מאמר שיטה

הפעלת ניטור של התבנית אנטי רצפטורים ההכרה RIG-I ו PKR ידי מוגבל פרוטאז עיכול ועמוד Native

DOI:

10.3791/51415

⸱

29 ביולי 2014

 , 
1Institute for Virology, Philipps-University Marburg

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הגנה מולדת לנגיף מופעלות על ידי קולטנים זיהוי תבניות (PRRs). שני PRRs cytoplasmic RIG-I ו לאגד PKR כדי RNAs הנגיפי החתימה, שינוי קונפורמציה, oligomerize, ולהפעיל את איתות אנטי. שיטות מתוארות המאפשרות לפקח על מיתוג קונפורמציה וoligomerization של PRRs cytoplasmic אלה בנוחות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הגנה מארחת לזיהום בנגיף תלוי באיתור מהיר על ידי קולטנים זיהוי תבניות (PRRs) של מערכת החיסון המולדת. בציטופלסמה, PRRs RIG-I ו לאגד PKR לליגנד רנ"א הנגיפי הספציפי. זה מתווך ראשון מיתוג וoligomerization קונפורמציה, ולאחר מכן מאפשר הפעלה של תגובת אינטרפרון אנטי. בעוד שיטות כדי למדוד ביטוי גני מארח נגיפים מבוססות היטב, שיטות לניטור ישירות מדינות ההפעלה של RIG-I ו PKR הן רק באופן חלקי ופחות מבוססות היטב.

כאן, אנו מתארים שתי שיטות לניטור RIG-I ו PKR גירוי על זיהום עם inducer הוקמה אינטרפרון, נגיף קדחת בקעת שיבוט מוטציה 13 (Cl 13). עיכול טריפסין מוגבל מאפשר לנתח שינויים ברגישות פרוטאז, המצביע על שינויי קונפורמציה של PRRs. עיכול טריפסין של lysates מתוצאות תאים נגועים מדומה בהידרדרות מהירה של RIG-I ו PKR, whereaזיהום של Cl 13 מוביל להופעתה של פרוטאז עמיד RIG-שבר. גם PKR מראה התנגדות חלקית מושרה וירוס לעיכול טריפסין, אשר עולה בקנה אחד עם זירחון סימן ההיכר שלה בThr 446. היווצרות RIG-I ו oligomers PKR היה תוקף על ידי ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide ילידים (עמוד). עם הזיהום, יש הצטברות חזקה של RIG-I ו מתחמי oligomeric PKR, ואילו חלבונים אלה נותרו כמונומרים בדגימות נגועות מדומה.

עיכול מוגבל פרוטאז ועמוד מקורי, שניהם יחד לניתוח כתם מערבי, מאפשרים מדידה רגישה וישירה של שני שלבים שונים של RIG-I ו הפעלת PKR. טכניקות אלה קלות ומהיר יחסית לביצוע ואינו דורשות ציוד יקר.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אירוע מכריע בהגנת מארחת נגיפים הוא האיתור המהיר של הפתוגן על ידי קולטנים שנקרא זיהוי תבניות (PRRs) 1,2. איתור תאיים של זיהום בנגיף RNA תלוי בשני helicases cytoplasmic RNA, RIG-I (אני גן מושרה חומצה רטינואית) וMDA5 (חלבון בידול מלנומה קשור 5) 3-5. RIG-מורכב משני תחומים N-מסוף גיוס caspase (כרטיסים), תחום helicase RNA סוג DECH התיבה מרכזי, ותחום בטרמינל C-(CTD) 4,6. ואילו CTD ותחום helicase נדרשים להכרה של RNAs אינו עצמי (ויראלי), הכרטיסים לתווך איתות במורד הזרם שתוביל להקמת מעמד מארח אנטי.

