הפעלה ומדידה של NLRP3 Inflammasome פעילות באמצעות IL-1β בתאים דנדריטים נגזרות מונוציטים אדם

סיכום

תאים דנדריטים (DC) להפריש IL-1β בתגובה להכרה TLR8 של פורין הסינתטי, R848, ואחרי הפעלת inflammasome NLRP3 עם nigericin, ולכן, IL-1β יכולים לשמש למדידת פעילות inflammasome NLRP3. צביעה תאית ציטוקינים, immunoblotting, וELISA משמשים למדידת inflammasome NLRP3 תחול והפעלה באמצעות ביטוי IL-1β במדויק.

תקציר

תהליכים דלקתיים כתוצאה מההפרשה של אינטרלויקין (IL) -1 ציטוקינים על ידי תאי מערכת החיסון משפחה להוביל לדלקת מקומית או מערכתית, שיפוץ ותיקון רקמות, ושליטה virologic ^{1, 2.} אינטרלויקין 1β הוא מרכיב חיוני של תגובת החיסון המולדת ותורמים לחיסול פולש פתוגנים תוך מניעת הקמתה של זיהום המתמשך ^1-5.

Inflammasomes הוא פלטפורמת האיתות המרכזית להפעלה של אנזים אינטרלוקין 1 המרה (ICE או caspase-1). Inflammasome NLRP3 דורש לפחות שני אותות בDCs לגרום להפרשת IL-1β ^6. ביטוי חלבון Pro-IL-1β מוגבל ב נח תאים; לכן אות תחול נדרש לשעתוק IL-1β וביטוי חלבון. אות שנייה חשה ידי תוצאות NLRP3 בהיווצרות inflammasome NLRP3 חלבון רב. היכולת של תאים הדנדריטים לresponד לאותות הנדרשים להפרשת IL-1β ניתן לבדוק באמצעות פורין סינטטי, R848, אשר חש ידי TLR8 במונוציטים אדם נגזרים תאים דנדריטים (moDCs) לתאי ראש, ואחרי הפעלה של inflammasome NLRP3 עם רעלן החיידק ו ionophore אשלגן, nigericin.

DCs נגזר מונוציטים מיוצרים בקלות בתרבות ולספק יותר באופן משמעותי מאשר תאי DCs מיאלואידית האנושית מטוהר. השיטה המוצגת כאן שונה ממבחני inflammasome אחרים בכך שהוא משתמש באדם חוץ גופית, במקום עכבר נגזר, DCS ובכך מאפשר לחקר inflammasome במחלות וזיהומים אנושיים.

מבוא

הפעלה של מערכת חיסון מולדת נדרשת לנווט את התגובה חיסונית אדפטיבית במהלך זיהום, מחלה, וחיסון ^7. תאים הדנדריטים הם אנטיגן החזק ביותר הצגה בתאים של מערכת החיסון המולדת; הם מתמחים לספיגה של אנטיגנים, הגירה לבלוטות הלימפה, והפעלה של CD4 ⁺ נאיבי וcytolytic CD8 ⁺ T-תאי ^8-10. כדי לאפשר את גילוי פתוגן מהיר מערכת החיסון המולדת מנצלת קולטנים רבים germline מקודד זיהוי תבניות (PRR) שיכירו מוטיבים נגזרו הפתוגן שימור או סמני מארח נגזר של מתח תא ונזק. אגרה כמו קולטנים (TLRs) הן קולטנים זיהוי תבניות קרום מחויבים שמזהים פתוגן phagocytized תאי מסוים הקשורים דפוסים מולקולריים (PAMPs) ודפוסים מולקולריים סכנה קשורה (damps). על ידי הנהון ניגוד כמו קולטנים (NLRs) הם cytosolic ולהגיב למגוון רחב של PAMPs וdamps. תהנהן כמו קולטנים מחדשלהציג קו הגנה שני נגד פתוגנים המפרים את תא שטח וPRRs endocytic. האינטראקציה של הפתוגן נגזר, או "סכנה" קשורה, גורמים עם ligands TLR וNLR מובילים למצב של התבגרות DC וכתוצאה מאינטראקצית DC גדלה עם תאים אחרים של מערכת חיסון וקידום של תא T והפעלת תא הרג טבעי ^11.

