איתור של פלורסנט אינטראקציות Nanoparticle עם אוכלוסיות ראשוניות של תא חיסון על ידי זרימת cytometry

סיכום

ניתוח של אינטראקציה nanoparticle עם אוכלוסיות מוגדרות של תאי מערכת החיסון על ידי cytometry זרימה.

תקציר

חלקיקים מהונדסים ניחנו עם תכונות מבטיחות מאוד למטרות טיפוליות ואבחון. עבודה זו מתארת ​​שיטה מהירה ואמינה של ניתוח על ידי cytometry זרימה ללמוד אינטראקציה nanoparticle עם תאים חיסוניים. יכולים להיות מטוהרים תאים חיסוניים ראשוניים בקלות מרקמות אדם או עכבר על ידי בידוד מגנטי בתיווך נוגדנים. במקרה הראשון, ניתן להבחין אוכלוסיות תאים השונות פועלות בcytometer זרימה על ידי האור מפוזר קדימה (FSC), שהיא פרופורציונלית לגודל תא, והאור מפוזר הצד (SSC), הקשורים לתא מורכב פנימי. יתר על כן, נוגדנים שכותרתו fluorescently נגד קולטני תא שטח ספציפי מאפשרים זיהוי של מספר אוכלוסיות במדגם זהה. לעתים קרובות, כל התכונות הללו להשתנות כאשר תאים שיפרה ידי גירויים חיצוניים המשנים את המצב הפיזיולוגי ומורפולוגיות שלהם. הנה, 50 ננומטר FITC-SiO ₂ חלקיקים משמשים כמודל לזיהוי ההפנמת דואר של חומרי nanostructured בתאים חיסוניים בדם אדם. הקרינה הסלולרי וגידול אור מפוזר צד לאחר דגירה עם חלקיקים אפשרו לנו להגדיר את הזמן ואת תלות ריכוז של אינטראקציה nanoparticle תאים. יתר על כן, פרוטוקול כזה ניתן להאריך לחקור אינטראקציה ₂ nanoparticle Rhodamine-SiO עם מיקרוגליה ראשוניים, תאי העצבים המרכזיים תושב מערכת חיסוניים, מבודדים מעכברים שעברו מוטציה שבמיוחד מבטאים את החלבון פלואורסצנטי הירוק (GFP) בשושלת מונוציטים / מקרופאג. לבסוף, cytometry זרימת נתונים הקשורים להפנמת nanoparticle לתוך התאים אושרו על ידי מיקרוסקופיה confocal.

מבוא

ננו המהונדס כיום השראה האינטרס של מדעני חיים עבור יישומים פוטנציאליים לביו ^1. מגוון רחב של חומרים אורגניים ואורגניים יכול לשמש לייצור ננו עם צורות שונות, פיזיות ותכונות כימיות. בין המבנים הללו, חלקיקים מהונדסים של צורה כדורית הפגינו פוטנציאל גדול לרפואת אבחון וtranslational ^2. הליבה שלהם ועיצוב פני השטח מונעים על ידי יישום אפשרי וזה מרמז על מחקר מעמיק של תגובות תא היעד הבא במגע nanoparticle ואינטראקציה. חלקיקים כי הם חשבו להיות מנוהלים במכוון לבני אדם יבואו במגע ישיר עם מספר סוגים של תאי מערכת החיסון. האחריות שלהם כדי לשמור על שלמות הגוף הופכת אותם לנושא קריטי של החקירה בnanomedicine ^3.

החלק התאי של מערכת החיסון המולדת ה"רשת phagocytes. ביניהם, את שושלת מונוציטים / מקרופאג תאים שמקורם, ביניהם מיקרוגליה תושב מערכת עצבים המרכזיים, לשחק תפקיד מפתח בהגנה החיסונית ^4,5. הם מסוגלים לעורר תגובות המגן בתוך כמה שעות, לאחר שנקלע עם גופים זרים. יתר על כן, תאי monocytic לתאם ולהנחות את התגובה החיסונית אדפטיבית דרך השחרור של ציטוקינים. כל האירועים הללו מתרחשים גם בנוכחותם של חומרים מהונדסים, אשר נתפסים בעיקר כ" nonself "על ידי מערכת החיסון ^6.

