Method Article

טכניקת Microfluidic לחקור deformability הסלולרי

DOI:

10.3791/51474

⸱

September 3rd, 2014

 ,  ,  , 
1Department of Integrative Biology and Physiology, University of California, Los Angeles, 2Department of Aerospace and Mechanical Engineering, University of Notre Dame, 3Molecular Imaging Center, University of Southern California

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מדגימים מבוססי assay מיקרופלואידיקה כדי למדוד את הזמנים לתאים למעבר דרך רצף של אילוצי מיקרון בקנה מידה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו פירוט עיצוב, ייצור, ושימוש במכשיר microfluidic להעריך deformability של מספר רב של תאים בודדים באופן יעיל. בדרך כלל, נתונים ל~ 10 2 תאים ניתן לרכוש בתוך ניסוי שעה 1. תכנית ניתוח תמונה אוטומטית מאפשרת ניתוח שלאחר ניסוי יעיל של נתוני תמונה, המאפשר עיבוד להיות שלם בתוך כמה שעות. הגיאומטריה המכשיר שלנו היא ייחודית בכך שתאים חייבים לעוות באמצעות סדרה של התכווצויות מיקרון בקנה מידה, ובכך לאפשר את העיוות הראשונית והרפיה של תאים בודדים תלוי זמן להיות assayed. תחולתה של שיטה זו לוקמיה פרומיילוציטית (HL-60) התאים באה לידי ביטוי. נהיגה תאים לעוות דרך אילוצי מיקרון בקנה מידה באמצעות זרימה המונע על ידי לחץ, אנו צופים כי פרומיילוציטית האנושית (HL-60) תאים לרגע לחסום את ההתכווצות הראשונה לזמן החציוני של 9.3 אלפיות שניים לפני passaging במהירות רב יותר דרך להצר הבאיונים עם זמן מעבר החציוני של 4.0 אלפיות שניים להתכווצות. בניגוד לכך, (נויטרופילים סוג) שטופל בחומצה רטינואית כל טרנס HL-60 תאים לחסום את ההתכווצות הראשונה רק 4.3 אלפית שניים לפני passaging דרך האילוצים שלאחר מכן עם זמן מעבר החציוני של 3.3 אלפיות שניים. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי טבע viscoelastic של תאים, וסופו של דבר לחשוף את המקורות המולקולריים של התנהגות זו.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שינויים בצורת תא הם קריטיים בהקשרים ביולוגיים רבים. לדוגמא, אריתרוציטים ולויקוציטים לעוות דרך נימים שהם קטנים יותר מאשר הקוטר שלהם 1. בגרורות, תאים סרטניים חייבים לעוות דרך פערים צרים ביניים, כמו גם כלי דם מפותלים ורשתות הלימפה זרע באתרים משניים 2. כדי לחקור את ההתנהגות הפיסית של תאים בודדים, מכשירי microfluidic להציג פלטפורמה אידיאלית שיכול להיות מותאם אישית כדי ללמוד מגוון רחב של התנהגויות תאים הכוללים את היכולת שלהם להעביר דרך צרים פערים 3 ולעוות באופן פסיבי באמצעות אילוצי מיקרון בקנה מידה 3 9. Polydimethylsiloxane (PDMS) מכשירי microfluidic הם שקופים אופטי, המאפשרים לעיוותי תא להיות דמיינו באמצעות מיקרוסקופ אור ונותחו באמצעות כלים לעיבוד תמונה בסיסיים. יתר על כן, מערכים של אילוצים יכולים להיות מוגדרים במדויק, המאפשרים ניתוח של תאים מרובים בו זמנית עםתפוקה שעולה על טכניקות קיימות רבות 10,11.

כאן אנו מציגים פרוטוקול ניסוי מפורט לבדיקת deformability תא באמצעות מכשיר microfluidic PDMS 'תא deformer'. המכשיר תוכנן כך שמעבר תאים דרך אילוצים רציפים; גיאומטריה זו היא נפוצה בהקשרים פיסיולוגיים, כגון נימי ריאתי למיטה 12. כדי לאמוד את deformability תא, זמן מעבר מספק מטרי נוחה שנמדד בקלות את הזמן הנדרש לתא יחיד למעבר דרך 4,6 התכווצות אחת. כדי לשמור על ירידה בלחץ קבועה על פני הערוצים המכווצים בזמן מעבר תא, אנו משתמשים בזרימה מונע לחץ. הפרוטוקול שלנו כולל הוראות מפורטות על עיצוב מכשיר וייצור, תפעול מכשיר על ידי-לחץ מונע זרימה, הכנה והדמיה של תאים, כמו גם עיבוד תמונה כדי למדוד את הזמן לתאים כדי לעוות באמצעות סדרה של התכווצויות. אנו כולליםשני עיצובי מכשיר וקוד עיבוד נתונים חזון כקבצים משלימים. כמדגם מייצג של נתונים, אנו מראים את הזמן מעבר תא דרך סדרה של התכווצויות כפונקציה של מספר האילוצים passaged. ניתוח של לוח הזמנים לתאים למעבר למרות אילוצים צרים של מכשיר microfluidic יכול לחשוף הבדלים בdeformability של מגוון רחב של סוגי תאים 4,5,13. המכשיר הפגין כאן באופן ייחודי סוקר מעבר תא דרך סדרה של התכווצויות מיקרון בקנה מידה; עיצוב זה מחקה את הדרך המפותלת שתאים חווים במחזור וגם מאפשרים חיטוט מאפיינים פיזיים נוספים של התאים כגון זמן הרפיה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1 עיצוב מכשיר microfluidic