אם RIG-אני נמצא במצב השקט, כלומר בהיעדר ליגנד RNA ספציפי, הכרטיס השני אינטראקציה עם תחום helicase המרכזי ושומר RIG-I בקונפורמציה אוטומטית מעכבת 7-11. RIG-I נקשר קצר כפולגדיל RNA (DS) נושאות 5'-טריפוספט (5'PPP), dsRNA הארוך, ו-RNA PolyU / UC-עשיר, מבני חתימה קלאסיים אשר נמצאים בגנומים של וירוסי RNA רבים 12-16. שני מאפיינים עיקריים של RIG-I הפעלה הם מעבר לקונפורמציה סגורה 6,17 וההומו-oligomerization 6,18,19. מתג קונפורמציה משפר RNA מחייב, חושף את הקלפים לאיתות במורד הזרם, וreconstitutes אתר ATPase פעיל 8,9,11,20. היווצרות של קומפלקסי RIG-I oligomeric מובילה לגיוס מוגבר של מולקולות איתות במורד הזרם מתאם כדי ליצור פלטפורמה להעברת אותות אנטי 11. שרשרת האיתות המוסדרת RIG-סופו של דבר מפעילה את גורם שעתוק IRF-3 לעד ויסות של אינטרפרון גנים (IFN-alpha/beta) ומכאן ביטוי גנים של גנים אינטרפרון מגורה (ISGs) לתגובה אנטי מלאה 21,22 . אחד ISGs המאופיין ביותר הוא protei מופעל RNAקינאז n (PKR) 23. PKR שייך למשפחה של ייזום תרגום גורם 2 אלפא אוקריוטים קינאז (eIF2α) והוא מורכב מתחום N-מסוף פעמיים תקוע RNA מחייב ותחום קינאז C-מסוף. תחום קינאז מהווה ממשק dimerization חיוני להפעלת PKR ומבצע את הפונקציות הקטליטית של החלבון. עקידת PKR לdsRNA הנגיפי מובילה לשינוי קונפורמציה התרת dimerization והאוטומטי זירחון בThr 446 בין שאריות אחרות. PKR אז מתווך זירחון של eIF2α, ובכך חוסם את התרגום של mRNAs הנגיפי 23-27.

שני RIG-I ו PKR לעבור שחלופים מבניים גדולים, יצירת קומפלקסי oligomeric והם פוסט translationally שונה על ידי זירחון / dephosphorylation וubiquitination 10,11,19,23,24,26-29. להבנה טובה יותר של מבנים שרנ"א נגיפיים מפעילים RIG-I ו PKR (ובאיזה שלב יריבים נגיפיים יכולים bדואר להתערב), חשוב על מנת לקבוע את מצב ההפעלה בדיוק. עבור שניהם PRRs שתואר בעבר על כך שהפעיל גורם להופעתה של שברי טריפסין עמיד חלבון 6,17,30 וoligomers מסדר גבוה 6,18,19. עם זאת, בהתחשב בעושר של ספרות על גורמי מפתח אלה של תגובת המארח אנטי 1,2,24, יישום של שיטות ישירות נראה יחסית נדיר. בתקווה להגביר את השימוש רחב יותר, אנו מספקים פרוטוקולים נוחים ורגישים כדי לנתח וחסונה מדינות ההפעלה של RIG-I ו PKR. A549 שורת תאים אנושי המוסמך IFN נגוע בactivator הוקם RIG-I ו PKR, שיבוט נגיף קדחת עמק השבר נחלש המוטציה 13 (13 Cl) 31,32. לאחר הליך lysing פשוט, תמציות של תאים נגועים נבדקות על ידי עיכול / ניתוח כתם מוגבל טריפסין מערבי להעריך מיתוג קונפורמציה, ועל ידי ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide ילידים הכחול (עמוד) / analys כתם המערביהוא למדוד היווצרות oligomers.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. זריעה של תאי A549 לזיהום

  1. טפח את בקבוק T75 של תאי A549 על 37 ° C ו 5% CO 2 בתרבית תאים בינונית (DMEM בתוספת FCS 10%, L-גלוטמין 526.6 מ"ג / ליטר, 50.000 פניצילין U / ליטר, ו50 סטרפטומיצין מ"ג / ליטר).
  2. לפני שמתחיל לקצור את התאים, לחמם את המדיום סלולרי תרבות, PBS ו0.05% טריפסין-EDTA בwaterbath מחומם ל37 ° C.
  3. הסר את המדיום ולשטוף את התאים עם 10 מיליליטר PBS. הסר את PBS שוב.
  4. הוסף 3 מיליליטר של טריפסין-EDTA ולהפיץ באופן שווה בבקבוק. מעביר את הבקבוק באינקובטור עם 37 ° C ו 5% CO 2.
  5. כאשר כל התאים מנותקים, להוסיף 7 מיליליטר של מדיום תרבות תא, resuspend התאים, ולהעביר את ההשעיה התא לתוך צינור פלקון 15 מיליליטר.
  6. צנטריפוגה התאים ב XG 800 במשך 5 דקות ב RT, להסיר את supernatant ו resuspend את הכדור ב 10 מיליליטר תרבית תאים בינוני טרי.
  7. ספירת התאים עם חדר ספירה.
  8. הוסף 2.5 x 10 6 תאים ב 5 מיליליטר של מדיום תרבות תא בשתי צלוחיות T25 כל אחד. דגירה של 16 שעות ב 37 ° C ו 5% CO 2. בקבוק אחד משמש לשליטה מדומה ואחד לזיהום Cl 13.

