מאמר שיטה

In vivo גישת Crosslinking לבודד חלבון מן מכלולים דרוזופילה עוברים

16.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51387

⸱

23 באפריל 2014

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Murray State University

במאמר זה

סיכום

קומפלקסי חלבונים מרובים רכיבים ממלאים תפקידים חיוניים בתפקוד ופיתוח סלולריים. כאן אנו מתארים שיטה המשמשת לבודד חלבון מתחמי יליד מעוברי דרוזופילה לאחר in vivo crosslinking ואחריו טיהור של מתחמי crosslinked לניתוח מבנה פונקציה שלאחר מכן.

תקציר

תהליכים תאיים רבים נשלטים על ידי קומפלקסי חלבוני multisubunit. לעתים קרובות מתחמים אלה מהווים transiently ודורשים סביבה מקורית להרכבה. לכן, כדי לזהות קומפלקסי חלבונים פונקציונליים אלה, חשוב לייצב אותם in vivo לפני תמוגה תא וטיהור שלאחר מכן. כאן אנו מתארים שיטה המשמשת לבודד מתחמים גדולים בתום לב חלבון מעוברי דרוזופילה. שיטה זו מבוססת על permeabilization עובר וייצוב של מתחמים בתוך את העוברים על ידי in vivo crosslinking באמצעות ריכוז נמוך של פורמלדהיד, אשר יכול בקלות לחצות את קרום התא. בהמשך לכך, מורכב החלבון של עניין הוא immunopurified ואחריו טיהור ג'ל ונותח על ידי ספקטרומטריית מסה. אנו מדגימים שיטה זו באמצעות טיהור של חלבון מורכב טיודור, שהוא חיוני להתפתחות תאי מין. טיודור הוא חלבון גדול, המכיל תחומים טיודור מרובים - קטןמודולים כי אינטראקציה עם arginines או lysines מפוגלים של חלבוני יעד. שיטה זו יכולה להיות מותאמת לבידוד של קומפלקסי חלבוני יליד מהאורגניזמים ורקמות שונים.

מבוא

בידוד של מכלולי חלבון multisubunit ומתחמי ה-DNA או RNA-חלבון מתבצע לזהות קומפלקסי חלבונים, לוקוסים הגנומי מוכרים על ידי חלבוני רגולטורים-DNA מחייבת או מטרות RNA של חלבוני RNA מחייבים. שיטות שונות מאפשרות זיהוי הגנום של אתרי ה-DNA המוכרים על ידי גורמי שעתוק או חלבוני הכרומטין (שבב-seq) 1 ומטרות RNA הקשורים בחלבון נתון מחייב-RNA (CLIP-seq) 2. הספריות של cDNAs נגזר RNA או DNA מטרות מכן רצף עמוק. שיטות אלה משתמשות כימיות או cross-linking כדי לייצב את מתחמים ואחרי immunoprecipitation (IP) עם נוגדנים נגד מרכיב חלבון של המתחם למד מושרה UV.

במהלך ההתפתחות של האורגניזם, קומפלקסי חלבונים רבים יוצרים transiently. לכן, זה הכרחי כדי לנתח את ההרכב ותפקוד של קומפלקסים אלה in vivo כדי להבין את המנגנונים המולקולריים השולטים development. ניתוח כזה in vivo יהיה מעולה במבחנת גישה שכן הוא כמעט בלתי אפשרי לשחזר ריכוזי יליד מרכיבי האינטראקציה והסביבה ביוכימית תאית במבחנה. כאן אנו מדגימים vivo בגישה שאנחנו בהצלחה להשתמש כדי לבודד את מערכות חלבון גדולות מעוברי דרוזופילה. בשיטה זו, קומפלקסי חלבונים בעוברי החיים הם crosslinked עם ריכוז נמוך של פורמלדהיד, ולאחר מכן מתחמי חלבון של עניין מבודדים על ידי IP עם נוגדנים נגד מרכיב ידוע של מתחמים ואחריו טיהור ג'ל של מתחמים וניתוח ספקטרומטריית מסה כדי לזהות רכיבים מורכבים לא ידועים. מאז פורמלדהיד הוא מסוגל לחדור את קרום התא ויש לו מגוון crosslinking של 2.3-2.7 3, ניתן crosslinked קומפלקסי חלבוני in vivo והרכיבים המורכבים צפויים להיות קרוב אחד לשני. שבמאמר זהמתאר שיטה זו באמצעות הבידוד של טיודור (TUD) חלבון מורכב לדוגמא ירושלים. TUD הוא חלבון בתאי מין שהוא חיוני להתפתחות תאי המין 4-7. חלבון זה מכיל 11 תחומים TUD ידועים אינטראקציה עם arginines או lysines מפוגלים של פוליפפטידים אחרים 8-10.

