הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מדידת pH בו זמנית בendocytic ותאי Cytosolic בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה confocal

14.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51395

⸱

28 באפריל 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Faculty of Medicine and Health Sciences, Université de Sherbrooke, 2Biophotonics Core Facility, Centre de Recherche Clinique Etienne-Le Bel

במאמר זה

סיכום

קיימות מספר שיטות למדידת pH תוך-תאי, אך מעט מאוד מהן מאפשרות מדידה בו זמנית של pH ציטופלזמי ואורגנלרי. כאן, אנו מתארים בפירוט מתודולוגיה מהירה ומדויקת למדידת pH ציטופלזמי ושלפוחית בו זמנית על ידי הדמיה רציומטרית של תאים חיים.

תקציר

pH התוך תאי מווסת היטב ודווח על הבדלים ב-pH בין הציטופלזמה לאברונים1. ויסות ה-pH התאי חיוני לבקרה הומאוסטטית של תהליכים פיזיולוגיים הכוללים: סינתזת חלבון, DNA ו-RNA, סחר שלפוחית, צמיחת תאים וחלוקת תאים. שינויים בהומאוסטזיס pH תאי עלולים להוביל לשינויים תפקודיים מזיקים ולקדם התקדמות של מחלות שונות2. קיימות שיטות שונות למדידת pH תוך תאי, אך מעט מאוד מהן מאפשרות מדידה בו זמנית של pH בציטופלזמה ובאברונים. כאן, אנו מתארים בפירוט שיטה מהירה ומדויקת למדידה בו זמנית של pH ציטופלזמי ואורגנלרי באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית על תאים חיים3. מטרה זו מושגת על ידי שימוש בשני צבעים יחסיים עם חישת pH בעלי חלוקה סלקטיבית של תאים סלולריים. לדוגמה, SNARF-1 ממודר בתוך הציטופלזמה ואילו HPTS ממודר בתוך אברונים אנדוזומליים/ליזוזומליים. למרות ש-HPTS משמש בדרך כלל כאינדיקטור pH ציטופלזמי, צבע זה יכול לתייג באופן ספציפי שלפוחיות לאורך המסלול האנדוזומי-ליזוזומלי לאחר שנקלט על ידי פינוציטוזיס3,4. באמצעות בדיקות חישת pH אלה, ניתן למדוד בו זמנית pH בתוך התאים האנדוציטיים והציטופלזמיים. אורך גל העירור האופטימלי של HPTS משתנה בהתאם ל-pH ואילו עבור SNARF-1, אורך גל הפליטה האופטימלי הוא שמשתנה. לאחר העמסה עם SNARF-1 ו-HPTS, התאים מתורבתים בתמיסות שונות מכוילות pH כדי לבנות עקומת pH סטנדרטית עבור כל בדיקה. הדמיית תאים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית מאפשרת ביטול חפצים ורעשי רקע. בגלל התכונות הספקטרליות של HPTS, בדיקה זו מתאימה יותר למדידת התא האנדוזומי החומצי הקל או להדגמת אלקליניזציה של האברונים האנדוזומליים/ליזוזומליים. שיטה זו מפשטת את ניתוח הנתונים, משפרת את הדיוק של מדידות ה-pH וניתן להשתמש בה כדי לענות על שאלות בסיסיות הקשורות לאפנון pH במהלך תגובות התאים לאתגרים חיצוניים.