אינטרלויקין 1β הוא מרכיב חיוני של ההגנה המארחת נגד זיהום. בעת ההכרה של מיקרואורגניזם, ציטוקינים מעודדי דלקת מאוד, IL-1β, מופרש ופונקציות כמו attractant הכימותרפיה וactivator של תאי מערכת החיסון מולדים ובעלי כושר הסתגלות. בvivo IL-1β היא אחראית במידה רבה לתגובת השלב החריף, כולל חום וציטוקינים דלקתיים סינתזה ^12.

רוב NLRs מכיל תחום חוזר עשיר לאוצין מסוף C שהוא חשב לתפקד בחישת יגנד, תחום מרכזי נוקלאוטיד מחייב (נכט) שהוא important לoligomerization NLRP3, ותחום N מסוף מפעיל (PYD בNLRP3) שמתווך הולכים אותות למטרות במורד דרך אינטראקציות חלבון חלבון. חלבון NLRP3 מגדיר מורכב inflammasome הנחקר ביותר בעוצמה. חלבון זה הוא חבר של משפחת NLR ויש לו את היכולת ליצור חלבונים מורכבים מולקולרי רב מורכב מNLRP3, PYCARD חלבון מתאם (הידוע גם בASC), וקרח. עם הפעלת inflammasome PYCARD נקשר לתחומים מסוף NLRP3 N ומגייס ICE באמצעות הפעלת caspase ותחום גיוס תחומים (כרטיס). המרת אנזים אינטרלויקין 1 בתחילה נוצר כאב תסס מכיל מוטיב כרטיס בN-הסופית שלה. תוצאות היווצרות Inflammasome בהבאת שתי מולקולות ICE מספיק קרובה כדי לגרום להפעלת זירוזם. מורכב inflammasome הוא הכרחי להפעלת ICE ובכך מאפשרת לו להמיר-IL-1β פרו cytoplasmic להבשיל ציטוקינים.

הפרשה מוצלחת של IL-1β בDCs דורש חישה של שני אותות סכנה שונים ועצמאיים. ראשית, חישת TLR של PAMPs, damps, או ציטוקינים איתות (TNFα או IL-1β) גורמת להגברת ביטוי של ביטוי חלבון פרו IL-1β-cytoplasmic. שנייה, לעתים קרובות שונה, אות נדרשת להיווצרות מורכבת inflammasome במעלה הזרם של התבגרות ICE. Inflammasome כמה מגרה אותות כוללים רעלים נקבוביות קרום חיידק יוצרים (כגון nigericin), גבישי lysosomal שיבוש (כגון גבישי urate גלוטמט, MSU), וה-ATP תאי. המנגנון נגד הזרם המוביל לNLRP3 הפעלת inflammasome ידי מפעילים המגוונים אלה אינם ברור. מחקרים חוקרים במעלה הזרם איתות של היווצרות inflammasome מציע כי אירועים תאיים, כגון אינדוקציה של היפוקלמיה או מיני חמצן תגובתי (ROS) בעקיפין להפעיל inflammasome ^13-28.

בקרב המפעילים נגיפיים השונים של inflammasome NLRP3 היא שפעת, המספקת בOTH האות הראשונית ומשנית הנדרשת להפרשה IL-1β ^{3, 29-33.} באמצעות מודלים נוקאאוט NLRP3 עכבר נמצא כי הפרשת IL-1β בDCS היא NLRP3 תלויה ^32. בנוסף, עכברי נוקאאוט NLRP3 נמשכים פחות לויקוציטים לאתר של זיהום וחוו תמותה גבוהה יותר ^{2, 5.} שני מאמרים אחרונים מציעים מנגנון להפעלת inflammasome NLRP3 במהלך זיהום בנגיף שפעת; הראשון, תחול באמצעות הכרה של רנ"א הנגיפי על ידי TLR7 או TLR8 (תלוי בביטוי TLR של התא להגיב) או באמצעות חישה של חיידקי commensal ידי TLRs האחר כדי לגרום ביטוי פרו IL-1β-cytoplasmic, ואחריו אות שנייה, הפעלה של NLRP3 היווצרות inflammasome ידי חלבון ערוץ יון הנגיפי M2 ברשת טרנס גולג'י ^{33, 34.} בשלב האחרון, מפעילה של inflammasome NLRP3 מושגת על ידי הפרעה של יונית תאיים הסביבה המובילה לייצור ROS, שהוא, בפשטות, חש ידי NLPR3 כאות ליצירת inflammasome. עם זאת, המנגנון המדויק של מעלה זרם הפעלת inflammasome פעילות ICE במהלך זיהום שפעת עדיין אינו ברור.

