הנדסת רקמות של גידול סטרומה Microenvironment עם בקשה לפלישת תאי הסרטן

Summary

מטריצה ​​מקורית המופק פיברובלסטים רקמה מהונדסות היא כלי המתעוררים ליצירת מצע סטרומה אשר תומך בהתפשטות תאי אפיתל ובידול. הנה פרוטוקול יישום מתודולוגיה זו כדי להעריך את ההשפעה של סוגי תאים שונים של סטרומה בביולוגיה של תא הסרטני מוצג.

Abstract

תרבויות organotypic 3D של תאי האפיתל במטריצה ​​משובצת עם תאי mesenchymal נמצאות בשימוש נרחב ללמוד התמיינות תאי אפיתל ופלישה. סוג הזנב של עכברוש אני קולגן ו / או מטריצה ​​שמקורם בתאי סרקומה עכבר Engelbreth-Holm-נחיל כבר מועסק באופן מסורתי כמצעים למודל המיקרו מטריקס או סטרומה שלתוכו תאי mesenchymal (בדרך כלל fibroblasts) מאוכלסים. למרות שניסויים באמצעות מטריצות כאלה הם מאוד אינפורמטיבי, ניתן לטעון כי בשל נוכחות מכרעת של חלבון יחיד (כמו בסוג אני קולגן) או תכולה גבוהה של רכיבי קרום במרתף וגורמי גדילה (כמו במטריקס נובע מעכבר תאי סרקומה), מצעים האלה לא הטובים ביותר משקפים את תרומתו להרכב מטריצה ​​שנעשתה על ידי תאי סטרומה בעצמם. ללמוד מטריצות ילידים המיוצרים על ידי fibroblasts עורי הראשוני בודד מחולים עם גידול הפרעת שלפוחיות גנטית (dystrophic נוטה, רצסיביולוזה epidermolysis), יש לנו להתאים פרוטוקול מטריצה ​​מקורי קיים ללמוד פלישת תא גידול. Fibroblasts מושר לייצר מטריצה ​​שלהם על פני תקופה ממושכת בתרבות. מטריצה ​​מקורית זה היא אז מנותק ממנת התרבות ותאי אפיתל הם זורעים על זה לפני כל coculture מועלה לממשק אוויר הנוזלי. בידול ו / או פלישה נייד אז ניתן להעריך לאורך זמן. טכניקה זו מספקת את היכולת להעריך אינטראקציות תא אפיתל-mesenchymal בסביבת 3D ללא הצורך במטריצה ​​סינתטית או זרה עם החסרון היחיד להיות תקופה הממושכת של זמן הנדרש כדי לייצר את המטריצה ​​המקורית. כאן אנו מתארים את היישום של טכניקה זו על מנת להעריך את יכולתה של מולקולה בודדת לידי ביטוי על ידי fibroblasts, סוג VII קולגן, כדי לעכב את הפלישה של תאים סרטניים.

Introduction

השימוש בחומר ביולוגי בתרבית רקמת 3D אפשר לחוקרים ללמוד על התנהגות תא במעבדה בתנאים פיסיולוגיים דומים יותר לסביבת in vivo מזה של אחד סכם עם הידבקות 2D ומצע פלסטיק. בפרט, צעדים גדולים קדימה נעשו בדוגמנות epithelia מרובדת עם האימוץ של שיטות תרבות 3D בממשק האוויר הנוזלי ^1-4. טכניקות כגון נאמנות לחקות בידול keratinocyte ופלישת תאים סרטניים המאפשרת גמישות רבה יותר ונאמנות לחוקרים לומדים תהליכים אלה. הבחירה של מצע ביולוגי לחקות את סביבת סטרומה הייתה כרוכה בעיקר השימוש בסוג אני קולגן, מטריקס סרקומה עכבר Engelbreth-Holm-הנחיל והדרמיס דה epidermized. לדוגמא, fibroblasts הסרטן קשור הוכחו לתרום לפלישת סרטן ^5, ייזום, והתקדמות באמצעות אינטראקציות סטרומה אפיתל ^6,7 when גדל במצעים כאלה.

