חיידקים, רעלים סביבתיים או תרופות בשייר ביצה. assay זה גם יש לו הפוטנציאל לשמש כמסך לpathogenicity חיידקים.

Protocol

1) הכנה של צמיחת מדיה נמטודות (NGM)

1. כדי להפוך את 50 צלחות, להוסיף 1.5 גרם NaCl, 8.5 אגר ultrapure גרם, וpeptone 1.25 גרם לLflask 1.
2. הוסף 487.5 מ"ל של DH ₂ O לבקבוק. מערבולת בעדינות לתערובת, ולכסות את הפתח של בקבוק עם פיסת נייר אלומיניום.
3. לעקר את הפתרון על ידי מעוקר ב תנאים סטנדרטיים (121 psi, 120 מעלות צלזיוס, 20 דקות).
4. אפשר הפתרון לקירור ל -45 מעלות צלזיוס באמבט מים.
5. לפתרון, להוסיף את הדברים הבאים לפי סדר: כולסטרול μl 500 ממיליליטר פתרון מניות (מומס באתנול) 5 מ"ג / 1, 500 מ 'μl CaCl _2, 500 1 ז μl MgSO _4, וחיץ ₄ 12.5 מיליליטר KPO (54.15 גרם KH PO ₄ ו17.8 גרם K ₂ HPO _{2 4} ב 500 מ"ל של DH ₂ O) כפי שמתואר ^ב18.
6. שימוש בטפטפות סטריליים, להוסיף 10 מ"ל של תמיסה אגר לכל צלחת פטרי קלקר 60 מ"מ. לאפשר לתקשורת כדי לחזק בovern טמפרטורת החדרight.

2) הכנת מרק א 'ב' coli מדיה

1. כדי לעשות חמש 100 מ"ל תרבויות, להוסיף 5.0 גרם של Bacto tryptone, 2.5 תמצית שמרים גרם, 5.0 גרם NaCl לכוס.
2. הוסף סטרילי מים, מזוקקים לנפח סופי של 500 מ"ל. מחממים את הפתרון על צלחת חמה, תוך כדי ערבוב, עד שהמומסים שנמסו.
3. יוצקים 100 מ"ל של מרק B לחמישה בקבוקי זכוכית (לפחות 200 מ"ל נפח).
4. לעקר את פתרונות על ידי מעוקר ב תנאים סטנדרטיים (121 psi, 120 ° C, 20 דקות).
5. הרשה B מרק להתקרר לטמפרטורת חדר לפני השימוש.

3) מתזמן ג צלחות תחזוקת elegans

1. לאחר שנתן לייבוש צלחות NGM בטמפרטורת חדר למשך שבוע אחד לפחות, לחסן תרבות מרק 100 מ"ל ב 'אחד עם כמה מושבות של א' coli (OP50).
2. לגדול E. תרבות coli על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
3. אחד או שתיים טיפות פיפטה (כ 10081; L) של OP50 תרבות על מרכז כל צלחת NGM. צלחות נערמים מכסה בצד בדרך כלל למעלה. כאשר pipetting (זריעה), להתחיל על ידי pipetting התרבות לצלחת בתחתית הערימה. דרך עבודה שלך כל ערימה. נסה לא לעבור את הצלחות לאחר זריעה, כי זה חשוב שהתרבות לא להתקרב מדי לשולי הצלחת.
4. אפשר צלחות זרע לייבוש בטמפרטורת חדר במשך שבוע אחד לפחות לפני השימוש.
5. צלחות זורעים מאוחסנות (הפוך) בכלי פלסטיק אטומים בטמפרטורת חדר.

4) שמירה על ג elegans זנים

1. כדי לשמור על מדושן ג מניות elegans, השתמשו תולעת לבחור לעבור שלוש L4s או מבוגרים הרה להולדת לחדשה, זורעי NGM צלחת כל 3-4 ימים.
2. צלחות חנות (הפוך) רצוי בתוך חממה ב 15-22 ° C. תרבויות במבחנים שתוארו היו מאוחסנות בטמפרטורה של 20 ° C. ג elegans פיתוח הוא טמפרטורה תלויה. כmaintenaNCE עולה טמפרטורה, זמן בין שלבי התפתחות יורד.