פרוטוקול

1. הכנה של פתרונות לסלולריים pH כיול

  1. הוסף את התרכובות הבאות לחמישה צינורות נפרדים 50 מיליליטר חרוטי להכין פתרונות 5 לשמש לכיול:
    • NaCl (1 מיליליטר של 1 M NaCl) (1 M NaCl = 0.58 גרם ב10 H מיליליטר 2 0)
    • KCl (6.75 מיליליטר של 1 M KCl) (1 M KCl = 0.75 גרם ב10 H מיליליטר 2 0)
    • גלוקוז (1 מיליליטר של 1 M D-גלוקוז) (1M D-גלוקוז = 1.80 גרם ב10 H מיליליטר 2 0)
    • MgS0 4 (0.05 מיליליטר של 1 M MgSO 4) (1 M MgSO 4 = 1.20 גרם ב10 H מיליליטר 2 0)
    • 20 HEPES מ"מ (1 מיליליטר של 1M HEPES) (1 M HEPES = 2.38 גרם ב10 H מיליליטר 2 0)
    • CaCl 2 (0.05 מיליליטר של 1M CaCl 2) (ז גרם CaCl 2 = 1.47 1 ב10 H מיליליטר 2 0)
      הכן את כל הפתרונות במזוקקים H 2 O (DDH 2 O) הכפול.
  2. להשלים כל פתרון עם 35 מיליליטר של DDH 2 O ולערבב עם בוחש מגנטי עד כהlution מושגת.
  3. התאם את ה-pH של כל פתרון עם 1 N KOH או 1 N HCl להשיג ערכי ה-pH של 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 ו7.5. לאחר מכן, להתאים את עוצמת הקול עם מים deionized נפח סופי של 50 מיליליטר.
  4. מדד 5 מ"ג של nigericin ולהוסיף אותו ל670 μl של EtOH המוחלט להכין 10 מ"מ nigericin פתרון מניות.
    זהירות: nigericin הוא רעיל מאוד ויש לטפל בם בזהירות רבה (כפפות, משקפי מגן ומסכה). מערבבים את הפתרון על ידי היפוך עד nigericin הוא נמס לגמרי.
  5. הוספת 0.05 מיליליטר של 10 מ"מ nigericin (ריכוז סופי 10 מיקרומטר) לכל פתרון כיול. Nigericin הוא ionophore שמגביר את חדירות קרום תא וגורם לאיזון של רמת חומציות תוך תאית וחוץ תאי בנוכחות ריכוז depolarizing של תאי K +.
  6. ניתן לאחסן את פתרונות כיול לחודש 1 על 4 מעלות צלזיוס

2. הכנת תא

  1. תחת safet ביולוגימכסה המנוע y, תאי זרע ב35 מ"מ מנות תרבות x 10 מ"מ 2 מיליליטר של מדיום גידול בתוספת 10% בסרום שור עוברי ואנטיביוטיקה. השתמש בכמות התאים הדרושה כדי להבטיח מפגש 50 כ% לאחר 24 שעות.
    הערה: בניסויים שלנו, אנו משתמשים בקו HT-1080 התא וצלחת 1 x 10 5 תאים לכל צלחת תרבות.
  2. לקבוע את מספר מנות התרבות הדרושה לניסוי וצלחת 5 מנות תרבות נוספות שמשמש לכיול.
  3. מנות תרבות המקום בC / 5% CO 2 באינקובטור 37 מעלות לפחות 24 שעות.

3. הכנת בדיקות pH חישה

  1. הכן פתרון מניות 1M של חללית ה-pH ניאון 8-hydroxypyrene-1, 3,6 חומצת trisulfonic, מלח trisodium (HPTS / pyranine) בDDH 2 0. פתרון זה חייב להיות מאוחסן ב RT ומוגן מפני אור.
  2. הכן פתרון מניות של 1 מ"מ 5 - (ו- 6)-carboxyl seminaphthorhodafluor acetoxymethyl אסטר אצטט (C-snarf-1 בבוקר, נקרא thereaחרי snarf-1) על ידי המסת 1 מ"ג של snarf-1 ב1.76 מיליליטר של DMSO. לערבב ביסודיות על ידי pipetting חוזר ונשנה. פתרון snarf-1 חייב להיות מאוחסן ב-20 מעלות צלזיוס ומוגנת מפני אור.

4. תיוג תא

  1. שישה עשר שעות לפני ההדמיה לחיות תאים, להוסיף 2 μl של פתרון מניות 1M HPTS (ריכוז סופי 1 מ"מ) לכל מנה תרבות המכילה 2 מיליליטר של מדיום שלם.
  2. להחזיר את הכלים התרבות לחממה. הבדיקה HPTS היא תא impermeant, ולכן לתווית האברונים הבדיקה חייבת להיות נלקחת על ידי pinocytosis. מצב זה מחייב את incubations תא עם HPTS מבוצע במדיום תרבות, בתוספת סרום.
  3. לאחר דגירה עם HPTS, לשטוף את התאים פעמיים עם PBS סטרילי ולהוסיף 2 מיליליטר של מדיום סרום ללא לפחות 2 שעות. דגירה עם snarf-1 צריכה להתבצע במדיום סרום ללא בגלל סרום עלול למנוע הספיגה של החללית.
  4. הוסף 10 μl של פתרון מניות snarf-1 1 מ"מ להשיג afריכוז inal של 5 מיקרומטר ולאפשר לתאי דגירה של 20 דקות על 37 מעלות צלזיוס, באור עמום. ריכוז C-snarf-1 וזמן דגירה יכולים להשתנות בהתאם לסוג תא.
  5. בסוף הדגירה, לשטוף תאי פעמים PBS סטרילי ולהוסיף 2 מיליליטר של מדיום ללא סרום.