תקן הזהב עבור מחקה את סביבת סטרומה בעור, האפיטל מרובדת הגדול ביותר והנחקר ביותר תוך שימוש בטכניקות כגון, נחשב להיות דה epidermized הדרמיס אנושי (DED). הכנת DED כוללת את ההסרה של האפידרמיס באמצעות trypsinization או התנערות פיזית ^מ3,4 עור גופת אדם. עם זאת, גישה לעור כזה יכול להיות קשה מאוד למעבדות אינן קשורות למוסדות קליניים, והדרמיס החולה הוא כמעט בלתי אפשרי להשגה. כחלופה, מעבדות לעתים קרובות להשתמש בשילוב של סוג אני קולגן (מבודד מזנבות עכברים) ו / או מטריצת סרקומה עכבר Engelbreth-Holm-נחיל.

לאחר הגילוי, בשנת 1927 Nageotte ⁸ קולגן שיכול בקלות להיות מבודד באמצעות חומצה אצטית ומשקעי מלח, היישום שלה לתרבית רקמה היה חלוץ לאחר מכן על ידי Huzelלה ולעמיתי ^9. ציפוי קולגן הוכיח שהוא עדיף על זכוכית לתרבית תאים של 29 זנים וexplants רקמות כנחקרו על ידי אהרמן ו ^-9 גיי. נכון לעכשיו, הסוג העיקרי של הקולגן המשמש בתרבית רקמה מבודד מגידי עכברוש זנב, והוא בדרך כלל קנה ממקורות מסחריים. עם זאת, החסרון לשחזור מצע נאמן הוא כי קולגן זנב החולדה אינו זהה לקולגן אנושי, או הדרמיס האנושי, שבו אני והסוג III collagens נמצאים כמרכיבים עיקריים, וקולגן זנב חולדה המבודד הוא תמיד מקוטע.

מטריקס סרקומה עכבר Engelbreth-Holm-נחיל הוא תערובת חלבונים דביקה מופרש על ידי תאי סרקומה העכבר בתרבית Engelbreth-Holm-נחיל ^10. המרכיבים העיקריים הם laminin, קולגן הסוג IV, proteoglycan סולפט הפרין, entactin וnidogen והיחסים של חלבונים אלה המדויקים ישתנו מיצוו כדי אצווה. מלבד פרו מבנייםteins, מטריצה ​​זו מכילה גם רמות משמעותיות של גורמי גדילה כגון הפיכת β גורם גדילה, גורם גדילה באפידרמיס, גורם גדילה דמוי אינסולין 1, גורם גדילה פיברובלסטים שור, ונגזר גורם גדילה של טסיות דם אשר היה לשנות את התנהגות ^11,12 סלולרית. והצביע לעבר המורכבות העצומה של מטריקס סרקומה עכבר Engelbreth-Holm-הנחיל, סך של 1,851 חלבונים זוהו במחקר proteomic האחרון ^13. לאור הטבע העשיר ומורכב של מטריצה ​​זו, זהירות כבר יעצה כאשר לפרש ומשווה ניסויים שונים עם השימוש בו ^11.

יש המעבדות שלנו עניין רב במחלות עור גנטיות, בעיקר אלו עם נטייה לפיתוח קרצינומה של תאים קשקשיים עורית (CSCC) ^14. במקרה של ולוזה רצסיבי epidermolysis dystrophic (RDEB), מחלה שלפוחיות חמורה עם מוטציות בתאי מין בגן COL7A1 15-17, יש לנו קבענו כי microenvironment עורי בחולים אלו הוא גידול קידום ^18. במהלך מחקר זה היינו להעריך את הגידול בקידום נכסים של fibroblasts עורי מוטבע בתוך מטריצת הקולגן סרקומה עכבר אני / Engelbreth-Holm-נחיל וחקר דרכים להערכת מטריקס הילידים, "התאים שלו. כדי להשיג זאת, אנו שונה בטכניקה קודמת מהמעבדה של לוסי ז'רמן עובד על עור אנושי ושווי ^19,20. הטכניקה של ז'רמן הצליחה לשחזר עור אנושי עם קרום במרתף מאורגן היטב באמצעות תרביות keratinocyte ופיברובלסטים האנושיים ראשוניות בהעדר פיגום סינטטי או מת.