2. זיהום עם Clone וירוס בקעת קדחת 13 (13 Cl)

  1. הערה: 13 Cl הוא מוטציה נגיף מוחלשת שבגרמניה יכול להיות מטופלים תחת BSL-2 תנאים. אנא עיין בכללים לאומיים רלוונטיים. מעוררי IFN אופייניים אחרים יהיו וירוס סנדאי (זן Cantell) או וירוס מחלת ניוקאסל.
  2. , בינוני סרום ללא טרום חם PBS, ומדיום תרבית תאים המכיל FCS 5%.
  3. הכן 1.25 x 10 7 PFU / מיליליטר של 13 Cl במדיום סרום ללא להדביק 2.5 x 10 6 תאי A549 עם ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 5. הכן כמות מעט (בערך 10%) גדולה יותר מהדרוש כדי להסביר שגיאות פיפטה.
  4. לשטוף את התאים עם PBS כמתואר תחת 1.3.
  5. הוסף 1 מיליליטר של דילול Cl 13 אושל מדיום סרום ללא (שליטה נגוע, מדומה) לתאים, ודגירה עבור שעה 1 ב 37 ° C ו 5% CO 2. הזז את הבקבוק בזהירות כל 15 דקות כדי להבטיח חלוקה שווה של Cl 13 דילול ובינוני סרום ללא, בהתאמה.
  6. אחרי שעה 1 של זיהום, להסיר את inocula, מוסיף 5 מיליליטר של מדיום תרבות תא מחומם מראש עם FCS 5%, ו דגירה במשך 5 שעות ב 37 ° C ו 5% CO 2.

3. הכנת lysates התא

  1. הכן PBS / 0.5% טריטון X-100 ב 4 ° C. אל תוסיפו מעכבי פרוטאז סרין.
  2. לשטוף את התאים עם PBS הקר ולהוסיף 10 מיליליטר של PBS הטרי.
  3. לגרד את התאים כבויים, להעביר את ההשעיה התא בצינור בז, ו צנטריפוגות ב XG 800 במשך 5 דקות ב RT.
  4. הסר את supernatant ו resuspend התא גלולה ב μl 30 PBS / 0.5% טריטון X-100. העבר את lysate לתוך צינור מיליליטר טרי 1.5 ודגירה של לפחות 10 דקות ב 4 ° C.
  5. צנטריפוגה lysate ב10.000 XG 10 דקות ב 4 ° C ולהעביר את lysate הבהיר התא (supernatant) לתוך צינור טרי.
  6. קביעת ריכוז החלבון על ידי assay ברדפורד כמתואר במקום אחר 33.
  7. חנות ב -20 ° C או להמשיך לעיכול טריפסין (4.1) או עמוד ילידים (5.1).

