הפעלת ניטור של התבנית אנטי רצפטורים ההכרה RIG-I ו PKR ידי מוגבל פרוטאז עיכול ועמוד Native

אירוע מכריע בהגנת מארחת נגיפים הוא האיתור המהיר של הפתוגן על ידי קולטנים שנקרא זיהוי תבניות (PRRs) ^1,2. איתור תאיים של זיהום בנגיף RNA תלוי בשני helicases cytoplasmic RNA, RIG-I (אני גן מושרה חומצה רטינואית) וMDA5 (חלבון בידול מלנומה קשור 5) ^3-5. RIG-מורכב משני תחומים N-מסוף גיוס caspase (כרטיסים), תחום helicase RNA סוג DECH התיבה מרכזי, ותחום בטרמינל C-(CTD) ^4,6. ואילו CTD ותחום helicase נדרשים להכרה של RNAs אינו עצמי (ויראלי), הכרטיסים לתווך איתות במורד הזרם שתוביל להקמת מעמד מארח אנטי.

אם RIG-אני נמצא במצב השקט, כלומר בהיעדר ליגנד RNA ספציפי, הכרטיס השני אינטראקציה עם תחום helicase המרכזי ושומר RIG-I בקונפורמציה אוטומטית מעכבת ^7-11. RIG-I נקשר קצר כפולגדיל RNA (DS) נושאות 5'-טריפוספט (5'PPP), dsRNA הארוך, ו-RNA PolyU / UC-עשיר, מבני חתימה קלאסיים אשר נמצאים בגנומים של וירוסי RNA רבים ^12-16. שני מאפיינים עיקריים של RIG-I הפעלה הם מעבר לקונפורמציה סגורה ^6,17 וההומו-oligomerization ^6,18,19. מתג קונפורמציה משפר RNA מחייב, חושף את הקלפים לאיתות במורד הזרם, וreconstitutes אתר ATPase פעיל ^8,9,11,20. היווצרות של קומפלקסי RIG-I oligomeric מובילה לגיוס מוגבר של מולקולות איתות במורד הזרם מתאם כדי ליצור פלטפורמה להעברת אותות אנטי ^11. שרשרת האיתות המוסדרת RIG-סופו של דבר מפעילה את גורם שעתוק IRF-3 לעד ויסות של אינטרפרון גנים (IFN-alpha/beta) ומכאן ביטוי גנים של גנים אינטרפרון מגורה (ISGs) לתגובה אנטי מלאה ^21,22 . אחד ISGs המאופיין ביותר הוא protei מופעל RNAקינאז n (PKR) ^23. PKR שייך למשפחה של ייזום תרגום גורם 2 אלפא אוקריוטים קינאז (eIF2α) והוא מורכב מתחום N-מסוף פעמיים תקוע RNA מחייב ותחום קינאז C-מסוף. תחום קינאז מהווה ממשק dimerization חיוני להפעלת PKR ומבצע את הפונקציות הקטליטית של החלבון. עקידת PKR לdsRNA הנגיפי מובילה לשינוי קונפורמציה התרת dimerization והאוטומטי זירחון בThr 446 בין שאריות אחרות. PKR אז מתווך זירחון של eIF2α, ובכך חוסם את התרגום של mRNAs הנגיפי ^23-27.

