מאמר שיטה

אפיון תאי גזע עוברי האנושי על ידי הפרט כמותי RT-PCR

DOI:

10.3791/51408

⸱

29 במאי 2014

 ,  , 
1Institute for Cell Engineering, Department of Neurology and Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

assay ביטוי גני תא הבודד שדרוש להבנת heterogeneities בתאי גזע.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההטרוגניות של אוכלוסיית תאי גזע פוגעת בהבנה מפורטת של ביולוגיה של תאי גזע, כגון הנטייה הבידול שלהם כלפי שושלות שונות. Assay transcriptome התא בודד יכול להיות גישה חדשה ללנתח וריאציה בודדת. פיתחנו שיטת qRT-PCR תא הבודד, ואישרתי כי שיטה זו עובדת היטב במספר פרופילי ביטוי גנים. ברמת תא בודדת, כל תא גזע עוברי אנושי, מסודרים על ידי Oct4 :: תאים חיוביים EGFP, יש ביטוי גבוה בOct4, אבל רמת ביטוי Nanog שונה. assay הביטוי שלנו בודד גן התא צריך להיות שימושי לחקור heterogeneities אוכלוסייה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אוכלוסיות eukaryote רוב גבוהות יותר הן הטרוגנית וכך עם ניתוח של אוכלוסייה נקוותה, הוא לעתים קרובות קשה לפרש תכונות הסלולריות שלהם. תאים בודדים בתוך אוכלוסייה עשויים להיות מעט שונים, והבדלים אלה יכולים להיות השלכות חשובות עבור הנכס והתפקוד של כל האוכלוסייה 1, 2. במיוחד, תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ידועים להיות הטרוגניות, מה שגורם לרמות שונות של pluripotency ופוטנציאלים מגוונים למפרט שושלת בעדינות דרכים ייחודיות 3, 4. לדוגמא, ניתן להשתמש בם פני השטח אנטיגנים תא שונים כדי לסווג את תאי גזע pluripotent מובחנים, 5 וקבוצת אוסטין סמית מוצעת רמות שונות של pluripotency בתאי גזע העובריים של עכברים, המבוססים על המורפולוגיה, הנטייה והתלות של מסלול איתות 6 הבידול שלהם. תופעה זו הייתה שיערו בעובר אנושיתאי גזע NIC 7. בעוד שהמחקרים הכוללים בוצעו בין קווים שונים בתאי גזע, ולא בתאי גזע אחד בודדים, זה יכול להיות מאוד מעניין לנתח את הרמות של pluripotency שונים ברמת התא הבודד, אשר באופן פוטנציאלי משפיעה על יכולות ההבחנה שלהם כלפי כל שושלות התאים סומטיים.

הטרוגניות תאית ומולקולרית יכולה להיות מוכתבת על ידי פרופיל שעתוק, אשר נקראה "transcriptome התא הבודד 'ומדגישה גישות חדשות לכימות רמות ביטוי הגנים 8-10. לניתוח של רמות ביטוי הגנים בתאים בודדים, פיתחנו פרוטוקול פשוט, אבל חזק של תא הבודד RT-PCR. אנחנו אישרו את היעילות ואת הכדאיות של הפרוטוקול שלנו על ידי השוואת כל מחצית lysates תא הבודד, כמו גם RNAs הכולל דילול סדרתי של hESCs, וכתוצאה מוריאציות טכניות מינימליות והבדלים. יתר על כן, אנו משמשים קו כתב גנטי לבודד עמ הומוגניתopulation של hESCs באמצעות מערכת מיקוד גן. הווקטור התורם למיקוד לוקוס Oct4 (Oct4-2A-EGFP-PGK-Puro לבנות) וזוג פלסמידים Talen שימש 11. וקטור התורם וזוג פלסמידים Talen הוכנסו hESCs (H9, WA09) באמצעות nucleofection ופרוטוקול בחירה משובט והתחזוקה של hESCs בוצע על בסיס פרוטוקול השגרה שלנו 12. אנחנו אישרו שורת כתב זה גנטי לבטא EGFP לביטוי Oct4 בOct4 :: EGFP hESCs.

התוצאה שלנו מוכיחה כי hESCs הבודד (מסודרים על ידי Oct4 :: תאים חיוביים מאוד EGFP) להחזיק רמות גבוהות של ביטוי Oct4, אבל רמות של ביטוי Nanog שונות. לכן, assay הביטוי שלנו בודד גן התא צריך להיות שימושי ללמוד heterogeneities אוכלוסייה של תאי גזע pluripotent.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת פלייט 96 היטב

  1. מערבבים 1 μl של תא בודד DNase1 לתא בודד 9 μl תמוגה פתרון.
  2. שים את הפתרון מעורב 10 μl בכל טוב של 96 היטב צלחת ה-PCR.

2. ניתוק hESCs לטיהור FACS

  1. ניתוק Oct4 :: שורת תאי EGFP ES מצלחת 60 מ"מ עם 1 מיליליטר Accutase עבור 20 דקות, על 37 מעלות צלזיוס, שנוטרלו עם תקשורת ES אנושית.
  2. הכן את אוכלוסיית תאים ב 1 מיליליטר FACS חיץ ולהתאים את התא ל1 x 10 6 תאים / מיליליטר.
  3. להעביר את דגימת התא דרך צינור כובע מסננת תא 35 מיקרומטר.
  4. אחסן את הצינור בקרח לפני מיון תא.