עמ 'במאמר זה את הצעדים המשמשים לשחזר microenvironment עורית סטרומה גידול (מטריצה ​​מקורית) נגזרים באופן ישיר מfibroblasts סטרומה העיקרי במבחנה מתוארות ^18. מטריצות שפת אםroduced ידי תרבות לטווח הארוך של fibroblasts שמשו עורי שווה ערך לassay לפלישת תא CSCC. אנו מציגים נתונים באמצעות מטריצה ​​מקורית נגזרה משתי המטריצה ​​תאית מופרש על ידי fibroblasts RDEB (חסר בסוג VII קולגן (C7)) או מfibroblasts RDEB retrovirally transduced עם קולגן סוג VII להביע לבנות ולהדגים את ההשפעה העמוקה של קולגן יחיד על גידול תא פלישה.

Protocol

מחקר זה נערך בהתאם להצהרת עקרונות הלסינקי ואושרה על ידי ועדת האתיקה המתאימה.

1. הכנת מדיה וריאגנטים

1. הכנת 200x של מניית 2 פוספט L-חומצה אסקורבית
   1. ממיסים 29 מ"ג L-חומצה אסקורבית 2 פוספט לכל 5 מיליליטר של התמיסה השתנה Dulbecco בינוני של הנשר (DMEM) ולסנן דרך 0.22 מיקרומטר סינון הממברנה. חנות כaliquots סטרילי 0.25 מיליליטר ב-20 ° C.
   2. הוספת 0.25 מיליליטר aliquot של מניית 2 פוספט L-חומצה אסקורבית 200x לכל 50 מיליליטר של תקשורת פיברובלסטים (DMEM עם 1% L-גלוטמין ו10% בסרום שור עוברי) ביום הנדרש, לריכוז סופי של 0.1 מ"מ של L -חומצה אסקורבית 2 פוספט.
2. הכנה של תקשורת צמיחת keratinocyte
   1. בידוד והתרבות של קרטינוציטים SCC העיקריים תוארו בעבר ^21. הכנה של תקשורת צמיחת keratinocyte מתוארתבו גם כן.
   2. בקצרה, להכין את התקשורת באופן הבא:
      300 מיליליטר של DMEM ושל ה-F-12 של שינקין 100 מיליליטר בתוספת 10% FBS
      0.4 מ"ג / מיליליטר הידרוקורטיזון
      5 מ"ג / מיליליטר אינסולין
      10 ng / ml EGF
      5 מ"ג / מיליליטר transferrin
      8.4 ng / רעלן הכולרה מיליליטר
      13 ng / liothyronine מיליליטר
      פתרון פניצילין, סטרפטומיצין 1x

2. במבחנה הבנייה של מטריקס Native נגזר פיברובלסטים בL-חומצה אסקורבית 2-פוספט בתוספת התקשורת

1. הזרעים 200,000 fibroblasts היטב לכל 6 צלחות היטב (20,000 תאים / ² סנטימטר) בתקשורת פיברובלסטים בתוספת של L-חומצה אסקורבית 2 פוספט. Refeed כל 2-3 ימים עם 2-5 מיליליטר של תקשורת. (הערה: תדר ונפח Refeeding עשוי להיות מותאם כך שיתאימו לצרכימים האישיים של תאים שונים ראה "דיונים".).
2. שכבה עבה של תאים משובצים במטריצה ​​תאית תהווה בסופו של 6 שבועות, גלויים לעין בלתי מזוינת ( איור 1). לשחרר שכבה זו מצלחת תרבית רקמה, בעדינות לגרד ההיקף של מטריקס עם קצה micropipette 1 מ"ל ולאחר מכן דחף את הקצוות של המטריצה ​​לכיוון מרכז הבאר. זו שכבה של תאים ומטריקס (מטריצה ​​מקורית) צריכה להיות בקלות להסרה מפני שטח הצלחת, ועכשיו כמרחף בתקשורת. מורחים את המטריצה ​​המקורית בתקשורת להימנע מכך מתקפל על עצמו.
3. בואו לצוף מטריצה ​​המקורית ולשפץ במשך 5 ימים, שינוי בתקשורת כל 2-3 ימים. בשל חוזק מתיחה ושיפוץ פנימי בתוך מטריצה, המטריצה ​​תתכווץ באופן דרסטי והפכה מופחת למטריצה ​​מקורית קטנה יותר, אבל עבה יותר, והוא מוכן להיות מנוצל עבור assay פלישה.

