מאמר שיטה

שילוב מניפולציה מולקולה בודדת והדמיה לחקר אינטראקציות החלבון-DNA

DOI:

10.3791/51446

⸱

27 באוגוסט 2014

 ,  ,  ,  , 
1LENS - European Laboratory for Non-linear Spectroscopy, University of Florence, 2Chemistry Research Laboratory, University of Oxford, 3Department of Biology, University of Florence, 4Department of Physics and Astronomy, University of Florence, 5National Institute of Optics-National Research Council, Italy, 6International Center of Computational Neurophotonics

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מתארים את המכשור ושיטות לגילוי מולקולות חלבון בודד fluorescently שכותרתו אינטראקציה עם מולקולת DNA חד התלויה בין שני microspheres הלכוד אופטי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המאמר מתאר את השילוב של פינצטה אופטית וזיהוי פלואורסצנטי של מולקולה בודדת לחקר אינטראקציה בין חלבון ל-DNA. השיטה מציעה הזדמנות לחקור אינטראקציות המתרחשות בתמיסה (ובכך להימנע מבעיות עקב משטחים קרובים כמו בשיטות אחרות של מולקולה בודדת), לשלוט בהרחבת ה-DNA ולעקוב אחר דינמיקת האינטראקציה כפונקציה של פרמטרים מכניים ורצף DNA. השיטות להקמת לכידה אופטית מוצלחת ולוקליזציה ננומטרית של מולקולות בודדות מודגמות. אנו מדגימים את תנאי הניסוי המאפשרים לחקור את האינטראקציה של מדכא לקטוז (lacI), המסומן ב-Atto532, עם מולקולת DNA המכילה רצפי מטרה ספציפיים (אופרטורים) לקשירת LacI. השיטה מאפשרת תצפית על אינטראקציות ספציפיות אצל המפעילים, כמו גם דיפוזיה חד מימדית של החלבון במהלך תהליך חיפוש המטרה. השיטה ישימה באופן נרחב לחקר אינטראקציות חלבון-DNA אך גם למנועים מולקולריים, כאשר רצויה שליטה במתח המופעל על פולימר מסלול השותף (למשל אקטין או מיקרו-צינורות).

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מולקולה בודדת טכניקות (SM) פיתחו במידה רבה בשלושים השנים האחרונות להיענות לצורך להתגבר על חלק מהמגבלות של מדידות מסורתיות, בתפזורת פתרון 1-3. המניפולציה של מולקולות ביולוגיות בודדות יצרה הזדמנות כדי למדוד תכונות מכאניות של biopolymers 4 ולשלוט בפרמטרים מכאני חלבונים 5 ואינטראקציות החלבון-DNA 6,7 של. גילוי הקרינה SM, לעומת זאת, מייצג את הכלי תכליתי להפליא ללימוד פעילות חלבון במבחנת in vivo, שמוביל לאפשרות של איתור ומעקב אחר מולקולות בודדות בדייקנות ננומטר. באמצעות התאמה של מכשיר נקודת התפשטות פונקציה לתמונת SM, למעשה, אחד יכול להשיג לוקליזציה עם דיוק תלוי בעיקר על יחס אות לרעש (SNR) ולהגיע לגבול של כננומטר 8,9. מתודולוגיות אלה למצוא חזקותיישומים בחקר הדינמיקה של חלבוני מנוע, כמו גם של תהליכי דיפוזיה שבבסיס חיפוש יעד במחייב חלבוני DNA. היכולת של קביעת קבועי דיפוזיה כפונקציה של רצף DNA, זמן מגורים ביעד ומדידה מדויקת של אורך DNA חקר במהלך אירועי דיפוזיה חד ממדיים, מייצגת כלי רב עוצמה ללימוד דינמיקת אינטראקציה החלבון-DNA ולבירור של מנגנוני חיפוש יעד ספציפי.

לאחרונה, השילוב של שתי הטכניקות הללו יצר דור חדש של setups הניסיוני 10-14 המאפשר מניפולציה בו זמנית של מצע ביולוגי (למשל נימה אקטין או מולקולת DNA) ואיתור / לוקליזציה של אנזים שותף באינטראקציה (לדוגמא שרירן או חלבון קושר DNA). היתרונות של טכניקות אלה בעיקר לנוח על האפשרות של הפעלת שליטה מכאנית על פני הפולימר הלכוד, וכך ENAבלינג המחקר של דינמיקת אינטראקציה מול כוחות או מומנטים. כמו כן, המתודולוגיה מאפשרת מדידת תגובות ביוכימיות רחוקה מהמשטח, הימנעות אחת המגבלות העיקריות של שיטות קלאסיות SM, כלומר, (שקופית זכוכית או microspheres) את הצורך בקיבוע של המולקולות הנחקרות על משטח.