4. קביעת קונפורמציה השינויים של זיהוי התבניות רצפטורים

  1. טיפול TPCK-טריפסין של lysates התא
    1. לדלל טריפסין L-1-tosylamido-2-phenylethyl טופלו קטון chloromethyl (TPCK) ב-PBS לריכוז עבודה סופי של 2 מיקרוגרם / μl.
    2. התאם בשני צינורות חדשים ריכוז חלבון סופי של 25 מיקרוגרם של כל lysate חלבון (מדומה או 13 Cl) בנפח סופי של μl 9 עם PBS. לכן, זה צריך להיות ארבעה צינורות עם 25 lysate מיקרוגרם כל אחת, שתי פעמים מדומה ושתי פעמים Cl זיהום 13. אחד מוגדר כשליטת קלט (ללא טיפול) וקבוצה אחת לטיפול בTPCK-טריפסין.
    3. הוסף 1 μl של PBS (ללא טיפול)או 1 μl של 2 מיקרוגרם / μl TPCK-טריפסין (ריכוז סופי: 0.2 מיקרוגרם / μl) לlysates התא ומערבבים את התגובות על ידי pipetting. לא להקפיא ולהפשיר aliquots TPCK-טריפסין, כי זה יפגע ביעילות של מערכת העיכול.
    4. דגירה lysates ב37 מעלות צלזיוס במשך 25 דקות. עצור את התגובה על ידי הוספת 5x denaturing חיץ מדגם (250 מ"מ טריס-HCl pH 6.8, 10% SDS, גליצרול 50%, 25% β-mercaptoethanol, bromphenol 0.5% הכחולים) ועל ידי רתחה במשך 5 דקות ב95 ° C. חשוב לא להאריך את זמן הדגירה טריפסין. במקרה לא שברי פרוטאז עמיד הם לגילוי, הזמן של עיכול טריפסין חייב להתקצר.
    5. לאחר הרתיחה, ניתן לאחסן הדגימות ב-20 ° C.
  2. SDS polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה (עמוד) ומערבי סופג
    1. טען את הדגימות על נתרן גופרתי dodecyl (SDS) ג'ל polyacrylamide המכיל לערום 5% מעל 12% ג'ל פתרון. הפרד את החלבונים ב25 mA לג'ל עדbromphenol הכחול שנגמר.
    2. הפעל קרום polyvinylidene פלואוריד (PVDF) ל30 שניות עם מתנול והכניס אותו לתוך חיץ העברה (48 מ"מ טריס, 39 מ"מ glycin, 1.3 מ"מ SDS, מתנול 20%).
    3. הכן את סופג עם מערכת סופג semidry ולאפשר העברת החלבונים ב10 V במשך שעה 1. קח את הממברנה החוצה, לשטוף אותו לזמן קצר במים, ולתת לו להתייבש.
    4. הפעל מחדש את הקרום על ידי זמן קצר העברה למתנול. שטוף למשך 5 דקות עם TBS. לחסום עם 10% חלב דל שומן בכפות עבור שעה 1 ב RT או 4 ° CO / נ לשטוף 3x הקרום במשך 5 דקות כל אחד עם TBS.
    5. הכן דילול נוגדן כפי שהומלץ בטבלה 1 ו דגירה הקרום עבור שעה 1 ב RT או 4 ° CO / נ
    6. לשטוף 3x הקרום 10 דקות כל אחד עם TBS-T. מוסיף את הנוגדנים משני המתאימים בשילוב עם חזרת peroxidase בדילול 1:20,000 ב1% חלב דל שומן בכפות. דגירה 45 דקות ב RT.
    7. לשטוף 3x הקרום 10 דקות כל אחד עם TBS-T, וoזמן נוסף ne עם TBS.
    8. לזיהוי אות להשתמש במערכת הדמיה דיגיטלית ג'ל ערכת chemiluminescense מסחרית ו.
  3. כתמים כחולי G-250 מבריקים Coomassie
    1. בצע-SDS כמתואר ב4.2.1. דגימות עומס על ג'ל polyacrylamide SDS ולהפעיל את הג'ל על 25 mA לג'ל עד bromphenol הכחול שנגמר.
    2. לבצע מכתים הכחול G-250 מבריק Coomassie ב RT. האם כל incubations תחת טלטול מתמיד.
    3. העבר את הג'ל לפתרון הקיבעון המכיל מתנול 40% ו10% חומצה אצטית ל30 דקות.
    4. להחליף את החיץ לפתרון destaining (25% אתנול ו -8% חומצה אצטית) ודגירה של 5 דקות.
    5. כתם ג'ל עם 0.2% Coomassie Brillant Blue-G-250 במתנול 40% וחומצה אצטית 10% במשך שעה 1.
    6. Destain ג'ל עם פתרון destaining ולהחליף את החיץ לאחר 10 דקות, 30 דקות, ו60 דקות.
    7. אחסן את הג'ל ב25% אתנול, 8% חומצה אצטית, וגליצרול 4% ב 4 ° C.
    8. לבצע הדמיה וניתוח כפי שתואר תחת 4.2.8.