5. תוספת של מאפנני pH

  1. על מנת להעריך האם השיטה יכולה לזהות שינויי pH בתאים, חומרים כימיים שונים המווסתים pH תאיים ניתן להשתמש:
    • Bafilomycin A1, מעכב ספציפי של V-ATPase 5
    • איזופורם מחליף Na + / H + 1 (NHE-1) 6
    • NH 4 Cl, בסיס חלש, שמגביר את רמת חומציות תוך תאית 7
    1. הכן פתרונות מניות של חומרים כימיים שהוזכרו לעיל:
      • Bafilomycin A1: להוסיף 10 מיקרוגרם של bafilomycin A1 ל160 μl של DMSO להשיג פתרון מניות של 100 מיקרומטר
      • EIPA: להוסיף 25 מ"ג EIPA ל1.67 מיליליטר של מתנול לobtaiריכוז סופי na של 50 מ"מ
      • NH 4 Cl: לפזר 0.53 גרם של אמוניום כלוריד ב10 מיליליטר של DDH 2 O להשיג ריכוז סופי של 1 מ"מ.

      הערה: כל פתרונות המניות חייבים להישמר על 4 מעלות צלזיוס למעט A1 bafilomycin אשר חייב להיות מאוחסן ב-20 מעלות צלזיוס ומוגנות מפני אור.
    2. בתרבות מנות נפרדות, מוסיף אחד מהחומרים הכימיים כמפורט להלן:
      • 2 μl של 100 bafilomycin מיקרומטר A1 (ריכוז סופי 100 ננומטר)
      • 1 μl של 50 מ"מ EIPA (מיקרומטר ריכוז 25 הסופי)
      • 40 μl של 1M 4 Cl NH (ריכוז סופי 20 מ"מ)
    3. דגירה התאים למשך 30 דקות ב37 ° C.
  2. המשך לרכישת תמונה.

6. מפרט של מיקרוסקופ Live-תא ההדמיה והגדרות רכישה

  1. לבצע הדמיה לחיות תאים באמצעות מטרת 40X רכוב על microsco סריקה הפוכה רפאים confocalpe מצויד בשלב XY ממונע, חדר שיכול להכיל מנות תרבות תחתית זכוכית בחממת במה (טמפרטורה, לחות, CO 2) מבוקרת לסביבה.
  2. מכשיר confocal (אולימפוס FV1000) משמש כאן מצויד ב:
    • ננומטר 405 לייזר דיודה
    • לייזר ארגון 40 mW (458 ננומטר, 488 ננומטר, 515 ננומטר)
    • לייזר ניאון הליום (543 ננומטר)
    • מטרת פלואוריט 10X, NA0.4
    • מטרת LUCPLFLN 40X, NA0.60
    • מטרת שמן PLAPONSC תכנית APO 60x, NA1.4
    • DM מראה dichroic 405/458/488/543
    • SDM 560 וSDM 640 מסננים dichroic
    • מסנן מחסום BA655-755
    • BS20/80 מפצל קרן
    • תוכנה לניתוח נתונים לרכישת תמונה וניתוח,
  3. ברגע חממת השלב התחממה ל37 מעלות צלזיוס ומיקרוסקופ מוגדר, מניח צלחת תרבות מודגרות בעבר עם HPTS וsnarf-1 לחדר ההדמיה שלב confocal.
  4. חרי איתור שטח של עניין, התאם את הגדרות רכישת תוכנת איור 1.
    • הגדר את שני סטי ערוץ וירטואליים.
    • ליזום את השלב הראשון שמתאים לעירור HPTS ב405 ננומטר ואוסף פליטה ב 505-525 ננומטר ועירור snarf-1 ב543 ננומטר ואוסף פליטה ב 570-600 ננומטר.
    • ליזום את השלב השני שמתאים לעירור HPTS ב458 ננומטר ואוסף פליטה ב 505-525 ננומטר ועירור snarf-1 ב543 ננומטר ואוסף פליטה ב 640-650 ננומטר.
    • צמצם confocal מוגדר 175 מיקרומטר כברירת מחדל וצמצם אופטימלי צריך להיות מוגדר באופן ידני ב300 מיקרומטר.
    • קח את התמונה על ידי ערמת חלקים סידוריים אופקיים אופטיים (800 800 פיקסלים) של 0.4 מיקרומטר עובי.

הערה: מטרת 40X היא שימושית כדי לבחון כמה תאים בו זמנית ועובדת היטב לצפייה אברון. עם זאת, ברזולוציה מרחבית ועוצמת אות הן בטr המושג באמצעות אובייקטיבי שמן 60x. בנוסף, אין שום עירור או פליטת הצטלבות בין שני הצבעים.

