מאמר שיטה

טיפול המבוסס על תאים לאי ספיקת לב בחולדה: חדר זוגי פתיחת בית החזה לאוטם שריר הלב וepicardial השרשה של תאים וBiomatrix

DOI:

10.3791/51390

⸱

22 בספטמבר 2014

 ,  ,  ,  , 
1Cardiology, Department of Medicine, University of Fribourg

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השרשה של biograft לטיפול באוטם שריר לב שנגרם על ידי קשירת LAD במודל מכרסם דרשה כמקובל שני ניתוחי לב פתוח. על מנת להקטין את התמותה ולספק תנאים אופטימליים לקיבוע של biomatrices המוצק והדביק הקשורים לתאים, נהלים פולשנית פותחו.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיפול בתאי לב צבר עניין גובר והשתלה של חומרים ביולוגיים הקשורים לתאים הפך לנושא מרכזי כדי לייעל את משלוח תא שריר לב. מודל מכרסם של אוטם שריר לב (MI) בהיקף של שמאל קדמי יורד עורקי קשירה (LAD) יש בדרך כלל בוצעה באמצעות פתיחת בית החזה; ניתוח לב פתוח שני באמצעות sternotomy באופן מסורתי נעשה ליישום epicardial של הטיפול. מאז התיאור של מודל קשירת LAD, שיעור תמותה לאחר ניתוח ירד 35-13%, אולם הניתוח השני נותר קריטי. על מנת לשפר את ההתאוששות לאחר הניתוח ולהפחית את הכאב ודלקת, ניתוחים פולשנית מוצגים. שתי thoracotomies בוצע, אחד הראשוני לקשירת LAD והשני לממשל epicardial טיפול. Biografts המורכב של תאים הקשורים מטריצות מוצקות או ג'ל סוג יושמו על ar infarctedea. קשירת LAD הביאה לאובדן תפקוד לב כפי שאושרה על ידי בדיקת אקו שבוצע לאחר 2 ו -6 שבועות. גולדנר Trichrome צביעה מבוצעת על סעיפי לב אישר היווצרות צלקת transmural. ניתוחים הראשונים והשני הביאו פחות ש10% תמותה לאחר ניתוח.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאז סוף המאה ה -19, מחלת לב וכלי דם נשארה רוצח סדרתי מספר אחת במדינות מתועשות. ביניהם, מחלת לב כלילית מייצגת את אטיולוגיה העיקרית. תוצאות השלב אקוטיות באוטם שריר לב (MI) ואחריו שיפוץ הסתגלותי שבהדרגה מתפתח לכיוון שלב כרוני ואי ספיקת לב חמורה. למרות התקדמות טכנולוגית וטיפולית משמעותית האחרונה, התחלואה והתמותה כתוצאה מההתקדמות של אי ספיקת לב עדיין גדלו 1. בהקשר זה, טיפול בתאים צבר עניין גובר כאופציה טיפולית חדשה כדי לעצור את התקדמות המחלה לאי ספיקת לב ולעורר את יכולת ההתחדשות זיהתה לאחרונה של שריר הלב. חקירות ניסיוניות וקליניות סיפקו ראיות משכנעות של ההשפעות מועילות שהושגו לאחר השתלת לב של סוגי תאים שונים. תוצאות עיקריות כללו cardi המשופרפונקצית התכווצות ac, ירד שיפוץ של חדר שמאלי, הפחיתה את הגודל אוטם, והגדילה את צפיפות כלי דם באזור infarcted. עם זאת, שמירת מספר התא הנמוכה לאחר הזרקת התא נשארה חסרון חשוב. איגוד תאים עם biomatrix כדי לשפר של תא משלוח 2 לאחרונה טפח חוקר ואינטרסים קליניים.

קשירה של קדמי העורק הכלילו השמאלי יורד (LAD) היא שיטת התייחסות לMI במודל של בעלי חיים קטנים שגורם לאוטם transmural וצלקת בוגרת. טיפול בתאים שיושמו בשלב הכרוני של MI דורש התערבות כירורגית שנייה. Sternotomy חציון מבוצע בדרך כלל כדי לאפשר הזרקת intramyocardial של התאים או השתלת epicardial של biografts. פרוצדורות כירורגיות פולשניות כגון להגדיל את שיעור התמותה, זמן החלמה לאחר ניתוח, כאב, וסיכון לזיהום. הגישה הזעיר פולשנית המוצגת כאן לא רק מונעת הטיה כזו, אלא גם מספקת oנגישות ptimal של הלב ליישום טיפול. MI והשתלת epicardial של תאים הקשורים לbiomatrix סוג ג'ל מבוצעים על לב פועם באמצעות thoracotomies צלע שמאל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: לואיס זכר ונקבת חולדות, 200-220 גרם שוכנו בתנאים סטנדרטיים מעבדה (12 שעות אור וחושך מחזור, מים כרצונך מודעה ומזון, כלוב IVC). טופלו כל בעלי החיים בקנה אחד עם ההמלצות של FELASA והחוק השוויצרי בהגנה על בעלי חיים.