בין השיטות היסטורית משמשות באימונולוגיה לניתוח תא, cytometry זרימה מייצגת את אחד הכלים החזקים ביותר. יתר על כן, הזמינות של טכנולוגיות לזיהוי או הטיהור של subpopulation ספציפי חיסוניים (לעתים קרובות מנצל את ההרחקה או נוכחות של חלבון קרום אחד) מאפשרת חקירה מדויקת של ההשפעות של nanoparticle מסוים על ce העיקרי מסויםסוג ll ^7. עם זאת, תאים עשויים להציג שינויים פיסיולוגיים ומורפולוגיים לאחר חשיפה לחלקיקים. כמו כן, חלקיקים עלולים להפריע לפרמטרים ספציפיים אופטיים, כגון קליטה או פליטה של אור באורכי גל מוגדר, המשפיעים על התוצאות שהושגו ^8. לכן, גבולות שימוש ועיבודים הסופיים של מבחני חיסוניים קלאסיים לחקר חומרים חדשים צריכים להיחשב.

עבודה זו עוסקת באיתור של אינטראקציות nanoparticle עם תאים חיסוניים ראשוניים על ידי cytometry זרימה. כדי לטפל בבעיה זו, 50 ננומטר FITC-SiO ₂ חלקיקים הועסקו כnanomaterial מודל כדי לתאר את השיטה. ניתן לייצר חלקיקי סיליקה באופן מדויק מאוד בקנה מידת ננו מטרי. גודל, צורה, ופני שטח תכונות, כגון תשלום או הידרופוביות, יכולות להיות מכוונת היטב כדי להגדיל את ההתאמה הביולוגית שלהם ^9. תכונות רבות של SiO ₂ חלקיקים מאפשרים להם לשמש כמודל עבור משלוח סמים חלקיקי ^10. יתר על כן, יכולים להיות ממולכדים צבעי ניאון או נקודות קוונטיות, או צמוד לחלקיקים אלה מציעים ננו כלים שימושיים למטרות הדמיה ^11.

פרוטוקול

מסר של אתיקה

דגימות אדם ובעלי החיים עובדו פועלות בהתאם להנחיות של משרד בריאות האיטלקי, החוק 116/92 והוראת מועצת הקהילות האירופית 86/609/EEC.

1. תא תרבויות מונוציטים

1. תאי תרבות אנושיים THP-1 בT-75 צלוחיות המכילות מדיום RPMI-1640 תוספת 10% בסרום אנושי, 50 / ml פניצילין U ו50 מ"ג / מיליליטר סטרפטומיצין, 0.05 מ"מ β-mercaptoethanol על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO _2.
2. תרבויות פיצול כאשר מחוברות (כל 3-5 ימים).

2. בידוד של תאי הדם ההיקפיים mononuclear (PBMCs) מאפי מעילים

1. לפני שמתחיל פרוטוקול הבידוד, להכין תמיסה של מי מלח pH פוספט (PBS) 7.2, חומצת ethylenediaminetetraacetic 2 מ"מ (EDTA), 0.5% אלבומין בסרום שור (BSA), והוסיף 5 מיליליטר BSA מלאי פתרון ל95 מיליליטר שטיפת חיץ (1: 20 דילול). דגה החיץ ולשמור אותו קר (2-8מעלות צלזיוס).
   חשוב: אי דגה החיץ עלול לגרום לתוצאות פחות אופטימלי בגלל בועות עלולות לחסום את עמודת הבידוד (ראה שלב 3.2).
   הערה: נוסחה נוגדת קרישת ציטראט דקסטרוז (ACD-) או דקסטרוז פוספט ציטרט (CPD) יכול לשמש לחלופין. לעומת זאת, חלבונים אחרים אלבומין או סרה ממינים אחרים יכולים להחליף את ארגון ה-BSA. אל תשתמשו במאגרים המכילים Ca ^{2 +} או Mg ^{2 +.}
2. השג מעילי אפים מתורמים בריאים (בגילי 20-60 שנים).
3. הכן 50 צינורות חרוטי מיליליטר לצנטריפוגה שיפוע צפיפות. לקבוע את מספר הצינורות הנדרשים לעיבוד הדם (צינור אחד יכול לעבד 35 מיליליטר של דם מדולל) ולהוסיף 15 מיליליטר של Ficoll-Paque על צינור אחד ריק.
4. לדלל 8 מיליליטר של דם עם 24 מיליליטר של PBS / BSA פתרון / EDTA (1:4 דילול).
5. שכבה בזהירות את הפתרון בדילול מלא על גבי Ficoll-Paque (צפיפות = 1.077 גר '/ מיליליטר) בכל אחד מ50 מיליליטר צינורות חרוטי. אל תערבבוהדם וFicoll-Paque.
   חשוב: כדי להימנע מערבוב של הדם וFicoll-Paque, להחזיק את הצינור בזווית של ° 45 ושכבת תערובת הדם באיטיות.
6. צנטריפוגה ב XG 400 ל30 דקות ב 4 ° C. תאי mononuclear (MNC) יישארו בממשק הפלזמה Ficoll-Paque, ואילו גרנולוציטים ואריתרוציטים משקעים בשל צפיפות גבוהה יותר בלחץ האוסמוטי של Ficoll-Paque.
7. להעביר את תאי ביניים (תאים היקפיים mononuclear הדם, PBMCs) לצינור מיליליטר חדש 50 מלא PBS / BSA / EDTA ו צנטריפוגות XG 300 10 דקות ב 4 ° C.
8. שטוף את הכדור פעמיים עם PBS / BSA / EDTA כדי להסיר טסיות דם. ספין ב XG 200 10 דקות ב 4 ° C.
9. תרבות תאי RPMI-1640 להשלים עם 10% בסרום ואנטיביוטיקה אנושיים או להמשיך לטיהור מונוציטים.