5) הכנת הסויה אגר (TSA) א 'tryptic faecalis תרבות מדיה

1. כדי להפוך את 50 צלחות, למדוד 500 מ"ל של מים סטריליים, מזוקקים לתוך בקבוק ומביא לרתיחה, תוך בחישה, על פלטה חמה.
2. הוסף 20 גרם של האבקה אגר TSA לבקבוק ולאפשר פתרון לפזר.
3. לעקר את פתרונות על ידי מעוקר ב תנאים סטנדרטיים (121 psi, 120 ° C, 20 דקות).
4. אפשר הפתרון לקירור ל -45 מעלות צלזיוס באמבט מים.
5. שימוש בטפטפות סטריליים, להוסיף 10 מ"ל של תמיסה אגר לכל צלחת פטרי קלקר 60 מ"מ. לאפשר לתקשורת כדי לחזק בטמפרטורת חדר למשך לילה.

6) הכנת מרק סויה א tryptic (TSB) faecalis תרבות מדיה

1. כדי להפוך 250 צינורות תרבות, למדוד 500 מ"ל של מים סטריליים, מזוקקים לתוך בקבוק וחם על פלטה חמה תוך כדי ערבוב. </li>
2. הוסף 15 גרם של אבקה אגר TSB לבקבוק ולאפשר את האבקה להמסה.
3. לעקר את פתרונות על ידי מעוקר ב תנאים סטנדרטיים (121 psi, 120 ° C, 20 דקות).
4. לאפשר פתרון ללהתקרר לטמפרטורת חדר, ולאחר מכן טפטפת לתוך 2 מ"ל, 5 מבחנות מ"ל סטרילי.

7) הכנה של מוח לב עירוי (BHI) מדיה, עם סטרפטומיצין, לE. תרבות faecalis

1. למדוד 500 מ"ל של מים סטריליים, מזוקקים לתוך בקבוק ומביא לרתיחה, תוך בחישה, על פלטה חמה.
2. הוסף 26 גרם של מדיום BHI לבקבוק ולאפשר הפתרון להמסה.
3. לעקר את פתרונות על ידי מעוקר ב תנאים סטנדרטיים (121 psi, 120 ° C, 20 דקות).
4. פתרון יאפשר לקירור ל -45 מעלות צלזיוס באמבט מים.
5. באמצעות טכניקה סטרילית, להוסיף 0.5 מ"ל של פתרון מניות סטרפטומיצין 10 מ"ג / מ"ל ​​ומערבולת לערבב.
6. הוסף 10 מ"ל של הפתרון לכל צלחת פטרי קלקר 60 מ"מ.
<li> תקשורת לביסוס בטמפרטורת חדר למשך לילה אפשר. צלחות חנות (הפוך) בשעת 4 ° C ועד כמה שעות לפני השימוש.

8) שמירה על E. זני faecalis

1. כדי לשמור על א מניות faecalis, השתמשו בלולאת סטרילי לפס בודדות על מושבות (TSA) אגר סויה נפרדת צלחות tryptic.
2. לגדול תרבויות על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. צלחות חנות (הפוך) בתיק או בקופסה אטום בטמפרטורת חדר במשך כמה שבועות.

9) הכנת א ' צלחות faecalis עבור assay EIW

1. לחסן תרבות 2 מיליליטר TSB עם מושבה של א ' faecalis ודגירת הלילה בשעה 37 ° C.
2. פיפטה μl 20 של א ' תרבות faecalis אל מרכז צלחת BHI, סטרפטומיצין מוכן, ודגירת הלילה בשעה 37 ° C.

10) הכנת א ' צלחות coli עבור assay EIW (לוחות בקרה)

1. לחסן B-100 מיליליטר אחתרבות ה עם מושבה של א ' coli OP50 ו דגירה הלילה על 37 מעלות צלזיוס
2. פיפטה μl 20 של תרבות OP50 אל מרכז צלחת NGM unseeded ולאפשר את צלחות זרע לייבוש בטמפרטורת חדר למשך לילה.

11) ביצה ב assay תולעת

1. פיק 15 – 20 מבוים-L4 ג elegans (איור 1) על גבי מרכז מדשאה של חיידקים על BHI סטרפטוקוקוס-E. מוכן faecalis צלחת. היזהר שלא להעביר הרבה OP50 לצלחת BHI. בחר את אותו המספר של L4s לשליטת NGM-OP50 צלחת.
2. דגירה צלחות עבור 40 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס
3. הכן את פתרון אקונומיקה 20%. מערבבים אקונומיקה מסחרית (6.0% נתרן היפוכלוריט) עם הנפח המתאים של מים מזוקקים.
4. הוסף 10 טיפות של μl פתרון אקונומיקה לעשרה מקומות שונים על מכסה פלסטיק (של תולעת או צלחת חיידקים).
5. באמצעות איסוף תולעת, תולעת להעביר אחד לכל טיפת אקונומיקה. מערבולת בעדינות את קצהלבחור בטיפת אקונומיקה כדי לוודא את התולעת יש לשטוף בסוף בחרו (לאשר על ידי הצגת אגל תחת מיקרוסקופ לנתח).
6. לאפשר לציפורן לפזר לכ -10 דקות או עד התולעים נפתחו בסערה, לגרש את הביצים (איור 2). היזהר שלא להעביר את הביצים מהצלחת.
7. באמצעות מיקרוסקופ לנתח, לספור את הביצים בכל טיפה של אקונומיקה.