5. ניתוח Oligomeric הברית של זיהוי התבניות רצפטורים

  1. עמוד Native
    1. הכן 50 מיקרוגרם של lysate תא בנפח סופי של μl 10 עם PBS ולהוסיף 5 × חיץ האם של מדגם (250 מ"מ טריס-HCl pH 6.8, 1% deoxycholate נתרן, גליצרול 50%, bromphenol 0.5% הכחולים) לריכוז סופי של 1x.
    2. טען את הדגימות באופן מיידי על ג'ל polyacrylamide יליד עם 5% כלערום ו -8% כפתרון ג'ל. כל עיכוב יגרום לאובדן של קומפלקסי ילידים 34.
    3. הרץ את הג'ל על 20 mA לג'ל על 4 מעלות צלזיוס עם 50 מ"מ טריס-NaOH pH 9.0, 384 מ"מ glycin כמו האנודה ו50 מ"מ טריס pH 8.3, 384 מ"מ glycin, 1% deoxycholate נתרן כחיץ קתודה. לאחר 1.5-2 שעה (להקה הכחולה bromphenol הותירה את הג'ל כ 45 דקות קודם לכן) אלקטרופורזה הוא סיים.
  2. סופג מערבי
    1. הפעל polyvinylidene פלואוריד קרום (PVDF) ל30 שניות עם מתנול והכניס אותו לתוך מאגר טובין (25 מ"מ טריס, 192 מ"מ glycin, 0.1% SDS, מתנול 20%).
    2. להרכיב קאמרי כתם רטוב על פי הוראות היצרן ולמלא את המכל עם חיץ Towin.
    3. בצע הסופג עם 250 mA ל1.5 שעות ב 4 ° C.
    4. כשהסופג הוא סיים המשך כמתואר מ4.2.3 הלאה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הכרה באגוניסט ויראלי ידי RIG-I או PKR מפעיל מיתוג קונפורמציה 6,17,30 וoligomerization 6,18,27. אנו assayed שני סמני הפעלה אלה על ידי עיכול פרוטאז מוגבל וג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide ילידים (עמוד), בהתאמה.

תאי A549 אדם היו נגועים בנגיף קדחת שיבוט בקעת 13 (Cl 13), אשר מאופיין על ידי מוטציה של אנטגוניסט IFN NSS 35,36. בשל העדרו של NSS הפונקציונלי, 13 Clone חזק גורם RIG-I ו PKR,...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חישה נוכחותם של וירוסים והפעלה של הסוג אנטי אני IFN מערכת חיוני לתגובה חיסונית מולדת מוצלחת 22. זיהוי וירוסים הוא בתיווך ובכך על ידי קולטנים זיהוי הפתוגן (PRRs) כמו RIG-I ו PKR, ומאפשר תגובה והפעלה של מנגנוני הגנה אנטי מהירים. כאן, אנו מתארים שתי שיטות על מנת להעריך את מצב ההפעלה של RIG-I ו PKR ישירות.

עיכול פרוטאז מוגבל ככלי לניטור שינויי קונפורמציה של RIG-I ו PKR תואר לראשונה על ידי הקבוצות של מ '...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לאלחנדרו ברון מCISA-INIA למתן סרה נגיף קדחת העמק נגד הבקעה. עבודה במעבדות שלנו נתמכת על ידי פנינת Forschungsförderung. § 2 Abs. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum גיסן und מרבורג, בית הספר למוסמכים לייבניץ למחלות ויראליות מתעוררים (EIDIS), Sonderforschungsbereich DFG (SFB) 1021, וSchwerpunktprogramm DFG (SPP) 1596.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Cell Culture
Dulbecco' s שונה Eagle' s medium (DMEM)Gibco21969-035
OptiMEMGibco31985-47
L-glutaminePAA25030-024
פניצילין-סטרפטומיציןPAA15070-063
סרום עגל עוברי (FCS)PAA10270
0.05% טריפסין-EDTAGibco25300-054
<חזק>כימיקלים
L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-מטופל (TPCK) טריפסיןסיגמא אולדריץ'T1426
<נוגדנים חזקים>נוגדנים
חד-שבטיים נגד RIG-I (ALME-1)Enzo Life SciencesALX-804-849-C100WB: 1:500 בחלב דל שומן 1% בעכבר TBS
חד שבטי נגד PKR (B10)סנטה קרוזsc-6282WB: 1:500 בחלב דל שומן 1% ב-TBS
ארנב חד-שבטי אנטי-P-PKR (Thr446)Epitomics1120-1WB: 1:1,000 ב-5% BSA ב-TBS
ארנב פוליקלונלי אנטי-IRF-3סנטה קרוזsc-9082WB: 1:500 בחלב דל שומן 1% ב-TBS ארנב
חד-שבטי אנטי-P-IRF-3 (Ser386)IBLog-413WB: 1:100 בחלב דל שומן 1% ב-TBS
סרום ארנב נגד RVFV היפר-אימוני "C2" (MP-12)מסופק באדיבות על ידי אלחנדרו ברון CISA-INIAWB: 1:2,000 בחלב דל שומן 1% ב-TBS
עכבר חד-שבטי אנטי-בטא-אקטין (8H10D10)איתות תאים3700WB: 1:1,000 בחלב דל שומן 1% ב-TBS
עיזים מצומד פרוקסידאז פוליקלונלי נגד ארנבתרמו פישר0031460 1892914WB: 1:20,000 בחלב דל שומן 1% ב-TBS
פוליקלונל פרוקסידאז מצומד עז נגד עכברThermo Fisher0031430 1892913WB: 1:20,000 בחלב דל שומן 1% ב-TBS