7. כיול של בדיקות pH חישה

  1. לפני הכיול, להסיר בינוני ממנת התרבות מודגרות בעבר עם HPTS וsnarf-1, לשטוף פעמיים עם PBS סטרילי ולאחר מכן להוסיף 2 מיליליטר של אחד מפתרוני הכיול חמש.
  2. מניחים את צלחת התרבות לתוך תא שלב confocal.
  3. המשך לרכישת הזמן לשגות תמונה בהתאם להגדרות הבאות:
    1. הגדר את מספר התמונות ופעמים משך מרווח לניסוי.
      הערה: אנו משתמשים בדרך כלל מרווח 1 דקות בין תמונות עד 30 דקות.
    2. לתכנת את התריס כדי לסגור בין הרכישה של כל תמונה.
  4. רשום את עוצמת הקרינה לדקות בתוכנת גיליון אלקטרוני ולקבוע את הזמן שבו עוצמת הקרינה היא יציבה. ה-pH תאיים היא בדרך כלל יציבה לאחר 15-20 דקות.
  5. REPEAT צעדים 7.1-7.4 באמצעות צלחת תרבות חדשה עבור כל פתרון כיול הנותר.

8. רכישת נתונים

  1. ברגע שהכיול נעשה, לרכוש נתונים לדוגמה 4-5 שדות שנבחרו באקראי המכילים 15-20 תאים לכל תחום. שתי תמונות מתקבלות עבור כל שדה: אחד לתיוג HPTS (שלפוחית) והשני עבור תיוג snarf-1 (cytosol).
  2. הקרינה רקע (אזור תאי) היא הופחתה באופן דיגיטלי מתמונות ניאון של שני הבדיקות. שלפוחית ​​שהכותרת וcytosol מהתמונות המאוחסנות שלהם נבחרו באמצעות מסיכה בינארי. עבור כל בדיקה pH חישה, עוצמות הקרינה נמדדות בקנה מידה מספרי (0-4,095 קנה מידה ברמה אפורה). עוצמה ממוצעת של כל הפיקסלים באברון או ציטופלסמה מחושבת וערכים משמשים לחישוב יחס הקרינה.

9. ניתוח נתונים

  1. חבילות תוכנה שונות זמינות באופן מסחרי לניתוח נתונים. כלומרתוכנת FluoView.
  2. בגיליון אלקטרוני, ערכי שיא ולחשב יחס הקרינה באופן הבא: במקרה של HPTS, R = (F 458 ננומטר / F 405 ננומטר), ובמקרה של snarf-1, R = (ננומטר F 644 ננומטר / F 584 ).
  3. להתוות את הנתונים באמצעות תוכנת גרפים מדעית כגון GraphPad פריזמה. העלילה צריכה לשרטט יחסי הקרינה (ציר ה-Y) כפונקציה של ה-pH (ציר ה-X). התאמת עקומות מושגת באמצעות רגרסיה שאינה ליניארי.
  4. לאסוף עוצמות הקרינה של הדגימות כמתואר בשלב 8.2 ולחשב יחס הקרינה. השתמש עקומות כיול להפוך יחסים לערכי ה-pH.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

למדידה בו זמנית של ה-pH בשני תאית ותאי תאי endosomal / lysosomal, בדיקות ratiometric ניאון pH חישת snarf-1 וHPTS היו בשימוש. Snarf-1 מוגבל לתא cytosolic אילו HPTS מאפשר מדידת pH ratiometric של תא endosomal / lysosomal. תא טעינה עם HPTS ל16 שעות מאפשרת הלוקליזציה סלקטיבית שלה בendosomes / lysosomes 4. דוגמא אופיינית של הקרינה נרשמה מתאי HT-1080 עמוסים בבדיקות pH חישה מוצגת באיור 2 א. ראיות לכך שHPTS תוויות תאי שני endosomal וlysosomal הושגו על ידי שיתוף ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

יש צורך במדידת pH כמותי בתחום ההדמיה לחיות תאים של תאים סלולריים שונים כדי למדוד במדויק את שינויי ה-pH בתגובות תא לאתגרים חיצוניים. עם זאת, אחד המכשולים העיקריים שנותר הוא בקלות ובאופן ספציפי כדי למקד את התאים סלולריים. מבחינה זו, מספר מחקרים הדגישו את השימוש בHPTS כאינדיקטור pH תאיים שהוכנס לתאים על ידי electroporation או microinjection 8-10. טכניקות אלה סובלות מחסרונות רציניים, כלומר electroporation גורם לניזקים רבים לתאים, וmicroinjection דורש ציוד מיוחד וכישורים טכנ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

תודות

אנו מודים לד"ר ז'יל דופואה על הקריאה הביקורתית של כתב היד.