השילוב של שתי טכניקות מולקולות בודדות דורש התגברות על כמה קשיים טכניים, בעיקר כתוצאה מהדרישות של יציבות מכאנית ויחס אות לרעש הולם (במיוחד כאשר דורש לוקליזציה בדייקנות ננומטר) 15. במיוחד, כאשר צימוד גילוי הקרינה SM עם פינצטה אופטית, הפחתת הרעש וphotobleaching מלייזרי לכידת אינפרא אדום 16 והשליטה של מאגרים ביוכימי להרכבה של הקומפלקסים הביולוגיים וביצועים של המדידות הניסיוניות 11 הם בעלי חשיבות עליונה. כאן, אנו מתארים את השיטות לביצוע מוצלחמדידות בהתקנת לוקליזציה לכידה / SM הקרינה כפולה. המתודולוגיה מאוירת בדוגמא חלבון זה מדכא לקטוז (לאצי) שכותרתו fluorescently (עם Atto532) וזוהה כהוא נקשר למולקולת הדנ"א (לכודה בין שתי פינצטה אופטית) המכיל רצפי אצים ספציפיים מחייבים (כלומר, מפעילים) של. אנו מדגימים את היעילות של השיטה באיתור מחייב של לאצי לDNA ודיפוזיה לאורך קווי המתאר שלה בתהליך חיפוש היעד. השיטה ישימה לכל שילוב של רצף DNA וחלבון קושר DNA, כמו גם למערכות אחרות (microtubules או סיבי אקטין וחלבוני מנוע אינטראקציה איתם).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

.1 הגדרת פינצטה אופטית עם ננומטר יציבות

ההתקנה הניסיונית חייבת לספק שתי פינצטה אופטית עם מצביע על יציבות בתנודות רמת ננומטר ועוצמת לייזר הלכידה מתחת ל -1%. שילוב של תנאים אלה יבטיח יציבות ננומטר של המשקולת תחת מתח טיפוסי (1 PN - כמה עשרות PN), נוקשות מלכודת (0.1 PN / ננומטר) ורוחב פס מדידה (שיעור רכישת תמונה 20 שניות -1). ערכה של הגדרת הניסוי מתוארת באיור 1.

  1. עיצוב אופטי פינצטה ובניית 15,17:
    1. הר המנגנון הניסיוני על שולחן אופטי עם מבודדים פעילים כדי להפחית את התנודות מכאניות. הר מבנה מיקרוסקופ על מבודדי אלסטומרי לספוג רעש אקוסטי ותהודה מכאנית של מבנה מיקרוסקופ.
    2. הכנס המבודד אופטי בדרכו של לייזר ההשמנה, קרוב למקור הלייזר, לימיןeduce תנודות משרעת אקראיות בשל משוב אופטי.
    3. להפחית את אורך הדרך של לייזר הלכידה ככל האפשר ולהקיף את כל הדרך בקופסא אטומה כדי להפחית תנודות הצבעה הלייזר בשל זרמי אוויר ומערבולות.
    4. צור פינצטה הכפולה אופטית על ידי פיצול מקור לייזר אינפרא אדום קרוב יחיד (Nd: YAG לייזר, 1,064 אורך גל) לשתי קורות עם קיטובים מאונך. אין להשתמש במלכודות-משותף זמן, כי הם גורמים לתנודה של המשקולת תחת מתח 12.
    5. השתמש deflectors acousto אופטי (AODs) מונע על ידי סינתיסייזרים ישירים דיגיטליים (DDSs) כדי לאפשר תנועות עדינות של מלכודת אחת (לפחות) ורגולציה מדויקת של מתח DNA. DDSs לאפשר יציבות מלכודת טובה יותר מאשר מתנדים בשליטת מתח (VCOs).
    6. הכנס שתי דיודות גלאי הרבע (QDPs) במישור המוקד האחורי של הקבל כדי לזהות את המיקום של חרוזים לכודים עם דיוק תת ננומטר.
  2. בדוק שf העצמהluctuations של לייזר ההשמנה בכניסה מיקרוסקופ הוא מתחת ל -1% על ידי שימוש בדיודת אור עם רוחב פס גדול יותר משיעור רכישה של תמונה.
  3. לבדוק את היציבות מצביעה משני לייזרי השמנה:
    1. הכינו חרוזים סיליקה בחיץ פוספט: לדלל 20 μl של חרוזים סיליקה (1.54 מיקרומטר, מוצקים 10%) ל1 מ"ל של אצטון, sonicate 30 שניות, בקצרה מערבולת, ו צנטריפוגות 2 דקות ב 19,000 x גרם. Resuspend באצטון 1 מ"ל ולשטוף חוזרים. Resuspend ב 1 מ"ל של חיץ פוספט 50 מ"מ, לשטוף 2 פעמים, ולבסוף resuspend ב50 מ"מ חיץ פוספט 100 μl.
    2. לכייל פינצטה אופטית עם חרוזים סיליקה: להכין תא זרימה על ידי הצמדת coverslip לשקופית מיקרוסקופ באמצעות קלטת דו דביקה (כ -60 מיקרומטר עבה). לזרום 1 מ"ג / מ"ל ​​BSA ולחכות 3 דקות. לזרום חרוזים סיליקה בדילול 1 / 1,000 בחיץ פוספט ולאטום את תא הזרימה עם גריז סיליקון. חרוז אחד מלכודת בכל מלכודת ולכייל את המלכודות בשיטת ספקטרום הכח 18.
    3. הכינו חרוזים סיליקה בתצטטי pentyl וnitrocellulose: לדלל 20 μl של חרוזים סיליקה (1.54 מיקרומטר, מוצקים 10%) ל1 מ"ל של אצטון, sonicate 30 שניות, בקצרה מערבולת, ו צנטריפוגות 2 דקות ב 19,000 x גרם. Resuspend באצטון 1 מ"ל ולשטוף חוזרים. Resuspend ב 1 מ"ל של אצטט pentyl ולשטוף 2 פעמים. לבסוף resuspend אותם אצטט pentyl עם nitrocellulose 0.1% מומסים ביצטט pentyl.
    4. מורחים 2 μl של חרוזים 1.54 מיקרומטר קוטר סיליקה מומסים בnitrocellulose 0.1% אצטט pentyl על פני השטח של coverslip (24 x 24 מ"מ) באמצעות coverslip שני (24 x 60 מ"מ). צרף את coverslip לשקופית מיקרוסקופ באמצעות שתי חתיכות של נייר דו צדדי כדי ליצור תא זרימה. מלא את זרימת התאים עם חיץ פוספט 50 מ"מ ולאטום אותו עם גריז סיליקון.
    5. חרוז סיליקה תמונה אחת במיקרוסקופיה brightfield בהגדלה 2,000X. שדה הראייה צריך להיות מיקרומטר 7 X 5 שנרכש ב768 x 576 פיקסל, כך שתמונת חרוז יש קוטר של 190 עמ 'ixels. לפצות מרחף תרמית עם תוכנת משוב ש, כמו נ"צ. 17, את מחשבת את מיקום XY מcentroid התמונה וz מהטבעות העקיפה ומתקן מרחף נע שלב piezo עם ננומטר דיוק או טוב יותר.
    6. חפיפת מרכז המלכודת נשארת עם מרכז חרוז (רמות אות XY מQDP חייבת להיות זהות נמדד במהלך הכיול) ולמדוד את רעש העמדה וסטיית התקן שלה מQDP. חזור על המדידה למלכודת הנכונה.