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gurtler, C., Bowie, A. G. Innate immune detection of microbial nucleic acids. Trends in Microbiology. 21, 413-420 (2013).
  2. Jensen, S., Thomsen, A. R. Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion. Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).
  3. Kato, H., Takahasi, K., Fujita, T. RIG-I-like receptors: cytoplasmic sensors for non-self RNA. Immunological Reviews. 243, 91-98 (2011).
  4. Yoneyama, M., et al. The RNA helicase RIG-I has an essential function in double-stranded RNA-induced innate antiviral responses. Nature Immunology. 5, 730-737 (2004).
  5. Andrejeva, J., et al. The V proteins of paramyxoviruses bind the IFN-inducible RNA helicase, mda-5, and inhibit its activation of the IFN-beta promoter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17264-17269 (2004).
  6. Saito, T., et al. Regulation of innate antiviral defenses through a shared repressor domain. in RIG-I and LGP2 Proc Natl Acad Sci USA. 104, 582-587 (2007).
  7. Ferrage, F., et al. Structure and dynamics of the second CARD of human RIG-I provide mechanistic insights into regulation of RIG-I activation. Structure (London, England : 1993). 20, 2048-2061 (2012).
  8. Kolakofsky, D., Kowalinski, E., Cusack, S. A structure-based model of RIG-I activation. 18, RNA. New York, NY. 2118-2127 (2012).
  9. Luo, D., Kohlway, A., Vela, A., Pyle, A. M. Visualizing the determinants of viral RNA recognition by innate immune sensor RIG-I. Structure (London, England : 1993). 20, 1983-1988 (2012).
  10. Kowalinski, E., et al. Structural basis for the activation of innate immune pattern-recognition receptor RIG-I by viral RNA. Cell. 147, 423-435 (2011).
  11. Luo, D., et al. Structural insights into RNA recognition by RIG-I. Cell. 147, 409-422 (2011).
  12. Habjan, M., et al. Processing of genome 5" termini as a strategy of negative-strand RNA viruses to avoid RIG-I-dependent interferon induction. PloS One. 3, e2032(2008).
  13. Rehwinkel, J., Reis, E. S. C. Targeting the viral Achilles' recognition of 5'-triphosphate RNA in innate anti-viral defence. Current Opinion in Microbiology. 16, 485-492 (2013).
  14. Pichlmair, A., et al. RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates. , Science. New York, NY. 314-997 (2006).
  15. Hornung, V., et al. 5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. , Science. New York, N.Y. 314-994 (2006).
  16. Saito, T., Gale, M. Differential recognition of double-stranded RNA by RIG-I-like receptors in antiviral immunity. The Journal of Experimental Medicine. 205, 1523-1527 (2008).
  17. Takahasi, K., et al. Nonself RNA-sensing mechanism of RIG-I helicase and activation of antiviral immune responses. Mol Cell. 29, 428-440 (2008).
  18. Binder, M., et al. Molecular mechanism of signal perception and integration by the innate immune sensor retinoic acid-inducible gene-I (RIG-I). J Biol Chem. 286, 27278-27287 (2011).
  19. Jiang, X., et al. Ubiquitin-induced oligomerization of the RNA sensors RIG-I and MDA5 activates antiviral innate immune response. Immunity. 36, 959-973 (2012).
  20. Civril, F., et al. The RIG-I ATPase domain structure reveals insights into ATP-dependent antiviral signalling. EMBO reports. 12, 1127-1134 (2011).
  21. Hiscott, J. Triggering the innate antiviral response through IRF-3 activation. The Journal of Biological Chemistry. 282, 15325-15329 (2007).
  22. Hertzog, P. J., Williams, B. R. Fine tuning type I interferon responses. Cytokin., & Growth Factor Reviews. 24, 217-225 (2013).