עבודה זו מתארת ​​טכניקת ערך ללימוד inflammasome NLRP3 בmoDCs אדם שיכול לשמש כבסיס לחקירה נוספת של המסלול שבבסיס DC מבוסס הפרשת IL-1β בתגובה לקשירת TLR8 עם R848 ואחרי הפעלה של inflammasome ידי כן activator הידוע של NLRP3, nigericin. וריאציות של שיטה זו ניתן להשתמש בסוגי תאים אחרים, כולל, אך לא מוגבלת ל: מונוציטים, מקרופאגים, תת DC אחר, ותאי אפיתל.

פרוטוקול

הצהרת אתיקה: דגימות מחקר מתקבלות ומאוחסנות למחקר בהסכמה של תורמים. צריכה להיות מקודדות כל הדגימות או אנונימי לפני השימוש. פרוטוקול זה עוקב אחר הקווים המנחים של דירקטוריון סקירה המוסדית שלנו.

1. בידול של האדם מונוציטים דם ההיקפיים לתאים דנדריטים מונוציטים נגזרו.

הערה: מעילים באפי אדם משמשים כמקור של אדם תאי דם היקפי (PBMCs) והתקבלו ממרכז ניו יורק הדם (ניו יורק, ניו יורק). תורמי דם מתנדבים בריאים. ההליך של 5 הימים מתחיל בציפוי של תאים אנושיים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) על גבי תרבית רקמת צלוחיות ^35,36. הבדלים ראויים לציון מהפרוטוקולים שפורסמו הם כדלקמן:

1. השתמש 225 סנטימטר ² צלוחיות תרבית רקמת קלקר שאינו pyrogenic עם מכסה מסנן לדבוק כולל של 2x10 ⁸ PBMCs לכל בקבוק במקום צלחת תרבית רקמת 10 קלקר סנטימטרs (58 סנטימטר ²⁾ (שלב 1).
2. הכן תקשורת עם 5% בסרום אדם (PHS; 30 מיליליטר) ונקווה ב500 מיליליטר RPMI-1640 + L-גלוטמין, חיץ 5 מיליליטר 1 M HEPES, ו1.4 מיליליטר 50 מ"ג / מיליליטר גנטמיצין (5% תקשורת PHS) ואחרי סינון דרך סינון 20 מיקרומטר. להוסיף סך של 50 מיליליטר 5% תקשורת PHS ל225 סנטימטר בקבוק תרבות ² רקמות.
3. שטוף תאים דבקים שלוש פעמים עם 25 מיליליטר RPMI-1640 טריים. לנער במרץ במשך 5 שניות בכל שטיפה ולשאוב תאים חסיד שאינם (שלב 4).
4. הוספת 190 μl של 400 IU / IL-4 ו380 μl μl של 100 IU / μl GM-CSF לכל בקבוק (שלב 3) ביום 0, 2, ו -4. יום 0 מוגדרת כPBMCs היום לראשונה מצופות בשלב 1 (שלב 8).
5. 5 moDCs יום קציר בריכוז של 1x10 ⁶ תאי מיליליטר / (שלב 15).
6. השתמש moDCs מייד במצב המנוחה שלהם. שלבי 17-22 הם מעולם לא ביצעו. הערה: דוגמאות צריכים להיות מעובד בהקדם האפשרי לאחר איסוף לתוצאות הטובות ביותר.
7. moDCs aliquot בריכוזtion של 2x10 ⁵ תאים / טוב (200 μl / טוב של 1x10 ⁶ תאים / מיליליטר) ב96 צלחת גם עגול תחתית (כתם מערבי, ELISA, FACS) או על גבי chamberslide פולי-L-ליזין שטופל (מיקרוסקופית) לניסויים . שים לב: יש לפחות 4 תנאים: (בקרה שלילית) לחלוטין unstimulated, תחול רק, הפעלה בלבד, ותחול אחרי הפעלה. ניתן להרחיב תנאים לכלול פקדי diluent לR848 וnigericin אם תרצה בכך. אם assay במורד הזרם הוא ICS, כפילויות נחוצות לפקדי אלוטיפ.