.1 תא הכנה: בידוד תאי גזע mesenchymal ממח העצם

  1. להרדים את החולדות עם 5% isoflurane וO 2 5 ליטר / דקה בחדר אינדוקציה למשך 5 דקות. הנח חוטם של בעל החיים לחרטומו מחובר למערכת ההרדמה. בצע קמצוץ הבוהן או זנב כדי לאשר הרגעה.
  2. הסר את העור מהרגל במספריים על ידי חיתוך העור מקרסול לירך. הסר את השרירים וחתך את עורק הירך לexsanguination בעלי החיים. לחשוף את מפרק הירך ולנקוע את הראש עצם הירך. חשוב שלא לפגוע בראש עצם הירך. מניחים את העצמות בסטרילי PBS בצינור פלסטיק 50 מ"ל.
  3. הסר את כל muscles ורצועות מהעצמות בלי לשבור אותם. הערה: חשוב שהעצם נותר בשלמותה, כדי למנוע הצמדה של פתרון שטיפה או זיהום עם אתנול. יש לשטוף את העצמות מקולפות ב70% אתנול למשך 5 דקות.
  4. תחת הזרימה למינרית סטרילי, לחתוך את שני קצות העצמות במספריים. לשטוף את מוח העצם על ידי הזרקת PBS סטרילי מגפי העצם. לאסוף מח לתוך צינור 15 מ"ל. דקות צנטריפוגה 7 ב300 גרם x.
  5. הסר את supernatant. להשעות את גלולה ב 3 מ"ל של תאי דם אדומים תמוגה חיץ. דגירה ההשעיה 1 דקות בטמפרטורת חדר לפני שמסתובב שוב ל7 דקות ב 300 גרם x. בבקבוק תרבות 150 מ"ל, להוסיף מדיום תרבות תא סטרילי (395 בינוני מ"ל IMDM, 5 עט מ"ל / סטרפטוקוקוס, 100 FBS מ"ל) וזרע התאים.
  6. שנה בינונית ביום השני להסרת תאי nonadherent.
    1. לבצע שינויים בינוניים בכל יום שני ל2-3 שבועות עד שכמות תאים רצויה מתקבלת.
    2. לחלופין, להכין את biograft על ידי זרעing התאים על גבי המטריצה ​​המוצקה כנדרש, ותאר במקום אחר 3.
  7. היום של השתלת לב, להכין את התאים או לקצור את biograft רק לפני יישום epicardial.
    1. לאסוף את התאים באמצעות פתרון ניתוק תא Accutase. ספירת התאים. מלא צינור 1.5 מ"ל צנטריפוגות עם הנפח של השעיה תא מחושבת כדי להשיג כמות תאים רצויה. צנטריפוגה ל7 דקות ב XG 300 ולהסיר את supernatant.
    2. לחלופין, לקצור biograft מתרבית תאים בינוני, לשטוף בPBS סטרילי, ולשמור במדיום תרבות הטרי ללא סרום.

