מאמר שיטה

בידוד של קטן noncoding RNAs מסרום האדם

DOI:

10.3791/51443

⸱

19 ביוני 2014

 ,  , 
1School of Medical and Molecular Biosciences, Faculty of Science, University of Technology, Sydney, 2Centre for Health Technologies, Faculty of Engineering and Information Technology, University of Technology, Sydney, 3The Sydney Head and Neck Cancer Institute, Sydney Cancer Centre, Royal Prince Alfred Hospital

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר שיטה להפקת RNA קטן מסרום אדם. אנחנו השתמשנו בשיטה זו כדי לבודד מיקרו RNA בסרום מהסרטן לשימוש במערכי ה-DNA וגם PCR כמו singleplex. הפרוטוקול מנצל ריאגנטים פנול וthiocyanate guanidinium עם שינויים להניב RNA באיכות גבוהה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הניתוח של RNA והביטוי שלה הוא תכונה נפוצה במעבדות רבות. משמעות היא הופעתה של RNA קטן כמו מיקרו RNA, אשר נמצאים בתאי יונקים. RNAs הקטן אלה הם רגולטורים גן עוצמה שליטה מסלולים חיוניים כגון צמיחה, פיתוח ומוות ועניין רב כבר מופנים כלפי הביטוי שלהם בנוזלי גוף. זאת בשל חוסר הוויסות שלהם במחלות בבני אדם כגון סרטן ויישום הפוטנציאל שלהם כסמנים ביולוגיים בסרום. עם זאת, הניתוח של ביטוי מירנה בסרום עשוי להיות בעייתי. ברוב המקרים הסכום של סרום הוא להגביל וסרום מכיל כמויות נמוכות של רנ"א הכל, מתוכם RNAs הקטן מהווים 0.4-0.5 1% בלבד. לכן הבידוד של כמויות מספיקות של RNA האיכותי מסרום הוא אתגר גדול לחוקרים כיום. במאמר זה טכני, אנחנו מדגימים שיטה שבה משתמשת רק 400 μl של סרום אנושי להשיג RNA מספיק לאף אחד ממערכי ה-DNA או ניתוח qPCR.dvantages של שיטה זו הוא הפשטות והיכולת להניב RNA באיכות הגבוהה שלה. זה לא דורש עמודות מיוחדות עבור טיהור של RNA הקטן ומנצל חומרים כימיים בכלל וחומרה שנמצאו במעבדות משותפות. השיטה שלנו מנצלת שלב נעילת ג'ל כדי למנוע זיהום פנול ואילו באותו הזמן מניב RNA באיכות גבוהה. גם אנחנו מציגים את צעד נוסף כדי להסיר את כל המזהמים נוספים במהלך שלב הבידוד. פרוטוקול זה הוא יעיל מאוד בבידוד תשואות של RNA הכולל של עד 100 ng / μl מסרום, אבל יכול גם להיות מותאם לרקמות ביולוגיות אחרות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשנים האחרונות, חלה דחיפה גוברת לגלות סמנים ביולוגיים חדשניים לגילוי המוקדם של מחלות בבני אדם. תשומת לב רבה התמקדה באמצעות RNA קטן כגון מיקרו RNA 2 (miRNAs או מירס) כסמנים פוטנציאליים. RNAs הקטן אלה נמצאים בנוזלי גוף כגון סרום ומחקרים הראו שהם עמידים לפירוק ויציבים על פני טווח של תנאים סביבתיים משתנים 3. בהתחשב miRNAs תכונות, הסרום או במחזור אלה הם הסמן הביולוגי האידיאלי 4, 5. נכון לעכשיו יש שתי גישות עיקריות לבידוד של RNA הקטן מנוזלים ביולוגיים. הגישה הראשונה משתמשת בטכנולוגיה מבוססת עמודה להיקשר וelute RNA הקטן 6, ואילו הגישה השנייה משתמשת בפרוטוקול ארוכת השנים עם חומרים כימיים פנול וthiocyanate guanidinium 7. פיתחנו פרוטוקול פשוט, יעיל, ללא עמודה כדי לבודד RNAs הקטן מסרום אדם. RNA הבודד הוא היא מידately שמיש ביישומים במורד הזרם, כוללים מערכי oligonucleotide DNA ורצף RNA.

פרוטוקול זה פותח בגלל שאנחנו מתמודדים עם כמה בעיות בעת השימוש בשיטות המבוסס על פנול לבודד RNA מסרום. גישת Chomczynski המסורתית משמשת לעתים קרובות ברוב המעבדות עם מגוון של חומרים כימיים זמינים מרוב הספקים מסחריים. עם זאת שוקל השימוש הנרחב שלהם, הנחיות מחמירות שלא פותחו באופן עקבי לייצר RNA איכות גבוהה מנוזלי גוף, בדם או בסרום מסוים.