. 2 קרקע Inflammasome - 1 איתותים

1. מחדש R848 lyophilized בDMSO על פי הוראות היצרן. לדלל המניה עובדת ב RT עם RPMI-1640.
2. הוספת R848 בריכוז סופי 10 מיקרומטר לנכס בארות ל18 שעה. תאי מקום בחממה ב 37 ° C ו-CO ₂ של 5%.

3 הפעלת Inflammasome NLRP3 -. איתותים2

1. מחדש nigericin lyophilized באתנול על פי הוראות היצרן. לדלל המניה עובדת ב RT עם RPMI-1640 לפני הוספה לתנאים המתאימים.
2. הוספת nigericin בריכוז סופי 20 מיקרומטר ולחזור לחממה ב 37 ° C ו 5% CO ₂ למשך 6 שעות. אין שלבי כביסה להתרחש בין תחול ובמהלך ההפעלה. הערה: ההפרשה של IL-1β מוגברת על ידי הנוכחות של יונופורים סידן, brefeldin chlorophenylhydrazone, monensin, dinitrophenol, או ציאניד קרבוניל ^{37, 38.} לכן, תוספת של מעכבי הפרשה אלה אינן מומלצים בעת ניתוח תחול או פעילות inflammasome שכן הוא ישנה את ההפרשה של IL-1β.

4. אוסף דוגמאות IL-1SS

1. צנטריפוגה את הצלחת עם תאים וsupernatants ב974 XG במשך 3 דקות.
2. מבלי להפריע לתא גלולה, לשאוב supernatant ולהעביר כלeparate עגול עם תחתית צלחת על מנת למדוד את הפרשת ציטוקינים מsupernatants. הערה: Supernatants ניתן לאחסן באופן זמני ב -20 מעלות צלזיוס או -80 ° C עבור אחסון לטווח ארוך.
3. לשטוף את כדורים הסלולריים שלוש פעמים עם 200 μl של 1x PBS ב974 XG במשך 3 דקות כדי להסיר כל IL-1β תאיים מהדגימות הסלולריות. שים לב: כאשר שוטפים את כדורי תא מצלחת גם 96, להסיר לשטוף על ידי היפוך צלחת מהיר לפח אוסף, כדי לא להפריע לדוגמה.