בעבר, יש לנו שנוצרו קו דרוזופילה מהונדס המבטא HA-מתויג TUD הפונקציונלי 5 ולכן, נוגדן אנטי HA ספציפי משמש לניתץ מורכב TUD לאחר crosslinking.

בנוסף לcrosslinks חלבונים, פורמלדהיד יכול ליצור crosslinks חומצת חלבון גרעין, והוא משמש בניסויי שבב seq. יתר על כן, בדרוזופילה, in vivo crosslinking עם פורמלדהיד אפשר זיהוי של יעד RNA חלבון helicase Vasa RNA 11.

ואילו במאמר זה אנו מתארים שיטה לin vivo crosslinking ופורification של קומפלקסי חלבונים מעוברי דרוזופילה, שיטה זו יכולה להיות מותאמת לאורגניזמים וברקמות אחרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת צלחות מיץ-אגר גדולות של אפל

  1. כדי להפוך את 4 צלחות, להוסיף 375 מיליליטר H 2 O, אגר זבוב 11.25 גרם ובר ומערבבים בבקבוק 1,000 מיליליטר. זה מיקס א החיטוי מיקס עם מכסה הבקבוק כתרים על מחזור 30 דקות-עיקור אחד עבור מוצרים נוזליים באופן רופף.
  2. הוספה 125 מיץ מיליליטר תפוח, 12.5 סוכר שולחן גרם ובר ומערבבים לכוס 500 מיליליטר. זה המיקס B. חום המיקס B על פלטפורמה מחוממת תוך כדי ערבוב ולשמור על הטמפרטורה בכ 70 ° C עד מעוקר של המיקס הוא סיים.
  3. עם השלמת מיקס מעוקר, להעביר מיקס B למערבב א שמור ערבוב את התערובת בשילוב בעדינות ולתת לו להתקרר במשך 15 דקות. הימנע על קירור וההתמצקות אגר הביאה לפני התוספת של חומר משמר.
  4. הפוך פתרון 4-hydroxybenzoate תיל 10% (משקל / נפח) באתנול. זה ישמש כחומר משמר. הוספת 3.75 מיליליטר של הפתרון לתערובת מיץ התפוחים אגר לעיל. שמור ערבוב במשך another 5 דקות.
  5. יוצקים את תערובת מיץ תפוחים אגר מיליליטר 125 עם חומר משמר לכל פלסטיק 300 2 סנטימטר או צלחת קלקר. תן לזה להתקרר לRT ולחזק. הימנע מיצירה של בועות אוויר בעת המזיגה.
    הערה: צלחות מיץ התפוחים אגר מוכנות לשימוש באופן מיידי. כסה צלחות שאינן בשימוש עם עוטף ברור ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.