בעיות נפוצות הקשורות לבידוד RNA מן הסרום כוללות תשואות RNA נמוכות וזיהום עם חומרים כימיים המשמשים בבידוד, במיוחד פנול. הגישה שלנו מבטלת מזהמים פנול אלה כדי לספק RNA באיכות גבוהה לניתוח במורד כגון PCR כמוני (qPCR) ורצף RNA. בדקנו עוד RNA זה על מערכי מירנה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שים לב: דגימות סרום אדם מחולים או חולים עם הסרטן בריאים התקבלו עם הסכמה מדעת לפי פרוטוקולים אתיים אדם שאושרו מהנסיך המלכותי אלפרד החולים סידני (מספר פרוטוקול X10-0016 וHREC/10/RPAH/24) והאוניברסיטה טכנולוגי, סידני. דגימות סרום שנאספו ממטופלים לפני הניתוח מבתי חולים שונים בסידני והניחו באחסון ב -80 ° C.

1. בידוד RNA קטן מסרום

רנ"א הכל הוכן מסרום אדם משתמש בגרסה שונה של פרוטוקול LS Tri-מגיב RT.

  1. הפשירו מדגם סרום קפוא על קרח ולאחר מכן להעביר 400 μl של הסרום מופשר הטרי לתוך צינור microcentrifuge שכותרתו.
  2. לדלל את הסרום עם של H 2 O RNase ללא 100 μl ולהוסיף K proteinase בריכוז של 1 מ"ג / מיליליטר.
  3. לדגור על C ° 37 עבור 20 דקות כדי לאפשר את עיכול חלבון על ידי proteinase ק
  4. To להבטיח solubilization מלא, להוסיף 1.5 פעמיה נפח של Tri-מגיב RT LS ושל 4 bromoanisole-100 μl.
  5. בקצרה להפוך את homogenate, לבצע pipetting חוזר על עצמו במשך 5 שניות ולהעביר לתוך צינור 2 מיליליטר כבד שלב נעילה שכותרתו.
  6. ספין homogenate ב12,000 × גרם ל20 דקות ב 4 ° C.
  7. למזוג בזהירות לפחות 1 מיליליטר של התמיסה המימית שנוצרה לתוך צינור ה-DNA LoBind טרי. ביניים האורגניים ויש לכודים מתחת לג'ל הלבן של צינור שלב הנעילה.
  8. הוספת 5.0 μl של גליקוגן (5 מ"ג / מיליליטר) ו500 μl של isopropanol 100% לתמיסה המימית, מערבב על ידי היפוך, ודגירת O / N ב -20 ° C.
  9. דגירה O הבא / N, צנטריפוגות המדגם עבור 20 דקות ב 12,000 × גרם בצנטריפוגה 4 ° C.
  10. בטל supernatant ברור ולבצע ספין "הבזק" במשך 2 דקות ב 16,000 × גרם בצנטריפוגה 4 ° C.
  11. להסיר את סול ברור בזהירותution המקיף את הכדור בעזרת פיפטה.
  12. שטוף את הכדור עם 1 מיליליטר של 70% אתנול ו צנטריפוגות ב 10,000 × גרם ל10 דקות. למזוג את הפתרון לשטוף ולחזור על פעולת שטיפה.

2. RNA resuspension לפתרון

  1. Resuspend את הכדור ב10 μl של H 2 O RNase ללא, על מנת להבטיח את גלולה הוא נמסה לגמרי. כדי להבטיח כי RNA הוא solubilized לחלוטין המדגם יכול להיות מחומם ל55 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. במהלך הזמן הזה, לערבב את המדגם עם pipetting חוזר ונשנה. עבור סכום כולל תשואת RNA גבוהה, בריכת שתי הכנות RNA מאותו החולה.
  2. לכמת RNA resuspended באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis ולהעריך את איכות RNA באמצעות 2100 Bioanalyzer. לאחסן דגימות RNA נקוו ב-80 מעלות צלזיוס לשימוש ביישומים במורד הזרם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 מייצג ספקטרום UV / Vis טיפוסי של רנ"א מבודד מסרום. מפרופיל זה שציינו זיהום חלבון בננומטר 280 עם פנול ומזהמים אורגניים הן ב270 ננומטר ו230 ננומטר, בהתאמה. thiocyanate guanidinium שאריות היה גם ציין ב260 ננומטר. כדי להפחית את המזהמים, בשורה של צעדי אופטימיזציה נעשו הליך RT-LS הסטנדרטי Tri-מגיב. הוספנו 5 מ"ג / מיליליטר של גליקוגן כדי להגדיל את שניהם בסך הכל תשואת RNA ולהפחית את הזיהום (קו שחור, איור 1 א).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האוכלוסייה של מיקרו RNA מהווה כ 0.4-0.5% מרנ"א הכל נמצא בסרום. בהמשך יש גם תכולת חלבון גבוהה שנמצאה בסרום אדם. כדי לשפר את RNA ולהפחית חלבון וגם פנול מזהם יש לנו שונה בגישה המסורתית Chomczynski 9 עם התוספת של כמה צעדים.