2 ראשית פתיחת בית החזה וLAD הקשירה

  1. לשקול את העכברוש. הפעל את כרית החימום על 37 מעלות צלזיוס. להרדים את העכברוש עם 5 isoflurane% ו -5 ליטר / דקת O 100% 2 בחדר אינדוקציה ל5-7 דק '. בצע קמצוץ הבוהן או זנב כדי לאשר הרגעה. מניחים את החולדה על כרית החימום.
  2. לצנרר את החיה עם 14קטטר iv G. חבר את הקטטר אינטובציה למכונת נשמת מכרסמים המתוכנת עבור חמצן 2.5 ליטר / דקה, isoflurane 2.5%, נפח של גאות ושפל של 2 מ"ל, ותדירות נשימה של 90 נשימות / דקה.
  3. הכן פתרון עצירות ב0.1 מ"ג / קילוגרם. הזרק תת עורי שליש מהפתרון. לגלח את החלק השמאלי של בית החזה. לחטא עם 1% תמיסת פולידין.
  4. לחתוך את העור בניצב לעצם החזה בחלל הצלע הרביעי. הפרד את 3 שכבות של שרירים בית חזה (pectoralis pectoralis גדול, עולה, ובית חזה אלכסוני חיצוני). פתח את חלל הצלע הרביעי (בין צלעות 4 ו -5).
  5. השתמש מפשק קטן כדי להפיץ את הצלעות וכדי לחשוף את הלב. פתח את קרום הלב בזהירות. אתר ולקשור קדמי עורק הכלל השמאלי יורדת (LAD) עם מ"מ 7.0 תפר 4 להלן אטריום.
  6. סגור את חלל הצלע עם שני תפרים באמצעות 3.0 תפרים. מקם שני התפרים proximally וdistally מעצם החזה. ראשית, tighten תפר דיסטלי. הצמד את צינורות פליטת ההנשמה למשך 2 שניות כדי לנפח את החזה ולהימנע מכל חזה אוויר. להדק את התפר השני. מקם את שכבות שרירי גב במקום (אין צורך בתפרים). סגור את העור עם תפר 5.0.
  7. לחטא את התפר עם 1% תמיסת פולידין. הזרק את שאר פתרון עצירות. כבה את מערכת ההרדמה. הסר קטטר אינטובציה.
  8. שמור את העכברוש בכלוב מתחת למנורה חמה ל1-2 שעות. שמור מדחום בכלוב ולשלוט במרחק בין המנורה החמה והכלוב על מנת למנוע התחממות היתר. להחזיר את העכברוש ביחידת IVC. הזרק 0.05-0.1 מ"ג / קילוגרם תת עורי הודעה עצירות -operatively כל שעה 6-12 ל48 שעות.

.3 Epicardial מנהל של Via טיפול פתיחת בית החזה שני

  1. חזור על שלבים 2.1-2.3.
  2. לחתוך את העור בניצב לעצם החזה בחלל הצלע החמישי. הפרד את השכבה 3(Pectoralis pectoralis גדול, עולה וpectoralis האלכסוני החיצוני) של השרירים בית החזה. פתח את חלל הצלע החמישי (בין צלעות 5 ו -6).
  3. השתמש מפשק קטן כדי להפיץ את הצלעות וכדי לחשוף את הלב. אם יש איזה דבקות, להסיר אותם בזהירות עם מלקחיים בסדר.
  4. אתר את אזור האוטם שמופיע כאזור חיוור מתחת למייתר. הערה: בעת צורך, להשתמש בפיסת 10 סנטימטר של תפר (7.0) הוכנסה בשיא לדמיין את החדר השמאלי טוב יותר. משוך בעדינות כדי התפר נשמר באופן רופף על ידי מהדק כדי לחשוף את הלב.
  5. ליישם את אחד מהטיפולים הבאים:
    1. מקם את biograft על פני השטח של הלב. השתמש במזרק איטום הפיברין prefilled prewarmed בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות. החל ירידה (50-100 μl) של חומר איטום הפיברין תחת biograft באמצעות מחט 25 G Luer. ודא שbiograft אטום בצורה מושלמת.
    2. לחלופין, להחיל את התא גלולה שנאסף עם קצה פיפטה בo המשטחf הלב על האזור החיוור מתחת למייתר. החל ירידה (50-100 μl) של חומר איטום הפיברין על התא גלולה.
  6. הסר את פיסת התפר מהשיא.
  7. חזור על שלבים 2.6-2.8.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל בעלי החיים התאוששו בתוך שעה 1 לאחר thoracotomies. ריפוי הפצע היה מהיר. אין זיהום או בצקת נצפה.

פתיחת בית החזה הכפולה השמאלית אפשרה גישה אופטימלית ללב (איור 1). כאב ותמותה לאחר הניתוח היו נמוכים. בעלי החיים התאוששו במהירות מהניתוח ועלו במשקל (איור 2). אחוזים הישרדות קפלן מאיר היו 96% לפתיחת בית החזה הראשון. ארבעה עכברושים מעל 104 מתו בתוך יישום הטיפול הבא 24 שעות באמצעות

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קשירת הקבע של LAD גורמת לפגיעה בשריר הלב בלתי הפיכה. מודל החיה הראשון תואר בשנת 1960 4. מאז, זה כבר נחשב כמודל סטנדרטי ומתאים לMI הכרוני. היציבות והשחזור שלה אפשרו הערכה ניסיונית של טיפולים לMI 5. נהלים משופרים הבאים התיאור הראשוני דיווחו על שיעור תמותה ניתוחי של 35-13% 6.