.2 מולקולה בודדת לוקליזציה עם דיוק ננומטר

  1. עיצוב מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו15,19 הבנייה
    1. השתמש ביעילות קוונטית גבוהה וCCD-מוכפל אלקטרון כדי להגיע ליחסי אות לרעש גבוהים הנדרשים לדיוק לוקליזציה ננומטר.
    2. בחר אופטיקה כדי לקבל גודל ~ 80 ננומטר פיקסל תמונה (לדוגמא, הגדלת תמונה ~ 200X עם גודל פיקסל מצלמה של 16 מיקרומטר). זה suffiבמידה מספקת קטן להזניח את שגיאת לוקליזציה בשל pixelation 8, אבל גדול מספיק כדי לאסוף מספר לא מבוטל של פוטונים לפיקסל.
    3. כמקור עירור, להשתמש באור הלייזר שהוא unpolarized (על ידי עובר דרך סיבים אופטיים שאינו-שמירה על קיטוב) או מקוטב מעגלי (על ידי עובר דרך λ / 4 waveplate) על מנת למקסם את העירור של chromophores אחת, ללא קשר לנטייתם.
    4. בחר מסנני bandpass הפליטה שיעילות חתוכים שני אורות לייזר העירור והשמנה. הערה: בניסויים שלנו אנחנו כותרתו החלבון שלנו עם צבע Atto532 ומשמשים מסנן פליטת bandpass מרוכז ב ננומטר 600 עם 100 רוחב פס ננומטר.

.3 מיקרופלואידיקה

כדי להשיג שליטה מדויקת של חילופי חיץ והרכבה 'מטומטם', כלומר, העיגון של מולקולת DNA חד בין שני microspheres הלכוד אופטי, זרימה רבת ערוצים למינרית בנויות מותאמת אישיתמערכת חייבת להיות מפותחת. זה מורכב על ידי זרימת מערכת בקרת לחץ (איור 2) קאמרי, לחץ מאגר ו.