Representative Results

Discussion

השלבים הקריטיים ביותר בביצוע assay זה בהצלחה הם: 1) באמצעות מניות מדושנות של ג elegans, 2) culturing סוגים בודדים של חיידקים בצלחת assay, 3) זיהוי מדויק מבוים L4 תולעים לחשיפה לE. faecalis, 4) שמירה על זמן החשיפה לE. faecalis עקבי בכל הניסויים ו 5) הלבנת זמן שלא יעלה על עשר דקות כדי למנוע התפוררות ביצה.

עבור assay זה חשוב להרים תולעים בריאים, מדושנים. הרעבה מצד האם יכולה להשפיע על פוריות וצמיחה של צאצאים ^19,20, ולכן חשוב שתולעים כבר ניזונים היטב במשך כמה דורות לפני ביצוע assay זה. מניית מדושנת של תולעים נשמר בקלות פשוט על ידי העברה כמה תולעים בוגרות לצלחת NGM seeded חדשה כל 2-3 ימים. יומיים לפני assay, תולעים בוגרות צריכים להיות ממוקמים על דשא טרי של OP50 כדי שיהיו צאצאי L4 מספיקים זמינים עבור assay.

<כיתת p = "jove_content"> כמו כן, חשוב שצלחות assay EIW לקדם את הצמיחה של רק סוג אחד של חיידקים. א זני faecalis גדלו על צלחות BHI. סטרפטומיצין התווסף לצלחות כדי לבחור נגד א ' coli OP50, אשר הועבר עם L4 תולעים כפי שהם מועברים מצלחות NGM תחזוקה לצלחות assay. OP50 גם גדל על צלחות BHI. אם לא נבחר נגד, ג elegans היה מאכיל בשני סוגים של חיידקים (E. coli וא 'faecalis) ואילו על צלחות BHI. הזנים של E. faecalis משמש assay זה עמידים בפני סטרפטומיצין. אם סוגים שונים של חיידקים ששימשו לassay זה, אנטיביוטיקה שונה, ותקשורת בתרבות שונה אולי, יש להשתמש כדי לבחור עבור החיידקים של בחירה ונגד א ' coli OP50.

בחירה מדויקת מבוימת תולעים לassay זה היא קריטי מכמה סיבות. ראשית, חשוב לספור שימור ביצה במהלך t הזמן הוא של ייצור ביצים / הנחת בג דישון עצמי elegans. ייצור ביצים מתרחש רק במהלך חמישה הימים הראשונים של ג הבגרות elegans (שהגיע לשיא סביב 40 שעות לאחר L4) ולאחר מכן במהירות יורדת ^4,21. תולעים בוגרות גרות בממוצע של שבועות עד שלושה שבועות, תולעים בוגרות רבות כל כך לחיות במשך שבוע לפחות ואילו אינו מייצרות ביציות מופרות. לכן, חשוב לוודא כי assay EIW אינו מבוצע על תולעים בוגרות unstaged גיל לא ידוע.

הסיבה השנייה חשוב להשתמש בבעלי חיים במבוימים assay EIW הוא כל כך שהזמן בפיתוח שבה היו חשופים לתולעים את החיידקים, רעל או תרופה לפיקוח הדוק. תרבויות של ג elegans מסונכרן בדרך כלל בביצה, L1 או L4 שלבים. שלב L4 שימש לassay זה בגלל החשש שחשיפה ארוכה יותר לE. faecalis יביא קטלני לפני תולעים הפכו מבוגרים הרה להולדת.

האוהל "> משך זמן תולעים נשארים בתמיסת כלור הוא גם חשוב כדי לפקח. תולעים בדרך כלל צריך לפזר בפחות מעשר דקות, אם כי פעם זה משתנה מתולעת לתולעת. ביצים מופרות סופו של דבר התפרקו על ידי אקונומיקה, אבל התהליך הוא איטי יותר מאשר לציפורן בשל הנוכחות של קליפת ביצה מגן. קליפת הביצה תתחיל להיות מומסת על ידי אקונומיקה, אם נשאר בפתרון ליותר מ 10-15 דקות.