כצפוי, קשירת LAD מושרה תפקוד לב לקוי נצפה בתוך 2 שבועות. ירידה נוספת בתפקוד לב נרשמה עד 6 שבועות וקשורים עם צ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים פרופ 'הנדריק Tevaearai והמחלקה לכירורגיה לב וכלי דם לתמיכה כספית לחלק הראשוני של המחקר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תפר פוליסורב 3-0CovidienUL 204
פוליסורב 5-0 תפרCovidienUL 202
Surgipro II 7-0 תפרCovidienVP904X
קטטר Insyte 14 GBD381267
Inspira מאוורר מבוקר נפח מתקדםמכשיר הרווארד557058
Dumont #7 מלקחייםFST גרמניה11274-20
איטום פיבריןבקסטר1501441דבק TISSEEL, קפוא -20 מעלות; C
Castroviejo עין ספקולההרווארד מכשיר72-8925להשתמש כמפסק לצלעות
IMDM GlutaMAXGibco31980
עט / סטרפטוקוקGibco15140
FBSPAA Clone          A15-101
מספריים לעצםכלי מדע עדינים16044-10
תמיסת ליזה של תאי דם אדומיםGentra SystemsD-50k1
פתרון ניתוק תאים Accutaseטכנולוגיית תאי גזע7920

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gjesdal, O., Bluemke, D. A., Lima, J. A. Cardiac remodeling at the population level--risk factors, screening, and outcomes. Nat. Rev. Cardiol. 8, 673-685 (2011).
  2. Alcon, A., Cagavi Bozkulak, E., Qyang, Y. Regenerating functional heart tissue for myocardial repair. Cell Mol. Life Sci. 69, 2635-2656 (2012).
  3. Guex, A. G., Fortunato, G., Hegemann, D., Tevaearai, H. T., Giraud, M. N. General Protocol for the Culture of Cells on Plasma-Coated Electrospun Scaffolds. Methods Mol. Biol. 1058, 119-131 (2013).
  4. Selye, H., Bajusz, E., Grasso, S., Mendell, P. Simple techniques for the surgical occlusion of coronary vessels in the rat. Angiology. 11, 398-407 (1960).
  5. Gomes, A. C., Falcao-Pires, I., Pires, A. L., Bras-Silva, C., Leite-Moreira, A. F. Rodent models of heart failure: an updated review. Heart Fail. Rev. 18, 219-249 (2013).
  6. Horstick, G., et al. Surgical procedure affects physiological parameters in rat myocardial ischemia: need for mechanical ventilation. Am. J. Physiol. 276, 472-479 (1999).
  7. Duchatelle, J. P., Vivet, P., Cortes, M., Groussard, O., Pocidalo, J. J. Respiratory and Hemodynamic-Effects of Lateral Thoracotomy or Sternotomy in Mechanically Ventilated Rats. Eur. Surg. Res. 17, 10-16 (1985).
  8. Giraud, M. N., et al. Hydrogel-based engineered skeletal muscle grafts normalize heart function early after myocardial infarction. Artif. Organs. 32, 692-700 (2008).
  9. Siepe, M., et al. Myoblast-seeded biodegradable scaffolds to prevent post-myocardial infarction evolution toward heart failure. J. Thorac. Cardiov. Sur. 132, 124-131 (2006).
  10. Guex, A. G., et al. Plasma-functionalized electrospun matrix for biograft development and cardiac function stabilization. Acta Biomater. 10, (2014).
  11. Terrovitis, J., et al. Noninvasive Quantification and Optimization of Acute Cell Retention by In Vivo Positron Emission Tomography After Intramyocardial Cardiac-Derived Stem Cell Delivery. J. Am. Coll. Cardiol. 54, 1619-1626 (2009).
  12. Guo, H. D., Wang, H. J., Tan, Y. Z., Wu, J. H. Transplantation of marrow-derived cardiac stem cells carried in fibrin improves cardiac function after myocardial infarction. Tissue Eng. Part A. 17, 45-58 (2011).
  13. Qiao, H., et al. Death and Proliferation Time Course of Stem Cells Transplanted in the Myocardium. Mol. Imaging Biol. 11, 408-414 (2009).
  14. Conradi, L., Pahrmann, C., Schmidt, S., Deuse, T., Hansen, A., Eder, A., et al. Bioluminescence Imaging for Assessment of Immune Responses Following Implantation of Engineered Heart Tissue (EHT). J. Vis. Exp. 52 (e2605), (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

LAD

מאמרים קשורים