3. טיהור הראשונית מונוציטים מPBMCs

1. לבודד מונוציטים מPBMCs ידי הפרדת חרוז מגנטית באמצעות Humערכת בידוד מונוציטים פאן:
   1. עובר תאים דרך רשת 30 מיקרומטר ניילון (מסנני preseparation, 30 מיקרומטר) כדי להסיר גושי תא אפשריים.
   2. לקבוע את מספר הסלולרי באמצעות hemocytometer.
   3. צנטריפוגה השעיה תא XG 300 10 דקות בטמפרטורת חדר (RT). לשאוב supernatant לחלוטין.
   4. resuspend תא גלולה ב30 μl של חיץ PBS / EDTA / BSA לכל 10 ⁷ תאים בסך הכל.
   5. הוסף 10 μl FCR חסימה מגיב לכל 10 ⁷ תאים בסך הכל.
   6. הוסף 10 μl של קוקטייל ביוטין-נוגדן לכל 10 ⁷ תאים בסך הכל.
   7. מערבבים היטב דגירה במשך 5 דקות ב 2-8 ° C.
   8. הוסף 30 μl של חיץ לכל 10 ⁷ תאים בסך הכל.
   9. הוסף 20 μl של microbeads Anti-ביוטין לכל 10 ⁷ תאים בסך הכל.
   10. מערבבים היטב דגירה 10 דקות ב 2-8 ° C.
   11. Resuspend עד 10 ⁸ תאים ב500 μl של חיץ PBS / EDTA / BSA.
2. מפריד מגנטיation
   1. בהתאם למספר הכולל של התאים, בחר עמודה מתאימה MACS וMACS מפריד (ראה גליון הנתונים של טור MACS).
   2. מניחים את הטור בשדה המגנטי של מפריד MACS.
   3. הכן את העמודה על ידי שטיפה עם הכמות המתאימה של חיץ PBS / EDTA / BSA (עמודות MS: 500 μl; עמודות LS: 3 מיליליטר).
      הערה: עמודות הן "זרימת עצירה" ולא לרוץ יבש.
   4. החל השעיה תא על הטור. לאסוף זרימה דרך מכיל תאים ללא תווית, המייצג את החלק היחסי מונוציטים מועשרים.
   5. שטוף עמודה 3x עם PBS חיץ / EDTA / BSA (500 μl לטרשת נפוצה ו3 מיליליטר לLS לכל לשטוף).
   6. איסוף תאים ללא תווית שעוברים דרך, המייצגים את תאי מונוציטים מועשרים, ולהוסיף לזרימה דרך מסעיף 3.2.4.
      הערה: לשטוף את העמודה על ידי הוספת aliquots PBS חיץ / EDTA / BSA רק כאשר מאגר העמודה ריק.
   7. (אופציונאלי) הסר את העמודה ממפריד ולמקם אותו על צינור איסוף מתאים. פיפטה את החיץ על הטור (עמודות MS: 1 מיליליטר; עמודות LS: 5 מיליליטר). מייד לשטוף את תאי nonmonocyte שכותרתו מגנטית על ידי תקיפות דוחפים את הבוכנה לתוך הטור.
   8. תרבות מטוהרת מונוציטים RPMI-1640 להשלים עם 10% בסרום ואנטיביוטיקה אנושיים.