5. מדידת IL-1SS מדוגמאות נייד וSupernatant

1. תאיים ציטוקין מכתים (ICS): פרוטוקול ICS מתואר להלן ^{39, 40.} שים לב: אין להשעות את התאים אם assay במורד הזרם הוא מיקרוסקופית. צריכים לעשות את כל הכביסות והשאיפות מבלי להפריע את שכבת תאים / גלולה (תלוי בassay במורד).
   1. הוספה של מדיה PHS 5% 100 μl לתוך בארות מתאימות. להוסיףנפח מתאים (כ 1 μl/2x10 ⁵ תאים, או μl 1 / טוב) של כותרתו fluorescently α-CD11c וα-CD14 (סמני פנוטיפ; שיבוט B-ly6 וMφP9, בהתאמה) או שליטת אלוטיפ התאים 10 דקות ב RT בחושך.
   2. לשטוף שלוש פעמים עם 1x PBS ב974 XG במשך 3 דקות.
   3. תקן את התאים על ידי הוספה של 4% PFA 100 μl עבור 20 דקות ב RT בחושך.
   4. השהה פוינט: לשטוף עם 100 PBS μl 1x ב974 XG במשך 3 דקות ולאחסן ב 4 ° CO / N ב 1x PBS.
   5. הוספה של חיץ permeabilization 100 μl לתאים ל30 דקות. הערה: חיץ permeabilization מורכב של 1x PBS עם 0.3% טריטון X-100, ו -1% אלבומין בסרום שור (BSA) לpermeabilization. נא לא להפריע תאים חסיד כאשר assay במורד הזרם הוא מיקרוסקופית.
   6. הוספת נפח מתאים ⁽⁵ תאים כ 62 antibody/2x10 ng, כ או 2.5 μl / טוב) של α-IL-1β-FITC (שיבוט 8516) או שליטת אלוטיפ עבורשעה 2 באינקובטור ב 37 ° C.
   7. שטוף תאים שלוש פעמים עם 200 μl של חיץ permeabilization ב974 XG במשך 3 דקות בחושך.
   8. אופציונאלי: כתם עם DAPI, להוסיף mountant, ומניח coverslip בעדינות על גבי שקופיות זכוכית. לאפשר mountant לרפא O / N לפני צילום תמונות במיקרוסקופ.
   9. לרכוש את הנתונים על ידי FACS או במיקרוסקופ. הערה: השווה את אלוטיפ עבור כל תנאי לצביעה המתאימה בעת ניתוח על ידי FACS או במיקרוסקופ.
      1. FACS: רוכשת את הדגימה אחת בכל פעם. הגדר את / שער SSC FSC בתאים חיים, ואחריו gating על CD11c ⁺ CD14 ^- תאים לפני ניתוח מכתים פרו-IL-1β אוכלוסיית moDC.
      2. מיקרוסקופית: הגדר את זמן החשיפה באמצעות מדגם מכתים החיובי - R848 שטופל. השתמש DAPI ⁺ פרו-IL-1β ⁺ וDAPI ⁺ פרו-IL-1β ^- כדי לקבוע אחוז פרו-IL-1β + moDCs להביע.
2. SDעמוד-S: immunoblotting מבוצע כדי לזהות פרו-IL-1β. הערה: הטכניקה המתוארת להלן משלבת טכניקה סטנדרטית immunoblotting, ג'ל polyacrylamide 4-20% שיפוע, וגילוי ניאון או chemiluminescent ^{41, 42.}
   1. תאי Lyse ישירות ב10 μl denaturing מאגר תמוגה (5 μl β-mercaptoethanol/950 חיץ מדגם μl Laemmli אחרי דילול 1:01 עם חיץ תמוגה תא). העבר את lysate ל1.5 צינורות מיליליטר Eppendorf.
   2. lysate חום על צלחת יבשה 10 דקות ב 100 ° C.
   3. ספין lysate ב20,800 XG על minicentrifuge דקות 1 לרכז את נפח הנוזל. השהה נקודה: אפשר להקפיא דגימות ב -20 ° C לאחסון לטווח קצר.
   4. טען את הנפח הכולל על ג'ל polyacrylamide. הפעל 140 V דרך תיבת ג'ל למשך כ 1 שעות, או עד שצבען מול בורח תחתית הג'ל.
   5. העבר את החלבון מן ג'ל polyacrylamide על membr PVDF Immobilon-FLane ל90 דקות ב100 V. בלוק הקרום עם BSA 5% בטריס בופר / 0.1% Tween-20 (TBS-T) במשך שעה 1. הערה: PVDF Immobilon-FL הוא הטוב ביותר לשימוש בזיהוי ניאון. קרום עם הרכב שונה מומלץ לטכניקות זיהוי אחרות כדי להגדיל את יחס האות לרקע.
   6. מדולל נוגדנים ראשוניים ומשניים ב10 מיליליטר של BSA 5% / TBS-T. בצע incubations נוגדן הראשוני על 4 מעלות CO / N תוך רעד ונוגדנים משני ב RT עבור שעה 1 ואילו רועדים.
   7. לשטוף את הממברנה 3 פעמים עם TBS-T במשך 5 דקות תוך כדי הטלטול בין incubations נוגדן הראשוני והמשני ושוב בין incubations והדמיה משני. הערה: ניתן לאתר להקות באמצעות ניאון או זיהוי chemiluminescent. עקוב אחר ההוראות של היצרן לצורך זיהוי.
3. ELISA: דוגמאות שהם קפואים לאחסון צריכה לאזן לRT לפני הניתוח. ספין למטה דגימות בצנטריפוגה כדי לגבש condens supernatantation. עקוב אחר ההוראות של היצרן למדידה של IL-1β. הערה: בפרוטוקול זה IL-1β נמדדים במיוחד; עם זאת, מדידה בו זמנית של TNFα, IL-6, וציטוקינים המערכת החיסונית IL-10 להבטיח את התנאים המתאימים היו דרוכים.