שני RIG-I ו PKR לעבור שחלופים מבניים גדולים, יצירת קומפלקסי oligomeric והם פוסט translationally שונה על ידי זירחון / dephosphorylation וubiquitination ^{10,11,19,23,24,26-29.} להבנה טובה יותר של מבנים שרנ"א נגיפיים מפעילים RIG-I ו PKR (ובאיזה שלב יריבים נגיפיים יכולים bדואר להתערב), חשוב על מנת לקבוע את מצב ההפעלה בדיוק. עבור שניהם PRRs שתואר בעבר על כך שהפעיל גורם להופעתה של שברי טריפסין עמיד חלבון ^6,17,30 וoligomers מסדר גבוה ^6,18,19. עם זאת, בהתחשב בעושר של ספרות על גורמי מפתח אלה של תגובת המארח אנטי ^1,2,24, יישום של שיטות ישירות נראה יחסית נדיר. בתקווה להגביר את השימוש רחב יותר, אנו מספקים פרוטוקולים נוחים ורגישים כדי לנתח וחסונה מדינות ההפעלה של RIG-I ו PKR. A549 שורת תאים אנושי המוסמך IFN נגוע בactivator הוקם RIG-I ו PKR, שיבוט נגיף קדחת עמק השבר נחלש המוטציה 13 (13 Cl) ^31,32. לאחר הליך lysing פשוט, תמציות של תאים נגועים נבדקות על ידי עיכול / ניתוח כתם מוגבל טריפסין מערבי להעריך מיתוג קונפורמציה, ועל ידי ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide ילידים הכחול (עמוד) / analys כתם המערביהוא למדוד היווצרות oligomers.

1. זריעה של תאי A549 לזיהום

1. טפח את בקבוק T75 של תאי A549 על 37 ° C ו 5% CO ₂ בתרבית תאים בינונית (DMEM בתוספת FCS 10%, L-גלוטמין 526.6 מ"ג / ליטר, 50.000 פניצילין U / ליטר, ו50 סטרפטומיצין מ"ג / ליטר).
2. לפני שמתחיל לקצור את התאים, לחמם את המדיום סלולרי תרבות, PBS ו0.05% טריפסין-EDTA בwaterbath מחומם ל37 ° C.
3. הסר את המדיום ולשטוף את התאים עם 10 מיליליטר PBS. הסר את PBS שוב.
4. הוסף 3 מיליליטר של טריפסין-EDTA ולהפיץ באופן שווה בבקבוק. מעביר את הבקבוק באינקובטור עם 37 ° C ו 5% CO _2.
5. כאשר כל התאים מנותקים, להוסיף 7 מיליליטר של מדיום תרבות תא, resuspend התאים, ולהעביר את ההשעיה התא לתוך צינור פלקון 15 מיליליטר.
6. צנטריפוגה התאים ב XG 800 במשך 5 דקות ב RT, להסיר את supernatant ו resuspend את הכדור ב 10 מיליליטר תרבית תאים בינוני טרי.
7. ספירת התאים עם חדר ספירה.
8. הוסף 2.5 x 10 ⁶ תאים ב 5 מיליליטר של מדיום תרבות תא בשתי צלוחיות T25 כל אחד. דגירה של 16 שעות ב 37 ° C ו 5% CO _2. בקבוק אחד משמש לשליטה מדומה ואחד לזיהום Cl 13.

2. זיהום עם Clone וירוס בקעת קדחת 13 (13 Cl)

1. הערה: 13 Cl הוא מוטציה נגיף מוחלשת שבגרמניה יכול להיות מטופלים תחת BSL-2 תנאים. אנא עיין בכללים לאומיים רלוונטיים. מעוררי IFN אופייניים אחרים יהיו וירוס סנדאי (זן Cantell) או וירוס מחלת ניוקאסל.
2. , בינוני סרום ללא טרום חם PBS, ומדיום תרבית תאים המכיל FCS 5%.
3. הכן 1.25 x 10 ⁷ PFU / מיליליטר של 13 Cl במדיום סרום ללא להדביק 2.5 x 10 ⁶ תאי A549 עם ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 5. הכן כמות מעט (בערך 10%) גדולה יותר מהדרוש כדי להסביר שגיאות פיפטה.
4. לשטוף את התאים עם PBS כמתואר תחת 1.3.
5. הוסף 1 מיליליטר של דילול Cl 13 אושל מדיום סרום ללא (שליטה נגוע, מדומה) לתאים, ודגירה עבור שעה 1 ב 37 ° C ו 5% CO _2. הזז את הבקבוק בזהירות כל 15 דקות כדי להבטיח חלוקה שווה של Cl 13 דילול ובינוני סרום ללא, בהתאמה.
6. אחרי שעה 1 של זיהום, להסיר את inocula, מוסיף 5 מיליליטר של מדיום תרבות תא מחומם מראש עם FCS 5%, ו דגירה במשך 5 שעות ב 37 ° C ו 5% CO _2.