4. טיהור ראשונית מונוציטים מדם מלא

1. לטהר מונוציטים מהדם כולו באמצעות ערכת בידוד מונוציטים בדם כל הבאה הוראות יצרן.

5. Nanoparticle ההפנמה בLeukocytes הדם ומונוציטים מטוהרים

1. 5 x 10 ⁵ מיליליטר פלייט תאים / (1 ​​מיליליטר / טוב) של PBMCs המבודדת או מונוציטים החיוביים CD14 המטוהרים ב12 גם צלחת.
2. פתרון ורטקס FITC-SiO ₂ nanoparticle מניות ו resuspend במדיום מלא לריכוז עבודה של 100 ננומטר.
3. הוסף 10 μl של nanop עובדהשעיה מאמר (100 ננומטר) לדגימות שטופלו כדי להגיע לריכוז סופי nanoparticle של 1 ננומטר. להוסיף את אותו נפח בינוני מלא עבור פקדים שלא טופלו היטב כל אחד.
4. לאחר הפנמת 1 שעות לאסוף את הדגימות בצינור פוליפרופילן 1.5 מיליליטר ו צנטריפוגות במשך 3 דקות ב6,000 XG ב RT.
5. שטוף את הכדור עם 1 מיליליטר של חיץ ריצת 3 דקות ב 6,000 XG ב RT.
6. Resuspend את הכדור ב200 μl של הפעלת מאגר. התאים מוכנים לקריאה על ידי cytometry זרימה עכשיו.

6. בידוד של תרבויות גליה מעורבות ראשיים (ראה Bertero et al. ⁷⁾

7. Replating תרבית תאי גלייה מחוברות מעורבת

1. לשטוף בקבוק T-75 פעם אחת עם 10 מיליליטר של PBS (w / o Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +),} ולאחר מכן להוסיף 10 מיליליטר של Versene ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 5-7 דקות.
2. פיפטה את supernatant מעלה ומטה מספר פעמים על מנת לנתק את התאים מפני שטח T-75 ולפזרתא מצרפים.
3. מעביר את ההשעיה תא צינור פוליפרופילן 15 מיליליטר. לאסוף כמות קטנה של השעיה סלולרית לספור את התאים עם hemocytometer.
4. צנטריפוגה ההשעיה תא דקות 5 ב XG 300 ב RT.
5. הסר את supernatant ו resuspend את הכדור בריכוז סופי של 5 x 10 ⁵ תאים / מיליליטר במדיום התרבות השלם גליה.
6. פלייט 0.5 מיליליטר / היטב בצלחת 24 גם ולתת לתאים להסתפק 2-4 שעות לפני טיפול nanoparticle.

8. Nanoparticle ההפנמה בMicroglia

1. הוסף 500 μl של מדיום תרבות גליה מלא (לפקדים שלא טופלו) או 500 μl של השעיה 2x Rhodamine-SiO ₂ nanoparticle במדיום תרבות גליה מלא (לדגימות שטופלו) זה טוב.
2. פיפטה את התאים כדי לאפשר הניתוק של תאים דבקים-nonrapid בנקודות הזמן שנבחרו ולאסוף אותם ב2 צינורות פוליפרופילן מיליליטר.
3. הוסף 500 μlשל Versene לכל היטב דגירה את הצלחת ב-C ° 37 למשך 5 דקות, ולאחר מכן לנתק את החלק היחסי של תאים הנותרים ולאסוף כל דגימה עם תאי nonadhering המקבילים של השלב הקודם.
4. צנטריפוגה הדגימות במשך 3 דקות XG 300 ב RT.
5. Resuspend את הכדור בריצה של AutoMACS חיץ 100 μl.