2. אוסף תסיסנית וטיפול טרום crosslinking

  1. טען כלוב אוכלוסייה עם כ 40,000 50,000 זבובים שממנו העוברים ייאספו.
  2. בצע שתי צלחות המכילה כל אחת 125 מיליליטר של קמח תירס, מולסה הסטנדרטי בינוני 12 ומפזר כ 4 גרם של שמרי אופה מיובש על כל צלחת. הנח צלחות אלה לתוך כלוב האוכלוסייה בC חממת 25 ° ל48 שעות לפטם את הזבובים.
  3. צלחות מיץ אגר חמות 2 תפוחים ל25 ° C. מפזר כ 1 גרם של שמרים יבשים אופה בכלצלחת. מניחים את 2 הצלחות בכלוב האוכלוסייה להתחיל לאסוף 0-1 עוברי HR-ישן.
  4. קח את הצלחות בסוף אוסף 1 שעות. החלף עם 2 צלחות חדשות, אם יש צורך בסיבוב של אוסף אחר.
  5. להוסיף מספיק מים כדי לכסות את הצלחות וresuspend את העוברים בעדינות עם מברשת צבע עדינה. יוצקים את עוברי resuspended דרך מסננת שתי שכבה עשויה מרשת תיל פלדה אל חלד.
    הערה: השכבה העליונה עשויה רשת גודל נקבובית בינוני (850 מיקרומטר) אשר אוספת חלקי זבוב גדולים בעת נותן דרך עוברים. השכבה התחתונה עשויה מרשת בסדר (75 מיקרומטר) אשר אוספת עוברים בעת נותן באמצעות שמרים ומים.
  6. השתמש במברשת הצבע העדינה להעביר את העוברים שנאספו לתוך סל איסוף נעשה עם צינור 50 מיליליטר ורשת ניילון דק. יש לשטוף את העוברים לזמן קצר במים ולאחר מכן למחוק את הרשת על מגבות נייר לייבוש.
  7. לטבול את העוברים באקונומיקת 50% עם מתערבל בעדינות במשך 3 דקות. יש לשטוף יסודיly עם מים כדי להסיר כל אקונומיקה שנותרה. למחוק את הרשת על מגבות נייר לייבוש.
  8. לטבול את עוברי dechorionated בisopropanol עם תסיסה עדינה ל15 שניות או עד שההתמוטטות של גושים רב עובר (זה לא אמור לקחת זמן רב יותר מאשר 30 שניות). למחוק את הרשת על מגבות נייר לייבוש ביסודיות.
  9. לטבול את העוברים בheptane במשך 5 דקות תוך השימוש בפיפטה כדי להזרים heptane על העוברים כדי לשמור אותם מושעים. למחוק את הרשת על מגבות נייר לייבוש.
  10. יש לשטוף את העוברים עם זרמים של בופר פוספט, pH 7.4 (PBS) המכילים 0.1% טריטון X-100 (PBST) במשך 3 דקות.
  11. לפרק את סל האיסוף ולהעביר את העוברים יחד עם הרשת לצינור 15 מיליליטר מכיל 10 PBST מיליליטר. להפוך את הצינור בעדינות כדי לשטוף את העוברים מחוץ לרשת.
  12. הסר את הרשת מהצינור. שים את הצינור במצב אנכי ולתת את העוברים לשקוע לחלק התחתון של הצינור על ידי כוח הכבידה.
    הערה: כ 100-300μl של עוברים צפוי לאוסף 1 שעות מכלוב אחד.
  13. הסר את PBST ותמשיך לבצע crosslinking באופן מיידי.

3. בvivo crosslinking של עוברים שנאספו

  1. הכן פורמלדהיד 0.2% בPBST מייד לפני השימוש. הוסף 10 מיליליטר של מקבע פורמלדהיד לעוברים ולדגור על 25 ° C עם תסיסה עדינה על שייקר רוטרי 10 דקות. בטל מקבע שאינו בשימוש על ידי סופו של היום.
  2. להרוות את תגובת crosslinking
    1. בסופו של crosslinking, בואו העוברים לשקוע לתחתית של התחתית.
    2. הסר את פתרון פורמלדהיד. מייד להוסיף 10 מיליליטר של 0.25 M גליצין בPBST כדי להרוות את תגובת crosslinking. לדגור על 25 ° C עם תסיסה עדינה על שייקר סיבובי למשך 5 דקות.
    3. בואו העוברים לשקוע לתחתית של התחתית. הסר את הפתרון להרוות. לשטוף את העוברים עם 10 מיליליטר של PBST שלוש פעמים.
    4. להסיר לחלוטין את Pפתרון לשטוף BST באמצעות פיפטה. עוברי חנות ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