מימון

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הקנדיים לחקר הבריאות, מענק # MOP-126173. C.M.D הוא חבר ב-Fonds de la Recherche en Santé (FRSQ) הממומן על ידי Centre de Recherche Clinique Étienne LeBel.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פתרונות לכיול
נתרן כלוריפישרL-11621
אשלגן כלוריפישרM-12445
D-גלוקוז (דקסטרוז)פישרD16-1
מגנזיום גופרתיפישרM65-500
HEPESסיגמא-אולדריץ'H3375
סידן כלוריד דיהידראטפישרM-1612
מים נטולי יוניםN/AN/A
ניגריציןCalbiochem481990רעיל בשאיפה או במגע עם העור
שמור מוגן מפני האור בטמפרטורה של 4 מעלות;
צלחות תרבית C וריקות 35 מ"מBD Biosciences354456
חישת pH
8-הידרוקסיפירן-1,3,6-חומצה טריסולפונית (HPTS)טכנולוגיות חייםH-348הרחק מהאור בטמפרטורת החדר
5-(ו-6)-Carboxy SNARF®-1, אצטוקסימתיל אסתר, אצטטטכנולוגיות חייםC-1271הרחק מהאור והלחות ב-20 מעלות; C
דימתיל סופוקסיד (DMSO)פישרBP231-1 מזיק
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) 100X
אשלגן כלוריפישרM-1244520 גרם
נתרן פוספט מונו-בסיסיפישרS369-1115 גרם
אשלגן פוספט מונו-בסיסיJ.T Baker3246-0120 גרם
מים נטולי יוניםN/AN/Aהביאו ל-1 ליטר
חיטוי והתאימו את ה-pH ל-7.4
מי מלח חוצץ פוספט (PBS) 1X
PBS 100XN/AN/A50 מ"ל
נתרן כלוריפישרL-1162140.5 גרם
מים נטוליN/AN/Aהביאו ל-5 ליטר
מאפנני
Bafilomycin A1Sigma-AldrichB-1793
5-(N-Ethyl-N-isopropyl) אמילוריד (EIPA)סיגמא-אולדריץ'A3085
אמוניום כלורידפישרA649-500
בדיקות מים pH

מקורות

  1. Demaurex, N. pH Homeostasis of cellular organelles. News Physiol Sci. 17, 1-5 (2002).
  2. Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression. Nat Rev Cancer. 11, 671-677 (2011).
  3. Hinton, A., et al. Function of a subunit isoforms of the V-ATPase in pH homeostasis and in vitro invasion of MDA-MB231 human breast cancer cells. J Biol Chem. 284, 16400-16408 (2009).
  4. Overly, C. C., Lee, K. D., Berthiaume, E., Hollenbeck, P. J. Quantitative measurement of intraorganelle pH in the endosomal-lysosomal pathway in neurons by using ratiometric imaging with pyranine. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 3156-3160 (1995).
  5. Drose, S., Altendorf, K. Bafilomycins and concanamycins as inhibitors of V-ATPases and P-ATPases. J Exp Biol. 200, 1-8 (1997).
  6. Pedersen, S. F., King, S. A., Nygaard, E. B., Rigor, R. R., Cala, P. M. NHE1 inhibition by amiloride- and benzoylguanidine-type compounds. Inhibitor binding loci deduced from chimeras of NHE1 homologues with endogenous differences in inhibitor sensitivity. J Biol Chem. 282, 19716-19727 (2007).
  7. Alfonso, A., Cabado, A. G., Vieytes, M. R., Botana, L. M. Calcium-pH crosstalks in rat mast cells: cytosolic alkalinization, but not intracellular calcium release, is a sufficient signal for degranulation. Br J Pharmacol. 130, 1809-1816 (2000).
  8. Han, J., Burgess, K. Fluorescent indicators for intracellular pH. Chem Rev. 110, 2709-2728 (2010).
  9. Giuliano, K. A., Gillies, R. J. Determination of intracellular pH of BALB/c-3T3 cells using the fluorescence of pyranine. Anal Biochem. 167, 362-371 (1987).
  10. Willoughby, D., Thomas, R., Schwiening, C. The effects of intracellular pH changes on resting cytosolic calcium in voltage-clamped snail neurones. J Physiol. 530, 405-416 (2001).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

pHHPTSSNARF 1pH
מדידת pH בו זמנית בendocytic ותאי Cytosolic בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה confocal
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.