9. צביעה עם CD11b-VioBlue

1. הוסף 10 μl של נוגדן אנושי / עכבר VioBlue-CD11b להשעית תא (1:11 יחס) 100 μl בהפעלת מאגר ודגירה 10 דקות ב 4 ° C.
2. הוסף 1 מיליליטר של הפעלת מאגר ומערבבים את ההשעיה התא.
3. צנטריפוגה מדגם זה במשך 3 דקות ב300 x גרם.
4. בטל supernatant ו resuspend את הכדור ב 100-150 μl של הפעלת מאגר.
5. קראו את הדגימות לcytometer (לאחסן הדגימות ב 4 ° C בין שני השלבים האחרונים).
   חשוב: לפני ניתוח הדגימות, המשך לפיצוי של אותות חופפים iספקטרום פליטת n נצפה בין fluorochromes שונה (חלקיקי fluorochrome מצומדות או נוגדנים).

10. לשפוך ספקטרלי על פיצויים

1. פתח את "הגדרות מכשיר" התיבה (קיים בכל התוכנה במכשיר התוכניות).
   הערה: אם אתם משתמשים במכשיר שונה מזה שדווח בטבלת החומר, עיין במדריך הספציפי המכשיר לפרטי הרכישה.
2. לרכוש מדגם שלא טופל (ללא חלקיקים) במהירות fluidic נמוכה (אם מותר על ידי המכשיר). במהלך הרכישה, להתאים ידני קדימה ופיזור צד (FSC ו SSC, בהתאמה) על ידי ויסות ערוצי המתח.
   שים לב: שנה את קשקשי ציר SSC ו FSC על מנת להמחיש את אוכלוסיית תא המלאה בעלילה הטובה ביותר. ניתן ליצור מכשיר הגדרת תבנית לכל סוג תא של עניין, יישמר וישמש לרכישות עתידיות.
3. פתח הספציפיכרטיסייה "אזור" בתוכנה. צייר אזור מתאים גדול ("שער") מסביב לאוכלוסייה הרצויה.
   הערה: הפנמה של חלקיקים גורמת שינוי SSC של התאים. אם השער מוגבל מדי הדוק סביב אוכלוסיית התא של עניין, את הנתונים שנרכשו ככל הנראה יחמיצו חלק מהתאים כדי להתגלות.
4. השתמש בשתי דגימות ללא רבב, אחד לשימוש כמדגם ריק ואחד לפיצויים נגד מכתים לצרכן (אופציונלי), מדגם מוכתם אחד עם fluorochrome המתאים לכל ערוץ הקרינה להיות מתוגמלים.
   הערה: השתמש בצינור מדגם 1.5 מיליליטר שונה עבור כל נוגדן fluorochrome מצומדות לשימוש בתיוג הניסוי.
5. פתח את הכרטיסייה "פיצוי" בתיבת "הגדרות מכשיר". להגדיל או להקטין את גורם הפיצוי במהלך הרכישה עד לעוצמת הקרינה בערוץ הגלישה היא בערך אותו הדבר לקופת fluorochromeitive ואוכלוסייה שלילית.
6. לרכוש דגימות שטופלה nanoparticle לאחר הפיצוי הותאם.

תוצאות

Cytometry זרימה הוא כלי שימושי כדי לזהות ולאפיין תאים שונים וזה הוא הטכניקה של בחירה כדי לזהות תאים חיסוניים ספציפיים, כגון מונוציטים, גרנולוציטים, תאי T, תאי B, תאי הרג טבעי (NK), תאים דנדריטים (DC), ואוכלוסיות אחרות של לויקוציטים.

במאמץ כדי לאפיין את התנהגות תאי דם לבנים טוב יותר בתגובה לחלקיקים, ביצענו מבחני הפנמה עם לויקוציטים העיקרי מבודד מהדם של תורמים בריאים (איורים 1 ו -2) ועם שורת תאי מונוציטים אנושיים (THP-1 תאים, איור 3) .