4. לדוגמא הכנת חלבון וImmunoprecipitation

  1. Homogenize עוברי crosslinked 500 μl באמצעות homogenizer Dounce ב2 מאגר תמוגה מיליליטר (0.5 M אוריאה, 0.01% SDS, 2% Triton-X 100, פלואוריד 2 מ"מ phenylmethanesulfonyl [PMSF] ומעכבי פרוטאז קוקטייל PBS).
    הערה: בצע את זה ואת השלבים הבאים בRT אלא אם צוין אחרת.
  2. העבר את lysate ל1.5 צינורות צנטריפוגה מיליליטר ועדינות רוק על במה מסתובב במשך 15 דקות כדי להבטיח תמוגה יסודית. צנטריפוגה lysate XG 16,000 במשך 5 דקות עד גלולה פסולת הסלולר. שמור את supernatant בצינור מיליליטר נקי 15.
  3. הוסף 40 μl חרוזים agarose אנטי HA בלועים לsupernatant ולדגור על פלטפורמה מסתובבת ל2.5 שעה.
  4. גלולה חרוזים על ידי צנטריפוגה ב2,500 XG במשך 5 דקות. הסר את supernatant אך להשאיר את approximately 250 μl בצינור. Resuspend את החרוזים supernatant נותר ולהעביר לטור ספין 1.5 מיליליטר עם מסנן נקבובית 10-מיקרומטר.
  5. צנטריפוגה עמודת הספין על XG 12,000 ל10 שניות וזורקים את הזרימה דרך.
  6. שטוף את החרוזים על ידי הוספת 200 לשטוף חיץ μl (0.1 M גליצין, 1 M NaCl, IGEPAL 1% CA-630, Tween-20 0.1%, ב-PBS). צנטריפוגה העמודה ב12,000 XG במשך 10 שניות וזורקים את הכביסה. חזור על לשטוף פעמים נוספות.
  7. הוסף 40 חיץ elution μl (2 מ"ג / מיליליטר HA-peptide בPBS) לחרוזים ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך דקות 15 עם תסיסה עדינה כל 5 דקות. צנטריפוגה העמודה ב12,000 XG במשך 10 שניות ולאסוף את eluate.
  8. לאשר elution של המתחם על ידי ניתוח כתם המערבי באמצעות אנטי HA נוגדן 13.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

היעילות של crosslinking והטיהור המוצלחת של החלבון המורכב TUD crosslinked נותחו על ידי SDS-PAGE על 3% - 7% ג'ל צעד (איור 1) ואחריו כתם מערבי (איור 2).

מטרת שימוש ב3% - ג'ל שלב 7% מבוססת על ההפרדה היעילה של חלבונים מורכבים TUD crosslinked מהחלבון שנותר uncrosslinked TUD והריכוז המורכב. מתחת in vivo תנאי crosslinking שלנו שהוזכרו לעיל, חלק גדול מחלבון TUD יכול עדיין...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פורמלדהיד כבר בשימוש נפוץ כמגיב crosslinking לזיהוי חלבונים ואינטראקציות חומצת חלבון גרעין. חדירות טובות שלה מסיסות וקרום תא, יחד עם התאימות לנהלי ספקטרומטריית מסה במורד הזרם, להפוך פורמלדהיד סוכן מועמד אידיאלי עבור יישומי crosslinking תאיים 3,15-17. בפרט, הוא השתמש בהצלחה כדי לזהות mRNAs הקשורים לושה, helicase RNA תאי נבט קריטי ב11 דרוזופילה. בנוסף, לפורמלדהיד אחת מהזרועות הקצרים ביותר spacer (2.3-2.7 Å) בקרב crosslinkers זמין מסחרי, מה שמרמז כי מול...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

יש המחברים אין לחשוף.

תודות

אנו מודים לירדן דייוויס, Yanyan לין, אריק Schadler וJimiao ג'נג לעזרה הטכנית שלהם בעבודה זו. עבודה זו נתמכה על ידי NSF קריירה להעניק MCB-1054962 לALA

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Drosophila agarLab Scientific (http://www.labscientific.com/)FLY-8020-1אין לבצע חיטוי של תערובת המים והאגר לפרק זמן ממושך מכיוון שזה יגרום לצלחות מיץ התפוחים להיות שבירות
מתיל 4-הידרוקסיבנזואטסיגמא (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)H5501שם אחר: TEGOSEPT
כלוב אוכלוסייהFlystuff ( http://www.flystuff.com/)59-104
חומר זבוב רשת ניילון עדינה(http://www.flystuff.com/)57-102בעת הכנת סל האיסוף, חתוך את הרשת מעט גדולה יותר מפתח מכסה צינור הבז כדי להבטיח אטימה הדוקה
הומוגנייזר DounceSigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)D8938-1SETיש לצנן את ההומוגנייזר על קרח ולשטוף מראש עם מאגר ליזה קר לפני השימוש כדי למנוע פירוק חלבון
קוקטייל מעכב פרוטאז ניתן להשתמש ב-Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa)4693132001PBS להכנת תמיסת מלאי מעכב פרוטאז מרוכזת
חרוזי אגרוז נגד HAMBL international (http://www.mblintl.com/)561-8הערכה כוללת גם עמודות HA-פפטיד וספין
HA-פפטידMBL בינלאומי (http://www.mblintl.com/)561-8הכנה ל-2 מ"ג/מ"ל עם PBS 
עמוד ספיןMBL בינלאומי (http://www.mblintl.com/)561-8עמודות ספין כלולות כחלק מהערכה
איזופרופנולפישר סיינטיפיק (www.fishersci.com/‎)
טריטון X-100פישר סיינטיפיק (www.fishersci.com/‎)BP151-500
הפטןפישר סיינטיפיק (www.fishersci.com/‎)H350-4
PBSInvitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html)AM9625יש לדלל מ-10X ל-1X במים ננו-טהורים לפני השימוש
פורמלדהידפישר סיינטיפיק (www.fishersci.com/‎)BP531-500
גליציןביו-ראד (www.bio-rad.com/‎)161-0724
SDSBioRad (www.bio-rad.com/‎)161-0301
אוריאהביו-ראד (www.bio-rad.com/‎)161-0730
פנילמתאן סולפוניל פלואורידסיגמא (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)P7626-1Gהכן תמיסת מלאי של 200 מ"מ באיזופרופנול ולאחר מכן דלל לריכוז עבודה של 2 מ"מ במאגר ליזה
IGEPAL CA-630סיגמא (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)I8896-50 מ"ל
טווין 20פישר סיינטיפיק (www.fishersci.com/‎)BP337-100
צינורות 15 מ"לארה"ב סיינטיפיק (http://www.usascientific.com/)1475-0511
אקונומיקהקלורוקס מותגלדלל בנפח שווה של מים ננו-טהורים להכנת 50% אקונומיקה
צינורות 50 מ"לBD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp)352098
מסננת שכבה עליונהפישר סיינטיפיק (www.fishersci.com/‎)04-884-1AK
מסננת שכבה תחתונהפישר סיינטיפיק (www.fishersci.com/‎)04-884-1BA
BP26324