3. הכנת lysates התא

1. הכן PBS / 0.5% טריטון X-100 ב 4 ° C. אל תוסיפו מעכבי פרוטאז סרין.
2. לשטוף את התאים עם PBS הקר ולהוסיף 10 מיליליטר של PBS הטרי.
3. לגרד את התאים כבויים, להעביר את ההשעיה התא בצינור בז, ו צנטריפוגות ב XG 800 במשך 5 דקות ב RT.
4. הסר את supernatant ו resuspend התא גלולה ב μl 30 PBS / 0.5% טריטון X-100. העבר את lysate לתוך צינור מיליליטר טרי 1.5 ודגירה של לפחות 10 דקות ב 4 ° C.
5. צנטריפוגה lysate ב10.000 XG 10 דקות ב 4 ° C ולהעביר את lysate הבהיר התא (supernatant) לתוך צינור טרי.
6. קביעת ריכוז החלבון על ידי assay ברדפורד כמתואר במקום אחר ^33.
7. חנות ב -20 ° C או להמשיך לעיכול טריפסין (4.1) או עמוד ילידים (5.1).

4. קביעת קונפורמציה השינויים של זיהוי התבניות רצפטורים

1. טיפול TPCK-טריפסין של lysates התא
   1. לדלל טריפסין L-1-tosylamido-2-phenylethyl טופלו קטון chloromethyl (TPCK) ב-PBS לריכוז עבודה סופי של 2 מיקרוגרם / μl.
   2. התאם בשני צינורות חדשים ריכוז חלבון סופי של 25 מיקרוגרם של כל lysate חלבון (מדומה או 13 Cl) בנפח סופי של μl 9 עם PBS. לכן, זה צריך להיות ארבעה צינורות עם 25 lysate מיקרוגרם כל אחת, שתי פעמים מדומה ושתי פעמים Cl זיהום 13. אחד מוגדר כשליטת קלט (ללא טיפול) וקבוצה אחת לטיפול בTPCK-טריפסין.
   3. הוסף 1 μl של PBS (ללא טיפול)או 1 μl של 2 מיקרוגרם / μl TPCK-טריפסין (ריכוז סופי: 0.2 מיקרוגרם / μl) לlysates התא ומערבבים את התגובות על ידי pipetting. לא להקפיא ולהפשיר aliquots TPCK-טריפסין, כי זה יפגע ביעילות של מערכת העיכול.
   4. דגירה lysates ב37 מעלות צלזיוס במשך 25 דקות. עצור את התגובה על ידי הוספת 5x denaturing חיץ מדגם (250 מ"מ טריס-HCl pH 6.8, 10% SDS, גליצרול 50%, 25% β-mercaptoethanol, bromphenol 0.5% הכחולים) ועל ידי רתחה במשך 5 דקות ב95 ° C. חשוב לא להאריך את זמן הדגירה טריפסין. במקרה לא שברי פרוטאז עמיד הם לגילוי, הזמן של עיכול טריפסין חייב להתקצר.
   5. לאחר הרתיחה, ניתן לאחסן הדגימות ב-20 ° C.
2. SDS polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה (עמוד) ומערבי סופג
   1. טען את הדגימות על נתרן גופרתי dodecyl (SDS) ג'ל polyacrylamide המכיל לערום 5% מעל 12% ג'ל פתרון. הפרד את החלבונים ב25 mA לג'ל עדbromphenol הכחול שנגמר.
   2. הפעל קרום polyvinylidene פלואוריד (PVDF) ל30 שניות עם מתנול והכניס אותו לתוך חיץ העברה (48 מ"מ טריס, 39 מ"מ glycin, 1.3 מ"מ SDS, מתנול 20%).
   3. הכן את סופג עם מערכת סופג semidry ולאפשר העברת החלבונים ב10 V במשך שעה 1. קח את הממברנה החוצה, לשטוף אותו לזמן קצר במים, ולתת לו להתייבש.