כפי שדווח באיור 1 א ', שלוש אוכלוסיות ויקוציטים דם גדולות זוהו בבירור על ידי קדימה ופיזור צד לאחר בידוד PBMCs. יתר על כן, לאחר טיפול FITC-SiO _2, יש לימפוציטים (אפור), מונוציטים (כחול) וגרנולוציטים (אדום) n שונהקצב הפנמת anoparticle כפי שמוצג על ידי עוצמת הקרינה ירוקה (איור 1). הפרוטוקול המתואר מאפשר הטיהור של מונוציטים החיוביים העיקריים CD14 מPBMCs. איור 2A מדווח cytometry זרימת עלילת נקודה של CD14 ⁺ מונוציטים בנוכחות של FITC-SiO _2. איור 2B מראה הפנמת ₂ FITC-SiO לכמת באותם התאים ובאו לידי ביטוי ב היסטוגרמה סולם לוגריתמים.

ניסויי הפנמה דומים בוצעו על THP-1 מונוציטים שטופלו בריכוזים הולך וגדל של ₂ חלקיקי FITC-SiO. תאים שלא טופלו שמשו בקרה שלילית. איור 3 א מציג עלייה תלוית מינון בפיזור צד עם קדימה ללא שינוי הפיזור בשורת התאים THP-1. באיור 3 ב, יחד עם היסטוגרמות של SSC וFSC בריכוז כל ₂ nanoparticle FITC-SiO נבדק, כלומר עוצמת הקרינה (Mכימות FI) מוצג. הנתונים אלה מצביעים על כך שטיפול עם ₂ חלקיקי FITC-SiO גורם הפנמה תלוית מינון במונוציטים מודגשים על ידי השיפור של גרעיניות תאית (פיזור בצד) וקרינה (מסלול ירוק).

כדי לזכות בתובנה נוספות בסוג של אינטראקציה בין תאים וחלקיקים חיסוניים, תרבויות גליה מעורבות עיקריות היו מבודדות ומיקרוגליה, תאי העצבים המרכזיים תושב מערכת חיסוניים, היה מטוהרים. השימוש במודל עכבר מהונדס מבטא מיקרוגליה פלואורסצנטי ירוקים מאפשר ההדמיה של מנגנוני נוירו דלקתי שונים. העכבר המהונדס B6.129P-CX3CR1 ^tm1Litt / J משמש בעבודה זו מבטא את החלבון פלואורסצנטי הירוק (GFP) תחת השליטה של אמרגן CX3CR1 ^12. לאחר 7 ימים במבחנה (DIV), מיקרוסקופ פלואורסצנטי תערוכות תרבות גליה עיקרי מעורבת במספר רב של האסטרוציטים (תא חסיד שלילי GFP ים) וחלק מהתאים ירוקים (, איור 5 א GFP חיובי). במודל עכבר זה, ניתן להבחין בין שלוש אוכלוסיות גליה ידי cytometry זרימה עם כתמים בודדים CD11b נוגדנים: CD11b הראשון ^- ה-GFP ^- (האסטרוציטים ותאי גליה אחרים), קבוצה מובחנת שנייה של ה-GFP ^{+ +} תאי CD11b microglial, ו GFP CD11b ⁺ שלישי ^- (איור 4 א) subpopulation. שתי אוכלוסיות אלה האחרונים שניהם מסוגלים להפנים חלקיקים עם יעילות מוגברת קלה על ידי-GFP ⁺ האוכלוסייה (המייצג את מיקרוגליה לא בשלה שסיירו על ידי השעתוק של אמרגן CX3CR1), כפי שמוצגים על ידי ניתוח cytometry זרימה (איור 4). ההפנמה התרחשה ניתן לאמת עוד יותר על ידי מיקרוסקופיה confocal משתמשת באותו ריכוז סופי של ₂ חלקיקי Rhodamine-SiO כפי שמוצג באיור 5.

= "תמיד">
איור 1. הפנמת ₂ nanoparticle FITC-SiO בלויקוציטים דם המבודד.) קדימה נציג פיזור (FSC) לעומת פיזור צד (SSC) cytometry זרימת עלילת נקודה של לויקוציטים דם המבודד Ficoll-Paque. B) עלילת היסטוגרמה כיסוי הקרינה הירוקה של ויקוציטים דם שלושה גדולות תת אוכלוסיות של תאים בנוכחות של 1 ₂ חלקיקי ננומטר FITC-SiO (+45 mV) במשך שעה 1. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