  1. הכנת תא זרימה
    הערה: תא הזרימה המשמש לניסויי מולקולה בודדת באינטראקצית החלבון-DNA יש רצוי 4 פתחי הכניסה ויציאה 1, כדי לאפשר לעד 4 תזרים חיץ מקביל, כל אחד מהם מכיל אחד מהמרכיבים השונים הנדרשים לניסוי: חרוזים, DNA, fluorescently שכותרתו חלבון, וחיץ הדמיה. הפרדה של הרכיבים בזרימת הערוצים מאפשרת הרכבה יעילה של המשקולת. יתר על כן, ערוץ ההדמיה הוא שימושי כדי למנוע הקרינה רקע מחלבונים לשדר ולהשיג את יחס אות לרעש הגבוה הנדרש ללוקליזציה של החלבון קושר DNA עם דיוק מסדר גודל של כמה ננומטרים.
    1. חורי מקדח 1 מ"מ קוטר בשקופית מיקרוסקופ (76 x 76 x 1 מ"מ) עם יהלומים-קצה, על מנת ליצור 4 פתחי הכניסה ויציאה אחת.
    2. ה נקייהמיקרוסקופ האלקטרוני שקופיות עם אתנול ולמרכז את היציאה עם O-הטבעת מוכנסת וטבעת הדבק בשקופית המקיפה את חורי הגישה. זה הוא יסוד ללבוש כפפות במהלך שלב זה, כדי למנוע טביעות אצבעות, שיפריעו לתהליך ההדבקה.
    3. הצמד את NanoPorts לשקופית, ולמקם אותו בתנור שחומם מראש ב 180 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 כדי לאפשר התקשרות מלאה.
    4. צייר את תבנית קווי המתאר של תא הזרימה על פיסת נייר. הערוצים צריכים להיות ~ רחבים 3 מ"מ ולהתאים את עמדת חורים בשקופית מיקרוסקופ.
    5. מניחים את הציור על גבי שתי חתיכות של Parafilm, ועם אזמל לבצע קיצוצים חדים ומתמשכים לאורך קו המתאר נמשך. הסר את כל בליטה שנוצרה. מחק את שכבת Parafilm נמוכה יותר, אשר רק משמשת להבטחת תמיכה נקייה.
    6. מניחים את שקף מיקרוסקופ המכיל NanoPorts המצורף הפוכה בתמיכה מתכתית.
    7. בזהירות ליישר את קווי המתאר תא Parafilm עם החורים, מה שהופך את ה בטוחהבparafilm לא obtrude פתחי הכניסה ויציאה של התא.
    8. כסה עם coverslip ניקה מיקרוסקופ (62 x 56 x 0.15 מ"מ) ולהסיר Parafilm עודף המקיף את התא בזהירות.
    9. מניחים שני בלוקים חום, מחוממים בעבר ב120 ° C, על גבי תא הזרימה להפעיל לחץ קבוע על זה. בואו Parafilm להמס כ 25 דקות.
  2. מאגר לחץ ומכולות חיץ
    מאגר הלחץ צריך להיות עשוי מפרספקס (או דומה) ולאפשר אירוח של שש מכולות חיץ. האפשרות שיש לפחות שתי מכולות חיץ נוספות משפרת את גמישות כלי. שים לב שמכל שקוף וצינורות במידה ניכרת לסייע בטיפול בזרימת מערכת ופתרון בעיות של בועות אוויר שנלכדו. המזרקים luer סטרילי וחד פעמי נעילת קצה (2.5 מ"ל), שממנו הבוכנות הוסרו בעבר, הם מיכל חיץ טוב ולאפשר חיבור קל עם צינורות היניקה. ודא שנפח הנוזל הכולל הוא קטן בהשוואה לבתוך מאגר הלחץ, תנאים הכרחיים להשגת זרימה חלקה ויציבה נפח האוויר.
    1. חבר שסתומי כיבוי ביציאה של מכולות החיץ להפיכת זרימת החיץ או לבטל במהלך הניסויים.
    2. הר תא הזרימה על הבמה מיקרוסקופ. חבר את שסתומי הכיבוי לפתחי כניסת תא זרימה עם צינורות polyetheretherketone (קוטר ~ 150 מיקרומטר הפנימי) ואבזרי flangeless. להוסיף ~ 3 סנטימטר של צינורות פרופילן אתילן פלואור (קוטר ~ 500 מיקרומטר הפנימי) כזיקה בין צינורות ומכלולי NanoPort של תא הזרימה. צעד זה הוא הכרחי על מנת לצמצם את זרימת החיץ בכניסה החדר, כדי למנוע שבירה של תא הזרימה או ניתוק NanoPort מהזכוכית. השימוש בצינורות בקוטר פנימי גדולים לבד, ומצד שני, היה דורשים כמויות ענק של דגימות ביולוגיות.
    3. חבר את שקע תא זרימה לצינור פלקון פתוח בלחץ אטמוספרי. זהצינור משמש כלרשות לחיץ זורם מתוך תא הזרימה.
  3. מערכת בקרת לחץ
    1. לבנות מערכת בקרת לחץ מסוגלת דק התאמת לחץ האוויר בתוך מאגר הלחץ. ניתן לעשות זאת על ידי השימוש בשני שסתומים מבוקרת מחשב סולנואיד, אחד מחובר למקור לחץ +0.5 כספומט (מדחס) ושנייה אחת ללחץ אטמוספרי. שסתומים סולנואידים נפתחים שוב ושוב לכ 7 אלפית שניים כדי להגדיל או להקטין את הלחץ בקו עד שיגיע לערך הרצוי. הערה: גישה זו הותאמה מקרלוס בוסטמנטה 20, וזה מניב תזרים חלק יותר מאשר באמצעות משאבת מזרק מנוע דריכה 21.
    2. להוסיף מתמר לחץ נשלט על ידי תוכנה אישית בכתב לפקח על הלחץ האפקטיבי שהופעל על מאגר הלחץ. לחצי עבודה אופייניים הם בסדר הגודל של 20 mbar להרכבת משקולת ו200 mbar לשטיפת רכיבי מערכת זרימה.