תוצאות

טכניקות אלה מודדים TLR8 תחול עם R848. מכתים ציטוקינים תאיים לפרו-IL-1β מאפשר למיקרוסקופיה וFACS קריאות מCD14 ^- CD11c ⁺ moDCs. ניתן לכמת את שני הטכניקות ביחס למי שאינו דרוך, או מנוחה, בקרת תא, כמו גם שליטת אלוטיפ (איורים 1 ו -2). אחוזים של תאים פרו-IL-1β ⁺ צביעה מוכפל בחציון הגיאומטרי של אוכלוסייה זו כדי לספק את עוצמת הניאון החציונית (MFI). MFI ניתן להשוות לסכום של Pro-IL-1β הווה בתאים מכתים החיוביים.

דיון

ציטוקינים דלקתיים הם חלק בלתי נפרד בהיגוי תגובת החיסון המולדת ובעלי כושר הסתגלות כדי להילחם בזיהום נגיפי. IL-1β מופרשים הוכח להגדיל בשפעת זיהום ^{3, 43, 44.} המנגנון המדויק שבאמצעותו ציטוקינים אלה מעובדים בתגובה להכרה נגיפית בתאים הדנדריטים אנושיים אינם מובנה במלואם. ערכות בידוד DC מיאלואידית יקרות וזמן רב. ערכות בידוד ומיון FAC שלא בכוונה אולי מתח או להפעיל את התאים. בנוסף, יש לעתים קרובות כמות מספקת של תאים מבודדים לניסויים. למרבה המזל, את הביולוגיה של אדם moDCs דגמים מק...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
IL-4	מו"פ D
GM-CSF	Genzyme	NDC 58468-0180-2	אנו רוכשים פריט זה דרך בית המרקחת המקומי שלנו עם מרשם
RPMI 1640 עם L-גלוטמין	Cellgro	10-040-CV
תאים חד-גרעיניים בדם היקפי	מרכז		הדם של ניו יורק PBMCs בודדו מדמם של תורמים בריאים
12 צלחות תרבית רקמות באר	Sigma-Aldrich	3516
96 לוחות תרבית רקמה תחתונה עגולים היטב	Sigma-Aldrich	3799
α-IL-1β-FITC	R& D	IC201F
FITC איזוטיפ בקרת	Miltenyi Biotec	130-092-213
α-β-tubulin	Santa Cruz	SC-9014
α-IL-1β	מו"פ D	mab201
PVDF Immobilon-FL ממברנה	Millipore	IPFL00010
שיפוע 4-12% ג'ל פוליקרילאמיד	Bio Rad	161-1159
Laemmli מאגר דגימה	Bio Rad	161-0737
BSA	Equitech Bio Inc		30% תמיסה סטרילית/מסוננת
PFA	מיקרוסקופיה אלקטרונית מדעי	15710	16% פתרון
ערכת מערך חרוזי ציטוקינים דלקתיים אנושיים	BD	551811
ניגריצין Invivogen		tlrl-nig
R848	3M Corp.
α-CD14	BD	340436
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250-10ML
TBS			באתר חדר מלאי
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287-100mL
Nunc EasYFlask 225 ס"מ2, מכסה מסנן, נפח עבודה 70 מ"ל, 30/Cs	Thermo מדעי	159933
20 μ M יחידות סינון חד פעמיות סטריליות	Thermo Scientific	569-0020
HEPES	Invitrogen	15630080
עז α-עכבר IRDye 800CW	Licor	926-32210
חמור &אלפא ארנב IRDye 680RD	Licor	926-68073
ספקטרה צבעוני סולם חלבון רחב טווח	Thermo Scientific	26634
טריס גליצין SDS 10x	ביו ראד	1610732
טריס גליצין 10x	ביו ראד	161-0734
מתנול - 4 ליטר	פישר סיינטיפיק	A433P-4
8 תאים תרבית רקמת כלי פוליסטירן מטופלת שקופית זכוכית	BD פלקון	354108
פולי-ליזין	סיגמא	P4707