3. תמוגה של תא בודד מטוהר-FACS בבאר כל הצלחת 96 היטב

  1. מיין את המדגם עבור תאים חיוביים EGFP על סדרן תא עם מפעיל מיומן. שים את התא הבודד לפתרון Lysis/DNase1 תא בודד בצלחת PCR 96 היטב. במידת צורך, 9צלחת 6 היטב עם מדגם יכולה להיות מאוחסנת ב-80 ° C מקפיא עמוק פחות מחודש.
  2. דגירה דגימות 5 דקות ב RT לתמוגה תא.
  3. הוסף 1 μl של להפסיק פתרון כדי לעצור את תגובת תמוגה.
  4. דגירה 2 דקות ב RT.

4. הפוך תמלול

  1. הוסף לכל aliquot 0.5 μl של 20 מיקרומטר SMA-T15, SMA-.
  2. הוסף 4 μl חיץ 5X, 2 μl DTT, μl ההפוך transcriptase 1, וdNTP μl 1 היטב כל אחד.
  3. לבצע שעתוק לאחור בCycler תרמית.
    1. הגדר את תכנית התרמית על 42 מעלות צלזיוס × 90 דקות ולהשבית טרנסקריפטאז הפוך על 85 מעלות צלזיוס × 5 דקות.

5. הגברה

  1. הוסף 4 μl של מגיב ExoSAP-IT לכל דגימה עיבד הפוך.
    1. דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ו80 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי להשבית מגיב ExoSAP-IT.
  2. הכן תערובת תגובת PCR wה-i SMA-P2 (2 ננומטר)
  3. הוסף 10 μl של תערובת תגובת PCR לכל דגימה הפוכה עיבד.
  4. לבצע את ההגברה, בהיקף של 20 מחזורים של denaturation (94 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות), חישול (57 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות), וסיומת (68 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות).

6. QRT-PCR ביצועים

  1. הוסף 10 μl של 2X SYBR גרין PCR מיקס מאסטר, 1 μl cDNA הגברה, 2 פריימרים ננומטר, ו7 מים μl היטב כל אחד.
    1. להגדיר את התכנית ואחרי 95 מעלות צלזיוס במשך 3 שניות, C ° 60 ל30 שניות x 40 מחזורים.
  2. לבצע בשני עותקים לטעויות טכניות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הגברה RNA התא בודדת יעילה וחזקה

כדי לצמצם את השוני בין תעתיק hESCs, השתמשנו Oct4 :: שיבוט EGFP hESC לטיהור FACS. לאחר מיון Oct4 :: תאים חיוביים EGFP לתוך צלחת 96 היטב, כל תא הוא lysed במאגר תמוגה והמיר פולי (א) + RNA לcDNA באורך מלא באמצעות פריימר SMA-T15 (GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT) ועיגון עם SMA-(ACATGTATCCGGATGTGGG ) על ידי שימוש בטכנולוגית מיתוג תבנית SMART. ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרופיל גנטי תא בודד יכול להיות כלי עיקרי לחזות את הפונקציונליות של תא בודד או אוכלוסייה שלמה. עקב מגבלות טכניות, ניתוח פרופיל הגנטי כולו הוגבל לממוצע אוכלוסייה. שינויים בדפוסי ביטוי גנים והרמות בין תאים הבודדים והאוכלוסיות הוצעו לגרום לפרשנות מוטעה. ניתן למצוא היבטים תאיים מגוונים כגון בhESCs וההטרוגניות שלהם גורמת ליכולת שונה בעדינות לשמירה על pluripotency ותהליך מפרט גורל.

פיתחנו ומאומתים על כמותיים תא בודד RT-...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש המחברים אין לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו רוצים להודות לחברים במעבדה לי לדיונים חשובים על כתב היד. עבודה במעבדה לי נתמכה על ידי מענקים מרוברטסון פרס חוקר של קרן לתאי גזע בניו יורק וממרילנד לתאי גזע למחקר קרן (TEDCO).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
96 בארות PCR צלחתארה"ב מדעית1402-8900
אמביון תאי ליזה ערכתLife Technologies4458235
SMARTScribe Reverse TranscriptaseClonetech639536
ExoSAP-ITUSB78200
פלטינה Taq DNA פולימראז High FidelityInvitrogen11304
10 מ"מ dNTP MixPCR כיתהInvitrogen18427
SYBR אוניברסלי 2X Master MixKapa biosystemKR0389
AccutaseInnovative Cell TechS-1100-1
FACS מאגר45 מ"ל PBS, 5 מ"ל AMEM, 100 μ l DNase, פילטר מעוקר
35 μ צינורות כובע מסננת תאים m BDBiosciences352235

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog. Nature. 483, 470-473 (2012).
  2. Leitch, H. G., et al. Embryonic germ cells from mice and rats exhibit properties consistent with a generic pluripotent ground state. Development. 137, 2279-2287 (2010).
  3. Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30, 777-782 (2012).
  4. Stewart, M. H., et al. Clonal isolation of hESCs reveals heterogeneity within the pluripotent stem cell compartment. Nat Methods. 3, 807-815 (2006).
  5. O'Malley, J., et al. High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells. Nature. 499, 88-91 (2013).
  6. Nichols, J., Smith, A. Naive and primed pluripotent states. Cell Stem Cell. 4, 487-492 (2009).
  7. Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).
  8. Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods. 5, 621-628 (2008).
  9. Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).
  10. Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
  11. Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).
  12. Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
  13. Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. Reverse transcriptase template switching: A SMART (TM) approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques. 30, 892-897 (2001).
  14. Pan, X. H., et al. Two methods for full-length RNA sequencing for low quantities of cells and single cells. P Natl Acad Sci USA. 110, 594-599 (2013).
  15. Tang, F. C., et al. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

qRT PCROCT4 EGFP

מאמרים קשורים