.4 DNA טאי-לינג עם Biotinylated Deoxycytidine טריפוספט (ביוטין-dCTP)

מולקולת הדנ"א צריכה להיות יותר מ 1 מיקרומטר כדי להקל על הארכתה על פי תזרים ועיגון לחרוזי לכודים. יתר על כן, DNA ארוך ימנע אור לכידת IR ממאיר את החלבון הקושר DNA. זה רלוונטי במיוחד משום שקליטה של ​​IR אור מתוצאות chromophore נרגשות בphotobleaching המוגבר. הערה: במחקר הנוכחי, מולקולת DNA הייתה ארוכה 3.7 מיקרומטר. המולקולה מכילה שלושה עותקים של המפעיל העיקרי O1 ועותק אחד של כל אחד משני מפעילי העזר, O2 וO3. רצפים אלה הוכנסו באמצע המולקולה, ולכן תוצאה במרחק שווה כ מחרוזי לכודים וקרן לייזר אינפרא אדום.

  1. מערבבים pmol 1 של DNA 3'-קצוות ליניארי עם 60 pmol של ביוטין-14-dCTP, 4 μl של חיץ 5x מסוף deoxynucleotidyl transferase (TDT) (ca M אשלגן 1codylate, 125 מ"מ טריס, 0.05% (v / v) טריטון X-100, 5 מ"מ CoCl 2 (pH 7.2 ב25 ° C)) ו1.5 μl של TDT וDDH 2 O בהיקף כולל של 20 μl. דגירה את התערובת על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. זה יגרום תוספת של עד 60 נוקלאוטידים לגפי DNA. הערה DNA ש3'-סככות הם זנב עם יעילות גבוהה יותר מאשר קצוות שקועי או בוטים.
  2. לטהר DNA זנב עם עמודות ספין או פנול / חילוץ כלורופורם ומשקעי אתנול שלאחר מכן להסיר CoCl 2 ממאגר תגובת TDT.
  3. לאחר טיהור, ניתן לאחסן DNA על 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות או ב-20 מעלות צלזיוס למשך תקופות ארוכות יותר, אך להימנע הפשרה וrefreezing חוזרים ונשנים.

חלבון תיוג .5 תיאול קבוצות עם ATTO532

תיוג באמצעות שינוי של שאריות ציסטאין אסור לשנות את הפעילות של החלבון. כדי להתגבר על בעיה זו, אנו משמשים מוטציה לאצי, LacIQ231C, which נושא רק ציסטאין אחד לכל מונומר בעמדה 231. מוטציה זו שומרת על אותם מאפיינים של הסוג בר ושינויים כימיים בעמדה 231 הוכח שלא להתערב ביציבות חלבון 22. הערה: אנו כותרתו החלבון עם maleimide ATTO532.