2 nanoparticle בCD14 ⁺ מונוציטים מטוהרים.) קדימה נציג פיזור (FSC) לעומת פיזור צד (SSC) cytometry זרימת עלילת נקודה של מונוציטים החיוביים CD14 המטוהרים. B) עלילת היסטוגרמה הקרינה הירוקה של subpopulation מונוציטים המטוהרים בנוכחותם של 1nm FITC-SiO ₂ חלקיקים (+45 mV) במשך שעה 1. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. השפעות של הפנמת ₂ nanoparticle FITC-SiO על THP-1 תאים.) קדימה נציג פיזור (FSC) לעומת scatterin הצדg (SSC) cytometry זרימת עלילת נקודה של שורת תאי מונוציטים THP-1, בעקבות חשיפת 1 שעות של FITC-SiO ₂ חלקיקי הגדלת וריאציה ריכוז. ב ') תלוי ריכוז של פיזור הצד (SSC), קדימה פיזור (FSC) וירוק הקרינה בנוכחות של FITC-SiO ₂ חלקיקים (+45 mV) במשך שעה 1. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4. Rhodamine-SiO ₂ הפנמת nanoparticle למיקרוגליה עיקריים מבודדים מעכברי ^tm1Litt / J-B6.129P CX3CR1.) חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), לעומת תזרים CD11b-VioBlue cytometry עלילת נקודה של יחסי ציבורגליה מעורבת imary מבודדת מעכברי ^tm1Litt / J-B6.129P CX3CR1. CD11b ^{+ +} ה-GFP וCD11b ⁺ GFP ^- אוכלוסיות מוצגות בעלילת היסטוגרמה כיסוי הקרינה האדומה של אוכלוסיות מיקרוגליה בנוכחות של 1 ₂ חלקיקי ננומטר Rhodamine-SiO (+45 mV) הימנית העליונה והרביעים ימני התחתונים, בהתאמה ב ') ל30. דקות (היסטוגרמה האדומה) לעומת בקרה (היסטוגרמה אפורה). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5. ויזואליזציה של ה-GFP ^{+-מיקרוגליה.} (א) מיקרוסקופ פלואורסצנטי ב7 DIV ומיקרוסקופיה confocal (ב ')הפנמת ₂ nanoparticle Rhodamine-SiO (חצים אדומים) ב- GFP ^{+-מיקרוגליה.} אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

דיון

פרוטוקול הניסוי מציג נקודות קריטיות מאוד שיש לקחת בחשבון. זה באמת חשוב לעבוד על 4 ° C (על קרח), ואולי בחושך במהלך כל שלבי הצביעה, משום שטמפרטורות ואורות גבוהות יותר עשויות להשפיע לרעה על התשואה מכתים. חלקיקים יכולים להיות sonicated להיות טוב יותר resuspended רק לפני השימוש.

זרימה נכונה ניתוח cytometry דורשת כיול נכון בערוצים השונים. כיול של המכשיר יש לבצע לפני כל פגישה ניסיונית. חוץ מבעיות טכניות עם המכשור, לא יכולה להיות גם בעיות עם תיוג הנוגדן. זה חובה להשתמש בנוגדן בריכוז מתאים. אם הריכוז גבוה מדי או נמוך מדי, עוצמות אות אי שביעות רצון יכולה להיות התוצאה.

החסרונות של דאגה בטכניקה זו את הצורך בעבודה עם דגימות monodisperse, חוסר היכולת למקם אתאתר של מקור האות (תאים סלולריים שונים, כלומר). יש גם כמה מגבלות בבחירת fluorochromes לשמש בשילוב: אורך הגל של העירור ולהקות הפליטה חייב להיות מופרד במידה מספקת כדי לאפשר המדידה המתאימה שלהם. אם ספקטרום הנוגדן משמש חופף, נדרש פיצוי נכון.

Cytometry זרימה היא שיטה רבת עוצמה לניתוח תא בנוכחות או עדר של חלקיקים. טכניקה זו מאפשרת מחקר multiparametric של תא, מספר גבוה של אירועים שנבדק, מהירות של ניתוח (יותר מ 1,000 תאים / sec), שחזור וקריאות סטטיסטיות. יכולות להיות מעובד דוגמאות בלי לאבד את יכולת הקיום של תאים.