RNA סה"כ היה מבודד מסרום באמצעות Tri-מגיב RT-LS הסטנדרטי (Molecular Research Centre) לעומת זאת כאשר היא מבוצעת במעבדה שלנו, שיטה זו הניבה RNA בכמויות נמוכות עם מזהמים שונים. <...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סמנתה חורי ופמלה Ajuyah נתמכים לאחר התואר הראשון בפרס האוסטרלי על ידי. אנחנו רוצים גם להכיר ברשת Translational חקר הסרטן, לואי מרכז לחקר הסרטן, אוניברסיטת ניו סאות' ויילס והצפון Translational היחידה לחקר הסרטן לקבלת תמיכה הנוספת של סמנתה חורי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מרכז המחקר המולקולריTri-Reagent RT LSTR 118
RNase ללא H2OGIBCO Invitrogen10977-023
Proteinase KFinnzymes, פינלנדEO0491
צינור נעילת פאזה כבד5PRIME2302830קיבולת 2 מ"ל
צינור DNA LobindEppendorf0030 108.0781.5 מ"ל קיבולת
גליקוגןInvitrogen, ארה"ב10814-0105 מ"ג/מ"ל
איזופרופנול בדרגת RNAסיגמא אולדריץ', ארה"בI9516100%
צנטריפוגה מקוררתג'ון מוריס
Nanodrop ספקטרופוטומטר UV-VisThermo Fisher Scientific, ארה"ב
אתנול בדרגת RNAסיגמא אולדריץ', ארה"בE702370%
Agilent 2100 BioanalyzerAgilent, ארה"ב
, ארה"ב

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Babu, S. Monitoring extraction efficiency of small RNAs with the Agilent 2100 Bioanalyzer and the Small RNA Kit. Agilent Application Note. , (2010).
  2. Tran, N., Hutvagner, G. Biogenesis and the regulation of the maturation of miRNAs. Essays Biochem. 54, 17-28 (2013).
  3. Chim, S. S., et al. Detection and characterization of placental microRNAs in maternal plasma. Clin. Chem. 54, 482-490 (2008).
  4. Lodes, M. J., et al. Detection of cancer with serum miRNAs on an oligonucleotide microarray. PLoS One. 4, (2009).
  5. Chen, X., et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell Res. 18, 997-1006 (2008).
  6. Burgos, K. L., et al. Identification of extracellular miRNA in human cerebrospinal fluid by next-generation sequencing. RNA. 19, 712-722 (2013).
  7. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162, 156-159 (1987).
  8. Zhang, X., et al. Alterations in miRNA processing and expression in pleomorphic adenomas of the salivary gland. Int. J. Cancer. 124, 2855-2863 (2009).
  9. Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat. Protoc. 1, 581-585 (2006).
  10. Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6, (2011).
  11. Murphy, N. R., Hellwig, R. J. Improved nucleic acid organic extraction through use of a unique gel barrier material. Biotechniques. 21, 934-936 (1996).
  12. Taylor, C. J., Satoor, S. N., Ranjan, A. K., Pereira e Cotta, M. V., Joglekar, M. V. A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum. Experimental Diabetes Research. 2012, (2012).
  13. Ichikawa, M., Akiyama, H. A Combination of Extraction Reagent and DNA Microarray That Allows for the Detection of Global MiRNA Profiles from Serum/Plasma. Methods Mol. Biol. 1024, 247-253 (2013).
  14. Fromm, B., Harris, P. D., Bachmann, L. MicroRNA preparations from individual monogenean Gyrodactylus salaris-a comparison of six commercially available totalRNA extraction kits. BMC Res. Notes. 4, 217 (2011).
  15. Li, Y., Kowdley, K. V. Method for microRNA isolation from clinical serum samples. Anal. Biochem. 431, 69-75 (2012).
  16. McAlexander, M. A., Phillips, M. J., Witwer, K. W. Comparison of Methods for miRNA Extraction from Plasma and Quantitative Recovery of RNA from Cerebrospinal Fluid. Frontiers in Genetics. 4, 83 (2013).
  17. Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells. Mol. Cell. 46, 893-895 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RNARNAPhase Lock GelRNARNARNAUVBioanalyzer

מאמרים קשורים