  1. ודא כי החלבון מומס בחיץ עם pH הנע 7.0-7.5 ועם ריכוז הנע בין 2 ל -10 מ"ג / מ"ל. הערה: בניסויים אלה, לאצי היו מומס בפוספט אשלגן גלוקוז 0.3 M, 5%, pH 7.5 (מאגר).
  2. לפזר Tris- (2-carboxyethyl) hydrochloride phosphine (TCEP) לריכוז סופי של 100 מ"ג / מ"ל בH 2 O. פתרון TCEP חייב להיות מוכן טרי לפני השימוש.
  3. מערבבים של החלבון עם TCEP 3 μl ומערבולת בזהירות 100 μl.
  4. ממיסים את הצבע בN, N -dimethylformamide (DMF) לריכוז סופי של 10 מ"ג / מ"ל לעבוד בתנאי אור נמוכים. מערבולת מומסת עד לחלוטין.
  5. מיל תגובהx: הוסף 33 μl של צבע לחלבון + TCEP ומערבולת בזהירות. ספין מהיר כדי לאסוף כמה שיותר פתרון אפשרי.
  6. דגירה את תערובת התגובה למשך 2 שעות שבייקרה (8,000 סל"ד) בשעה 20 ° C (או ב4 CO ° / N), מוגן מפני אור.
  7. לפזר L-גלוטתיון מופחת (GSH) לריכוז סופי של 100 מ"ג / מ"ל בH 2 O. הוסף 3 μl לתערובת התגובה ולדגור על שייקר ב8,000 סל"ד במשך 15 דקות. GSH יהיה לעצור את התגובה על ידי חסימת תגובתיות של קבוצות תיאול.
  8. לטהר את החלבון שכותרתו באמצעות עמודות סטנדרטי סינון ג'ל, דיאליזה או ריכוז ספין. הערה: בניסויים אלו, אצי שכותרתו היה מטוהר באמצעות 10 ריכוז ספין הפסקת kDa.
    1. לדלל את תערובת התגובה עם עד 12 מ"ל של חיץ, להחיל אותו על מכשיר concentrator, ו צנטריפוגות זה ב8,000 XG, 1 שעות, 4 ° C.. האצים שכותרתו כך מרוכז לנפח סופי של כ -500 μl ועודפי הצבע עובר את הקרום בפלהw-דרך. מחק את הזרימה דרך וחזור על שלב 5.8.1 לפחות שלוש פעמים.
  9. מחלקים את החלבון שכותרתו לתוך aliquots קטנים וחנות ב -80 מעלות צלזיוס. הימנע מהקפאה והפשרה חוזרות ונשנות.

.6 משולבת אופטי השמנה וניסויים דימות פלואורסצנטי מולקולה בודדת

  1. הוסף 1 מ"ל של חיץ למכולות החיץ ולהחיל 200 לחץ mbar לשטוף את צינורות חיבור וזרימת תא. על מנת למקסם את הדיפוזיה של החלבון מחייב את DNA, כאן ובשלבים הבאים, חיץ עשוי להיות מוחלף עם חיץ כוח יוני נמוך. הערה: בניסויים אלו, השתמשנו 0.5x TBE.
  2. לבדוק את קיומו של בועות אוויר, שעלול לשבש את הזרימה חלקה. קפיצי עדינים על הצינור לשקע יעזרו להסיר את כל בועות שנותרו.
  3. להקטין את הלחץ ל20 mbar ולוודא שכל הערוצים והצינורות ברורים מבועות אוויר והחיץ זורם עם מהירויות דומות בכל הערוצים.
  4. הכן את הדגימות לנפח סופי של μl 300: חרוזי פוליסטירן streptavidin מצופה 1.87 מיקרומטר; 20 PM של DNA ליניארי, biotinylated על שני הגפיים על פי סעיף 4; 300 PM של tetramer האצים שכותרתו עם ATTO532 לפי סעיף 5.
  5. להוסיף כל דגימה לאחת מכולות המזרק לפי הסדר הבא: חרוזים בערוץ הראשון, DNA בערוץ השני, שלישי עם חיץ ההדמיה בלבד (מערכת + נבלות חמצן חיץ) וחלבון הנקרא בערוץ הרביעי.
  6. הפעל את הזרימה ב200 mbar במשך 3 דקות כדי לאפשר לדגימות להגיע בתוך ערוץ הזרימה. לאחר מכן להפחית את הלחץ ל20 mbar.
  7. בעוד ההדמיה הערוץ הראשון תחת תאורה בשדה בהירה, לעבור על שתי פינצטה אופטית ולתפוס חרוז קלקר בכל מלכודת.
  8. לנוע במהירות לערוץ השני, כדי למנוע שחרוזים אחרים ליפול לתוך המלכודות. שים לב שההגעה בערוץ DNA היא מורגשת בקלות עד סוף זרימת חרוז.
  9. באמצעות one AOD, להעביר מלכודת אחת (חרוז) הלוך ושוב בקרבתו של חרוז האחר כדי לאפשר את הקובץ המצורף של DNA מורחב הזרימה בין שני חרוזים לכודים אופטי. כאשר משקולת DNA נוצר, חרוז סטטי מתחיל הבא התנועה של חרוז שהוא פעיל נע הלוך ושוב על ידי המלכודת.
  10. לנוע במהירות לערוץ החיץ ולכבות את זרימת החיץ. לבצע ניתוח עקומת כוח הארכת 4,23-25 ​​כדי לאמת את הנוכחות של מולקולת DNA חד. אם מולקולה יותר מפעם אחת היא הווה (כלומר, enthalpic, העלאת שלב של עקומת כוח ההארכה מתרחש באורך קצר יותר מאורך גובה DNA), לבטל את המשקולת ולהתחיל שוב מצעד 6.7.
  11. ברגע שמשקולת DNA בודדת מתקבלת, להפעיל את הזרימה שוב ולהזיז את המשקולת לערוץ החלבון. לעבור למיקרוסקופ פלואורסצנטי השדה הרחב לעקוב אחר האינטראקציה של הכותרת לאצי עם DNA. כבה את הזרימה ולהתחיל רכישה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בניסוי מוצלח, חלבונים שכותרת אחת (או יותר) עוברים מחייבים / דיפוזיה לא מחייבת ו / או monodimensional לאורך מולקולת הדנ"א (איור 3 א). לוקליזציה של חלבונים לאורך מולקולת הדנ"א מאפשרת כימות של פרמטרים הקינטית כפונקציה של רצף DNA. כאשר תנאי חיץ גורמים דיפוזיה 1D מיושמים, ניתן לעקוב אחר מסלולי חלבון, ולקבוע, למשל, מקדם הדיפוזיה D 1D.