  23. Pindel, A., Sadler, A. The role of protein kinase R in the interferon response. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 31, 59-70 (2011).
  24. Donnelly, N., Gorman, A. M., Gupta, S., Samali, A. The eIF2alpha kinases: their structures and functions. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 70, 3493-3511 (2013).
  25. Cole, J. L. Activation of PKR an open and shut case. Trends in Biochemical Sciences. 32, 57-62 (2007).
  26. Dauber, B., Wolff, T. Activation of the Antiviral Kinase PKR and Viral Countermeasures. Viruses. 1, 523-544 (2009).
  27. Dey, M., et al. Mechanistic link between PKR dimerization, autophosphorylation, and eIF2alpha substrate recognition. Cell. 122, 901-913 (2005).
  28. Gack, M. U., et al. TRIM25 RING-finger E3 ubiquitin ligase is essential for RIG-I-mediated antiviral activity. Nature. 446, 916-920 (2007).
  29. Zeng, W., et al. Reconstitution of the RIG-I pathway reveals a signaling role of unanchored polyubiquitin chains in innate immunity. Cell. 141, 315-330 (2010).
  30. Anderson, E., Cole, J. L. Domain stabilities in protein kinase R (PKR): evidence for weak interdomain interactions. Biochemistry. 47, 4887-4897 (2008).
  31. Habjan, M., et al. NSs protein of rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase. Journal of Virology. 83, 4365-4375 (2009).
  32. Weber, M., et al. Incoming RNA virus nucleocapsids containing a 5'-triphosphorylated genome activate RIG-I and antiviral signaling. Cell Hos., & Microbe. 13, 336-346 (2013).
  33. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  34. Wittig, I., Schagger, H. Advantages and limitations of clear-native. 5, 4338-4346 (2005).
  35. Muller, R., et al. Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment. Am J Trop Med Hyg. 53, 405-411 (1995).
  36. Bouloy, M., et al. Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs. Journal of Virology. 75, 1371-1377 (2001).
  37. Ikegami, T., et al. Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation. PLoS Pathogens. 5, e1000287(2009).
  38. Iwamura, T., et al. Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways. Genes to Cells : Devoted to Molecula., & Cellular Mechanisms. 6, 375-388 (2001).
  39. Yoneyama, M., Suhara, W., Fujita, T. Control of IRF-3 activation by phosphorylation. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 22, 73-76 (2002).
  40. Bamming, D., Horvath, C. M. Regulation of signal transduction by enzymatically inactive antiviral RNA helicase proteins MDA5 RIG-I and LGP2. The Journal of Biological Chemistry. 284, 9700-9712 (2009).
  41. Wu, B., et al. Structural basis for dsRNA recognition, filament formation, and antiviral signal activation by MDA5. Cell. 152, 276-289 (2013).
  42. Berke, I. C., Modis, Y. MDA5 cooperatively forms dimers and ATP-sensitive filaments upon binding double-stranded RNA. The EMBO Journal. 31, 1714-1726 (2012).
  43. Garcia-Sastre, A. Induction and evasion of type I interferon responses by influenza viruses. Virus Research. 162, 12-18 (2011).
  44. Taylor, K. E., Mossman, K. L. Recent advances in understanding viral evasion of type I interferon. Immunology. 138, 190-197 (2013).
  45. Goodbourn, S., Randall, R. E. The regulation of type I interferon production by paramyxoviruses. Journal of Interfero., & Cytokine Research : the Official Journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 29, 539-547 (2009).
  46. Versteeg, G. A., Garcia-Sastre, A. Viral tricks to grid-lock the type I interferon system. Current Opinion in Microbiology. 13, 508-516 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RIG IPKRWestern Blot

מאמרים קשורים