שימור ביצה משקף את האיזון בין ייצור ביצים ונחת ביצה. Assay EIW לבד אינו מבחין בין מספר ביצי עודפים ברחם הוא עקב שינויים בייצור ביצים, או הנחת ביצה. הדבר נכון במיוחד אם חשש תולעים שטופלו בזן חיידקים או רעלן לשמר פחות ביצים מאלו בקבוצת הביקורת. במקרים אלה במיוחד, צריך להיעשות assay גודל להרהר מעקב. מבחני גודל Brood לכמת את מספר הביצים שהונחו מעל ⁴ החיים הרבייה של התולעת </sup>. אם גודל הגוזלים של תולעים בקבוצות הניסוי ובקרה זהה, ולאחר מכן ניתן לייחס הבדלים בשייר ביצה להבדלים בנחת ביצת התנהגות. מאחר שלא סביר כי זני חיידקים פתוגניים מעטה כמו א ' faecalis יפעל להגדלת ייצור ביצים, סביר להניח שגידול בשייר ביצה לאחר החשיפה לE. faecalis (כפי שניתן לראות באיור 3) הוא תוצאה של ירידה בהתנהגות הטלת ביצים.

Assay EIW גם אינו קובע את המנגנון שבאמצעותו חיידקים עשויים לשנות שימור ביצה. יתכן כי ג elegans עשוי לשמור ביצים משום שהחיידקים פתוגניים משפיעים האכלה על ידי מיישב ובחוסם את פתח הפה או משום שהוא מקור מזון ירוד. ייתכן גם כי החיידקים עשויים ליישב ולחסום את הפתח הפות, או להשפיע על התפקוד של תאים במערכת הטלת ביצים. ניתוח נוסף נדרש על מנת לקבוע את המנגנון שבאמצעות WHIשימור ביצת CH משתנה.

ניתן לשנות זאת בקלות EIW assay כדי לקבוע את ההשפעות של סוגים רבים של תרכובות בשייר ביצה. בנוסף, assay זה הוא די פשוט כי זה יכול להיות משולב בתוך מסך לזיהוי גנים, בכל שורה (סי אלגנס) או הפתוגן (E. faecalis), הנדרשת להשפעה של הפתוגן. Assay EIW יכול לשמש גם למסך לגנים הנדרשים להסדרת הטלה עצמו. ג התנהגות הטלת ביצי elegans היא מווסת על ידי נוירוטרנסמיטרים כגון סרוטונין ואצטילכולין ^5-9, ודורשת פעולה מתואמת של מספר תאי עצב וקבוצות שרירים ^12. מבחני EIW היו וימשיכו להיות בשימוש כדי לזהות גנים חשובים לאיתות העצבית ו / או פעילות שרירים. מבחני EIW לספק כמותית, ולא איכותי, ניתוח של ג חשוב elegans התנהגות.

Materials

Agar, ultrapure	Affymetrix	10906
Bacto Peptone	Becton Dickinson	211677
Bacto Tryptone	Becton Dickinson	211705
Brain Heart Infusion dehydrated medium	Carolina Biological Supply	781781
<em>C. elegans</em>, N2 strain	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
Cholesterol	Alfa Aesar	A11470
Culture plates for <em>C. elegans</em>	Tritech Research Inc.	T3308
Culture plates for <em>E. faecalis</em>	Fisher Scientific-Fisherbrand	875713
<em>E. coli </em>(OP50)	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
<em>E. faecalis</em> strains			provided by J. Middleton. All isolates were confirmed as enterococci
by observing growth on enterococcosel agar (BBL) and in 6% NaCl broth;
<p>all strains grew at 44.5 &ordm;C and were catalase negative and hydrolyzed esculin. A simplified&nbsp;<span style="line-height: 1.6em;">dichotomous key based on pigmentation and fermentation reactions for six sugars&nbsp;</span><span style="line-height: 1.6em;">(arabinose, mannitol, methyl-&alpha;-D-glucopyranoside (MGP), ribose, sorbose and sorbitol) allowed&nbsp;</span><span style="line-height: 1.6em;">presumptive identification of all <em>E</em>. <em>faecalis</em> strains (Efs lacks pigmentation and is arabinose, MGP&nbsp;</span><span style="line-height: 1.6em;">and sorbose negative and sorbitol, mannitol and ribose positive). All presumptive Efs strains&nbsp;</span><span style="line-height: 1.6em;">were confirmed using the API 20 STREP system (Biomerieux).</span></p>
Microscope	Motic	SMZ 168B	any microscope with transmitted illumination and 50X magnification should be sufficient
Streptomycin sulfate	Fisher BioReagents	BP910-50
Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar Medium), Difco	Becton Dickinson	236950
Trypticase Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium), BBL	Becton Dickinson	211768
Yeast extract	Acros	61180-1000