המיקום המדויק של נקודה אחת, בכל מסגרת, ניתן לקבוע על ידי ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעשור האחרון, טכניקות מניפולציה וההדמיה מולקולה בודדות שראו התקדמות גדולה במונחים של רזולוציה מרחב ובזמן. השילוב של טכניקות מניפולציה והדמיה הוא בבסיס של מכשירים רבי עוצמה שמאפשר כעת את השליטה בתנאים המכני של פולימר ביולוגי יחיד, כגון חוטי DNA, RNA או cytoskeletal, והלוקליזציה בו זמנית של חלבונים בודדים אינטראקציה עם אותו הפולימר . שליטה התנאים מכאניים של הפולימר שנלכד היא של עניין מיוחד. למעשה, בתאים חיים, חומצות גרעין ברציפות עוברות לחץ מכאני שנגרם על ידי אינטראקציה אנזימים וחלב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים Gijs Wuite, ארווין JG פיטרמן, ופיטר גרוס לעזרה עם מיקרופלואידיקה וAlessia Tempestini לעזרה עם הכנת מדגם. מחקר זה מומן על ידי תכנית האיחוד האירופי המסגרת השביעית (FP7 / 2007-2013) על פי הסכם מענק N ° 284,464 ומהמשרד האיטלקי לחינוך, אוניברסיטות והמחקר FIRB 2,011 RBAP11X42L006, Futuro בRicerca 2,013 RBFR13V4M2, ובמסגרת של פרויקט NANOMAX הדגל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מבודדים אלסטומרייםניופורטNewdampבחר את האלסטומר Newdamp המתאים בהתאם למשקל המיקרוסקופ ותדרי התהודה
מבודד אופטיאופטיקה למחקרלייזר IO-3-YAG-VHP
Nd:YAG, אורך גל של 1,064 ננומטרספקטרה-פיזיקהMillennia IR
מסיטים אקוסטו-אופטיים (AODs)& אופטו-אלקטרוניקהDTS-XY 250
סינתיסייזרים דיגיטליים ישיריםAnalog Devices
גלאי רביע פוטודיודותOSI אופטואלקטרוניקהSPOT-15-YAG
DIO ולוח FPGANational Instruments מנורתSchott
KL 1500 LCD
מעבהאולימפוסU-AAC 1.4NA Aplanat Apchromat
ObjectiveNikonCFI Plan Apochromat 60x 1.2NA טבילה
532 ננומטר לייזרקוהרנטיספיר
CCD 200X ו-2000XHamamatsu XC-ST70 CE
CCD מוכפל אלקטרונים C9100-13
שלב פייזו עם דיוק ננומטרPhysik InstrumenteP-527.2CL 
מסנן פליטהChroma Technologies600/100m
חרוזי סיליקה (1.54 מ"מ)Bangs LaboratoriesSS04N/5303
אלבומין מסרום בקר (BSA)Sigma AldrichB4287
פנטיל אצטט Sigma Aldrich46022נוזל ואדים דליקים (מס' 1272/2008)
ניטרוצלולוזSigma AldrichN8267-5EAמוצק דליק  (מס' 1272/2008)
בלוק חוםMPM Instruments SrlM502-HBDעם 2 בלוקים נשלפים; מחומם מראש ב-120 מעלות; C
NanoPort מרכיבה אתUpchurch Scientific Inc.צינורות N-333
Polyetheretherketone אפצ'רץ' סיינטיפיק בע"מ1535
מחזיק מתכתי תוצרת בית להרכבת מאגר הלחץ בתא הזרימה עשוי
לואר 2.5 מ"לTerumoSS 02LZ1
שסתומי כיבוי אפצ'רץ' סיינטיפיק בע"מP-732
אביזרים ללא אוגן אפצ'רץ' סיינטיפיק בע"מLT-111
צינורות אתילן פרופילן פלואור אפצ'רץ' סיינטיפיק בע"מ1549
שני שסתומי סולנואיד נשלטים על ידי מחשבקליפרד, סינסינטי, ארה"בET-2-H-M5
מתמר לחץDruck LTDPTX 1400
ביוטין-14-dCTP Life Technologies19518-018
Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT)ThermoscientificEP0161
ATTO532 maleimideSigma Aldrich68499
N,N-dimethylformamide (DMF) Sigma Aldrich227056נוזל דליק, מזיק לספיגת העור. מגרה, טרטוגן. H226; H303; H312; H316; H319; H331; H360; עמ' 201; עמ' 261; עמ' 280; עמ' 305; עמ' 351; עמ' 338; P311
טריס-(2-קרבוקסיאתיל)פוספין הידרוכלוריד (TCEP) Sigma AldrichC4706
L-גלוטתיון מופחת (GSH)Sigma AldrichG4251רעילות חריפה, דרך הפה (קטגוריה 5), H303
Amicon Ultra-15, ממברנת PLQK Ultracel-PL, 10  ריכוזי ספין ניתוק kDaMerck MilliporeUFC901024
חרוזי פוליסטירן מצופים סטרפטווידין 1.87 ומיקרו; מSpherotech, Inc.סמ"פ-15-5
A הלוגן במים מזרקי קצה נעילה פרספקס