באמצעות חלקיקים שכותרתו fluorescently זה אפשרי להעפיל ולכמת ההפנמה שלהם בתת אוכלוסיות של תאים, אשר מזוהות על ידי סמנים ספציפיים נחשפו על קרום התא. פרמטרים ניידים יכולים לשנות בנוכחותו של ים חלקיקי pecific. בהתאם למטרה של המחקר, ניתן להשתמש בם וריאציות אלה כדי לזהות תופעה ספציפית, כגון פיזור צד של תאים שאופן יחסי עולה עם קצב הפנמת nanoparticle הגובר.

שינויים הנגרמים Nanoparticle של תא שטח יכולים גם לייצג מגבלה של הטכניקה. מסיבה זו, מחזור קולטני קרום התא חייב להיות תמיד נלקח בחשבון ואולי ידוע מראש לאפיין את אוכלוסיית התא של עניין בדיוק. ליקויים קיצוניים של אוסמוזה קרום בדגימות nanoparticle העמוס יכולים להוביל למוות של תאים.

רעילות תלויה מינון nanomaterial צריכה להיבדק באופן אמפירי לכל אוכלוסיית תא. תאים מתים מוגדרים חייבים להיות מחוץ כימות הקרינה. למשל, מכתים Annexin V / PI הוא אחד ממספר השיטות משמשות בדרך כלל כדי לזהות תאי שני נמקים ואפופטוטיים.

"> תאים ראשוניים-GFP-לבטא גם כלי רב עוצמה כדי לבחור subpopulation תאים מסוים ולאסוף נתונים ללא prelabeling. השילוב עם חלקיקי ניאון משלימים מאפשר כימות מהירה מאוד ומדויקת של אינטראקציה תא nanoparticle. הוא חשב משלוח סמים או גנטי כדי להשתפר בעתיד על ידי היישום של חלקיקים מסוגלים לשחרר ספציפי עומס תרופה לרקמות שנבחרו.

תעסוקה של חלקיקי מאפננים כספציפיים נושאות אספקה ​​ו / או חיסון לרוקחות דורשת הידע של הסביבה הביולוגית (כלומר, באמצעות cytometry זרימה) כדי לחקור אינטראקציות תא nanoparticle.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
HBSS	Gibco	14170-088	חם ב 37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש
RPMI-1640 (ATCC Modified)	Gibco	A10491-01	חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש
DMEM, גלוקוז גבוה, פנול אדום	Gibco	41966-029
פניצילין-סטרפטומיצין,	ג'יבקו	15140-122
Gentamycin	Gibco	15710-049
סרום סוסים (אצווה n° 1131917)	Gibco	16050-122
β-מרקפטואתנול	Gibco	21985-023
Trypsin 2.5%	Gibco	15090-046
Human Pooled Serum	Invitrogen	34005100
Versene	Invitrogen	15040-033
DNAse I	Sigma Aldrich	D5025-150KU
CD11b-VioBlue אדם ועכבר	Miltenyi Biotec	130-097-336
MACS BSA Stock Solution	Miltenyi Biotec	130-091-376
פתרון שטיפה autoMACS	Miltenyi Biotec	130-091-222
מאגר ריצה	Miltenyi Biotec	130-092-747
autoMACS מאגר ריצה	Miltenyi Biotec	130-091-221
ערכת בידוד מונוציטים פאן אנושי	Miltenyi Biotec	130-096-537
ערכת עמוד דם מלא	Miltenyi Biotec	130-093-545
דם מלא CD14 MicroBeads, אנושי	Miltenyi Biotec	130-090-879
MS Column	Miltenyi Biotec	130-042-201
LS Column	Miltenyi Biotec	130-042-401
מפריד MidiMACS	Miltenyi Biotec	130-042-302
מפריד MiniMACS	Miltenyi Biotec	130-042-102
תמיסת ליזה של תאי דם אדומים	Miltenyi Biotec	130-094-183
מסנני הפרדה מוקדמת 30 ומיקרו; m	Miltenyi Biotec	130-041-407
MACSQuant מנתח ציטומטר זרימה	Miltenyi Biotec	130-092-197
MACSQuant חרוזי כיול	Miltenyi Biotec	130-093-607
Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare	GEH17544202
ננו-חלקיקים FITC-SiO2 (50 ננומטר, +45 mV)	חברת
רודמין-SiO<תת>2 ננו-חלקיקים (50 ננומטר, +45 mV)	HiQ-Nano Company
צלחת 12 בארות Falcon	Becton Dickinson	353043