   4. הפעל מחדש את הקרום על ידי זמן קצר העברה למתנול. שטוף למשך 5 דקות עם TBS. לחסום עם 10% חלב דל שומן בכפות עבור שעה 1 ב RT או 4 ° CO / נ לשטוף 3x הקרום במשך 5 דקות כל אחד עם TBS.
   5. הכן דילול נוגדן כפי שהומלץ בטבלה 1 ו דגירה הקרום עבור שעה 1 ב RT או 4 ° CO / נ
   6. לשטוף 3x הקרום 10 דקות כל אחד עם TBS-T. מוסיף את הנוגדנים משני המתאימים בשילוב עם חזרת peroxidase בדילול 1:20,000 ב1% חלב דל שומן בכפות. דגירה 45 דקות ב RT.
   7. לשטוף 3x הקרום 10 דקות כל אחד עם TBS-T, וoזמן נוסף ne עם TBS.
   8. לזיהוי אות להשתמש במערכת הדמיה דיגיטלית ג'ל ערכת chemiluminescense מסחרית ו.
3. כתמים כחולי G-250 מבריקים Coomassie
   1. בצע-SDS כמתואר ב4.2.1. דגימות עומס על ג'ל polyacrylamide SDS ולהפעיל את הג'ל על 25 mA לג'ל עד bromphenol הכחול שנגמר.
   2. לבצע מכתים הכחול G-250 מבריק Coomassie ב RT. האם כל incubations תחת טלטול מתמיד.
   3. העבר את הג'ל לפתרון הקיבעון המכיל מתנול 40% ו10% חומצה אצטית ל30 דקות.
   4. להחליף את החיץ לפתרון destaining (25% אתנול ו -8% חומצה אצטית) ודגירה של 5 דקות.
   5. כתם ג'ל עם 0.2% Coomassie Brillant Blue-G-250 במתנול 40% וחומצה אצטית 10% במשך שעה 1.
   6. Destain ג'ל עם פתרון destaining ולהחליף את החיץ לאחר 10 דקות, 30 דקות, ו60 דקות.
   7. אחסן את הג'ל ב25% אתנול, 8% חומצה אצטית, וגליצרול 4% ב 4 ° C. לבצע הדמיה וניתוח כפי שתואר תחת 4.2.8.

5. ניתוח Oligomeric הברית של זיהוי התבניות רצפטורים

1. עמוד Native
   1. הכן 50 מיקרוגרם של lysate תא בנפח סופי של μl 10 עם PBS ולהוסיף 5 × חיץ האם של מדגם (250 מ"מ טריס-HCl pH 6.8, 1% deoxycholate נתרן, גליצרול 50%, bromphenol 0.5% הכחולים) לריכוז סופי של 1x.
   2. טען את הדגימות באופן מיידי על ג'ל polyacrylamide יליד עם 5% כלערום ו -8% כפתרון ג'ל. כל עיכוב יגרום לאובדן של קומפלקסי ילידים ^34.
   3. הרץ את הג'ל על 20 mA לג'ל על 4 מעלות צלזיוס עם 50 מ"מ טריס-NaOH pH 9.0, 384 מ"מ glycin כמו האנודה ו50 מ"מ טריס pH 8.3, 384 מ"מ glycin, 1% deoxycholate נתרן כחיץ קתודה. לאחר 1.5-2 שעה (להקה הכחולה bromphenol הותירה את הג'ל כ 45 דקות קודם לכן) אלקטרופורזה הוא סיים.
2. סופג מערבי
   1. הפעל polyvinylidene פלואוריד קרום (PVDF) ל30 שניות עם מתנול והכניס אותו לתוך מאגר טובין (25 מ"מ טריס, 192 מ"מ glycin, 0.1% SDS, מתנול 20%).
   2. להרכיב קאמרי כתם רטוב על פי הוראות היצרן ולמלא את המכל עם חיץ Towin.
   3. בצע הסופג עם 250 mA ל1.5 שעות ב 4 ° C.
   4. כשהסופג הוא סיים המשך כמתואר מ4.2.3 הלאה.