3. הפלישה Assay עם גידול SCC קרטינוציטים

1. להרים את המטריצה ​​המקורית בעדינות עם מלקחיים בוטים ולהעביר לרשת ניילון. פעם אחת ברשת ניילון, להפיץ את מטריקס בעדינות לשכב שטוח ככל האפשר באמצעות micropipette מיליליטר 1טיפ ומלקחיים בוטים.
2. הכן את הגלילים משובטים סטריליים על ידי מריחת כמות קטנה של וזלין סטרילי בקצה אחד.
3. מניחים את הגלילים המשובטים במטריצה ​​המקורית, עם צד זלין למטה. זאת על מנת להבטיח חותם חזק בין מטריקס היליד והטבעות המשובטים.
4. הוספת תאי CSCC לצילינדרים המשובטים (250,000 תאים בשל תקשורת צמיחת keratinocyte 100 μl).
5. הסר את הגלילים המשובטים לאחר 6 שעות כאשר תאי CSCC התיישבו על המטריצה ​​המקורית.
6. הרם את רשת ניילון עם המטריצה ​​המקורית ותאי CSCC לממשק אוויר נוזלי על תמיכת רשת תיל פלדה אל חלד מכופפת.
7. הוסף מדיה צמיחת keratinocyte בתוספת חומצה אסקורבית עד רמת התקשורת נוגעת בחלק התחתון של המטריצה ​​המקורית.
8. שינוי בתקשורת בכל 2-3 ימים וקציר בשעה 7 ו14 ימים שלאחר זריעה של תאי CSCC.

4. קציר של תרבויות 3D והכנה להיסטולוגיה

1. לתקן בסעיף 4%לילה aformaldehyde בטמפרטורת חדר.
2. לחצות את הדגימות ולהטביע בשעווה ללוקים מוטבעים פרפין קבוע פורמלין, עם משטח החיתוך פונה החוצה.
3. לחלופין, להטביע את הדגימות נחצו בOCT ו Snap-להקפיא באופן מיידי בחנקן נוזלי ללוקי רקמות קפואים.
4. לחתוך 4 מיקרומטר סעיפים על microtome וdewax (במידת צורך). כתם באמצעות haematoxylin ו eosin סטנדרטיים. כדי להמחיש את תאי CSCC, נוגדן חד שבטי עכבר נגד קרטין 14 (LL001, בתוך הבית) ניתן להשתמש בצביעת immunohistology.

Results

טכניקה זו פותחת את האפשרות לבחון ולהשוות את ההתנהגות פולשנית של תאים סרטניים (במקרה זה CSCC) תחת סביבות סטרומה 3D שונות. באמצעות טכניקה זו, לא רק מטריצות ילידי C7-לקויים שנכנעו שוב לסביבת עורי RDEB יכולות להיות שנוצרו, אלא גם מטריצות נוספות שעברו הנדסה גנטית כדי C7-מעל מפורש ^18. כפי שניתן לראות בתרשים 2, פלישה לקרטינוציטים RDEB CSCC היה מפגרת באופן משמעותי במטריצות ילידי C7-ביתר לעומת שליטת RDEB C7-לקויה. פלישה זו היא מדמיין באמצעות שיטות היסטולוגית סטנ...

Discussion

בשל אופייה של ניסוי זה, את הסך כל הזמן הנדרש להשלמה יכול להיות עד חודשים. במשך כל הזמן הזה, שיטות טיפול ותרבות רקמת סטרילית עליונה חייבים להיות מועסקות על מנת למנוע זיהום חיידקים.

מלבד תפקידה כcofactor בסינתזה של hydroxyproline וhydroxylysine של collagens, חומצה אסקורבית מגרה ביטוי קולגן הספציפי mRNA בfibroblasts ^22. החומצה אסקורבית של...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
L-חומצה אסקורבית 2-פוספט	Sigma	A8960
DMEM עם L-גלוטמין, 4,500 מ"ג/ליטר D-גלוקוז, 110 מ"ג/ליטר נתרן פירובט	Life Technologies	11995-073
100x פניצילין-סטרפטומיצין	Life Technologies	15070
וזלין	VWR	PROL28908.290
צילינדרים משובטים	סיגמא	Z370789
ניילון נטו מסנן דיסק הידרופילי 100 & #956; מ 25 & #956; קוטר m 100/pk	Millipore	NY1H02500
תמיכת רשת תיל נירוסטה כפופה	תוצרת הבית		המידות נעשו כך שהרשת תתאים לצלחות 6 בארות