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Monico, C., Capitanio, M., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S. Optical Methods to Study Protein-DNA Interactions in Vitro and in Living Cells at the Single-Molecule Level. International journal of molecular sciences. 14, 3961-3992 (2013).
  2. Tinoco, I., Gonzalez, R. L. Biological mechanisms, one molecule at a time. Genes & development. 25, 1205-1231 (2011).
  3. Capitanio, M., et al. Exploring molecular motors and switches at the single-molecule level. Micr. Res. Tech. 65, 194-204 (2004).
  4. Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258, 1122-1126 (1992).
  5. Block, S. M., Goldstein, L. S., Schnapp, B. J. Bead movement by single kinesin molecules studied with optical tweezers. Nature. 348, 348-352 (1990).
  6. Wang, M. D., et al. Force and velocity measured for single molecules of RNA polymerase. Science. 282, 902-907 (1998).
  7. Capitanio, M., et al. Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke. Nat Methods. 9, 1013-1019 (2012).
  8. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82, 2775-2783 (2002).
  9. Yildiz, A., et al. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300, 2061-2065 (2003).
  10. Biebricher, A., Wende, W., Escude, C., Pingoud, A., Desbiolles, P. Tracking of single quantum dot labeled EcoRV sliding along DNA manipulated by double optical tweezers. Biophys J. 96, 50-52 (2009).
  11. Candelli, A., Wuite, G. J., Peterman, E. J. Combining optical trapping, fluorescence microscopy and micro-fluidics for single molecule studies of DNA-protein interactions. Physical chemistry chemical physics : PCCP. 13, 7263-7272 (2011).
  12. Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins. Optics and Lasers in Engineering. 45, 450-457 (2007).
  13. Harada, Y., et al. Single-molecule imaging of RNA polymerase-DNA interactions in real time. Biophys J. 76, 709-715 (1999).
  14. van Mameren, J., et al. Counting RAD51 proteins disassembling from nucleoprotein filaments under tension. Nature. 457, 745-748 (2009).
  15. Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. Fiona in the trap: the advantages of combining optical tweezers and fluorescence. J Opt A: Pure Appl Opt. 9, s157(2007).
  16. Dijk, M. A., Kapitein, L. C., Mameren, J., Schmidt, C. F., Peterman, E. J. Combining optical trapping and single-molecule fluorescence spectroscopy: enhanced photobleaching of fluorophores. J Phys Chem B. 108, 6479-6484 (2004).
  17. Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).
  18. Capitanio, M., et al. Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals. Review of Scientific Instruments. 73, 1687-1696 (2002).
  19. Elangovan, R., et al. An integrated in vitro and in situ study of kinetics of myosin II from frog skeletal muscle. J Physiol. 590, 1227-1242 (2012).
  20. Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules. Biophysical Journal. 79, 1155-1167 (2000).
  21. Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nat Methods. 5, 517-525 (2008).
  22. Rutkauskas, D., Zhan, H. L., Matthews, K. S., Pavone, F. S., Vanzi, F. Tetramer opening in LacI-mediated DNA looping. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16627-16632 (2009).
  23. Marko, J. F., Siggia, E. D. Stretching DNA. Macromolecules. 28, 8759-8770 (1995).
  24. van Mameren, J., et al. Unraveling the structure of DNA during overstretching by using multicolor, single-molecule fluorescence imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 18231-18236 (2009).
  25. Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. Stretching DNA with optical tweezers. Biophys J. 72, 1335-1346 (1997).
  26. Ma, H., Long, F., Zeng, S., Huang, Z. L. Fast and precise algorithm based on maximum radial symmetry for single molecule localization. Opt Lett. 37, 2481-2483 (2012).
  27. Parthasarathy, R. Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers. Nat Methods. 9, 724-726 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Optical TweezersSingle Molecule FluorescenceDNA Force ExtensionLactose RepressorFlow Cell AssemblyNanometer LocalizationTarget Search DynamicsMechanical ControlFluorescence Microscopy

מאמרים קשורים