מקורות

  1. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome research. 22, 1813-1831 (2012).
  2. Murigneux, V., Sauliere, J., Roest Crollius, H., Le Hir, H. Transcriptome-wide identification of RNA binding sites by CLIP-seq. Methods. , (2013).
  3. Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions. Journal of mass spectrometry : JMS. 43, 699-715 (2008).
  4. Creed, T. M., Loganathan, S. N., Varonin, D., Jackson, C. A., Arkov, A. L. Novel role of specific Tudor domains in Tudor-Aubergine protein complex assembly and distribution during Drosophila oogenesis. Biochemical and biophysical research communications. 402, 384-389 (2010).
  5. Arkov, A. L., Wang, J. Y., Ramos, A., Lehmann, R. The role of Tudor domains in germline development and polar granule architecture. Development. 133, 4053-4062 (2006).
  6. Boswell, R. E., Ptudor Mahowald, A. a gene required for assembly of the germ plasm in Drosophila melanogaster. Cell. 43, 97-104 (1985).
  7. Thomson, T., Lasko, P. Drosophila tudor is essential for polar granule assembly and pole cell specification, but not for posterior patterning. Genesis. 40, 164-170 (2004).
  8. Arkov, A. L., Ramos, A. Building RNA-protein granules: insight from the germline. Trends in cell biology. 20, 482-490 (2010).
  9. Gao, M., Arkov, A. L. Next generation organelles: Structure and role of germ granules in the germline. Molecular reproduction and development. , (2012).
  10. Liu, H., et al. Structural basis for methylarginine-dependent recognition of Aubergine by Tudor. Genes & development. 24, 1876-1881 (2010).
  11. Liu, N., Han, H., Lasko, P. Vasa promotes Drosophila germline stem cell differentiation by activating mei-P26 translation by directly interacting with a (U)-rich motif in its 3. UTR. Genes & development. 23, 2742-2752 (2009).
  12. Matthews, K. A. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A. 44, Academic Press. 13-32 (1995).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  14. Thomson, T., Liu, N., Arkov, A., Lehmann, R., Lasko, P. Isolation of new polar granule components in Drosophila reveals P body and ER associated proteins. Mechanisms of development. 125, 865-873 (2008).
  15. Vasilescu, J., Guo, X., Kast, J. Identification of protein-protein interactions using in vivo cross-linking and mass spectrometry. Proteomics. 4, 3845-3854 (2004).
  16. Klockenbusch, C., Kast, J. Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1. J Biomed Biotechnol. 2010, 9275-9285 (2010).
  17. Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 39, 715-725 (2005).
  18. Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 41, 694(2006).
  19. Liu, N., Dansereau, D. A., Lasko, P. Fat facets interacts with vasa in the Drosophila pole plasm and protects it from degradation. Current biology : CB. 13, 1905-1909 (2003).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Western BlotembryosTudor

מאמרים קשורים