הכרה באגוניסט ויראלי ידי RIG-I או PKR מפעיל מיתוג קונפורמציה 6,17,30 וoligomerization 6,18,27. אנו assayed שני סמני הפעלה אלה על ידי עיכול פרוטאז מוגבל וג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide ילידים (עמוד), בהתאמה.

תאי A549 אדם היו נגועים בנגיף קדחת שיבוט בקעת 13 (Cl 13), אשר מאופיין על ידי מוטציה של אנטגוניסט IFN NSS 35,36. בשל העדרו של NSS הפונקציונלי, 13 Clone חזק גורם RIG-I ו PKR, שהוביל להקמתה של מדינה אנטי חזקה בתאים 12,31,32,37.

עיכול טריפסין של תוצאות lysates התא נגועות מדומה בהידרדרות מהירה של RIG-I, ואילו Cl 13 זיהום מוביל לדור של איור 1 א שבר RIG-I 30 kDa עמיד. גם PKR מראה התנגדות חלקית לעיכול טריפסין בדגימות נגועות, אשר עולה בקנה אחד עם phosph איור 1 א orylation. כדי לפקח על יעילות וסגוליות של מערכת העיכול טריפסין, ג'לים הוכתמו Coomassie הכחול G-250 מבריקים. דגימות שלא טופלו להראות כמויות שווה של חלבונים טעונים איור 1 ב. הכפפת lysates תא המדומה וCl 13 לעיכול טריפסין מוביל לירידה דומה של כמויות חלבון הגלובליות. זה מוכיח שיש לו טיפול טריפסין היעילות זהה לדגימות 13 נגועים מדומה וCl.

היווצרות של קומפלקסי oligomeric הייתה assayed ידי עמוד ילידים. בתאים נגוע, רק מונומרים של RIG-I ו PKR התגלו איור 2. כבקרה נוספת שכללנו את גורם שעתוק IRF-3, אשר שוהה כמונומר אבל ידוע dimerize עם הפעלה באמצעות דוגמה: RIG-I 38. Cl 13 זיהום מוביל להצטברות חזקה של מתחמי oligomeric RIG-I בצורה של הכפשות ושל PKR וIRF-3 הדימרים / oligomers כלהקת חלבון מוגדר.

class = "jove_content"> תוצאות אלו מראות כי עיכול טריפסין מוגבל ועמוד האם הם כלי שימושיים כדי לעקוב אחר שינויי קונפורמציה והיווצרות oligomer של RIG-I ו PKR על זיהום.

איור 1. מתג קונפורמציה של RIG-I ו PKR. תאי A549 היו מדומים נגועים או נגוע ב13 Cl במשרד הפנים של 5. אחרי 5 שעות, תאים היו lysed בPBS בתוספת 0.5% טריטון X-100 ופיניתי lysates תא היו גם אינו מטופל או שטופלו בטריפסין. דגימות היו נתונים לעמוד SDS ואחריו המערב סופג () או מכתים Coomassie (ב '). כתמים הוכתמו נגד RIG-I, PKR, PKR פוספורילציה (Thr 446) ונגד nucleoprotein RVFV (RVFV N) ובטא אקטין זיהום ובקרת טעינה, בהתאמה._blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. Oligomerization של RIG-I, PKR, וIRF-3. Lysates הסלולרי של lysates תא 13 הנגוע המדומה וCl היו נתונים לעמוד מקורי ואחרי ניתוח כתם מערבי. צביעה בוצעה עם נוגדנים כנגד RIG-I, PKR, IRF-3, ובטאו אקטין בקרת טעינה. oligomers PKR הסביר ביותר לייצג הדימרים 27. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.