הערה: יש עיצוב המכשיר ארבעה אזורים בסיסיים פונקציונליים: נמל כניסה, מסנן תא, מערך התכווצות, ונמל יציאה (איור 1). העיצוב הכללי ניתן ליישם במגוון רחב של סוגי תאים, עם התאמות קלות לממדים. סיפקו הנה כמה המלצות עיצוב בסיסיות יחד עם פרמטרים נוספים במכשיר, כי הם יעילים לבחירה של שני תאים הראשוניים והנציחו.

  1. בחר את רוחב ערוצי מערך התכווצות (איור 1) להיות כ 30-50% מקוטר התא הממוצע; תוצאות זה התכווצות אל תא גודל יחס לעיוות תא משמעותית אבל סתימה מינימאלית. בהתחשב בסוג תא שעד עתה לא נבדק, זה נבון לעצב מגוון רחב של מידות רוחב התכווצות מ ~ 30-50% קוטר התא כדי למצוא את הרוחב האופטימלי. כמו בסוגים רבים של התקני microfluidic, ניתן בדוגמת מעל 120 תבניות הורים מכשיר על חטארקיק GLE 4 אינץ סיליקון, המאפשר מגוון רחב של עיצובי מכשיר שונים להיות מפוברק בתהליך ייצור אחד.
  2. בחר את גובה הערוץ להיות לפחות 50% מקוטר התא; זה מבטיח את התא מוגבל ב2 ממדים. כדי למנוע קריסת ערוץ במהלך מליטה, להבטיח כי יחס היבט הערוץ הוא לא פחות מ1:10 (גובה: רוחב) לאורך כל המכשיר. לערוצים שחייבים לעלות יחס היבט זה, להוסיף הודעות תמיכה למניעת קריסה. הודעות תמיכה בחלל במרחק שהוא לפחות פי שתיים מקוטר התא כדי לא לעכב תא זרימה.
  3. כולל מסנן בנמלי הכניסה כדי להסיר שאריות וdisaggregate צבירי תאים (איור 1). התאם את הגודל ומרווח של הודעות המסנן כך שהמרחק המפריד בין ההודעות הוא שווה בערך לקוטר תא אחד.
    הערה: הגבול התחתון של גודל תכונה נקבע על ידי הרזולוציה שבה המסכה ליתוגרפיה מודפסת. ודא שכל התכונות נמצאות במיל 'מגבלת olution שצוינה על ידי ספק המסכה.

.2 ציוד והכנה

הערה: לפני תחילת כל ניסוי, חייבים להיות מוכנים הפריטים הבאים. סכמטי של כל ההתקנה הוא נתון באיור 1.

  1. לפברק מאסטר המכשיר תוך שימוש בטכניקות סטנדרטיים לmicromachining יתוגרפי 14,15. ודא את הגובה של תכונות דוגמת באמצעות profilometer.
    הערה: בעוד שיכולים להיות מפוברקים מאסטרים בקלות במתקן חדר נקי, כמה מעבדות פיתחו שיטות ליתוגרפיה זולות לשימוש בסביבה למחצה נקייה 16,17.
  2. הכן את מקור האוויר לזרימת לחץ מונע, באמצעות טנק של אוויר ורצף של רגולטורי אוויר ואביזרים (איור 1 א) דחוסים.
    1. הגדר את טנק אספקת אוויר ורגולטור במדריך.
      הערה: הרכב של 5% CO 2 באוויר שומרת על סביבה דומה ככל incubato תרבית תאים טיפוסיr, אך יכולים לשמש גם תערובות גז אחרות.
    2. הגדר את וסת לחץ נשלטת אלקטרוני בקנה אחד עם הרגולטור במדריך. השתמש בממיר אלקטרו פנאומטי להסדיר ולשמור על ירידה בלחץ יציבה על פני הערוצים, עם תנודות לחץ של פחות מ -2 kPa. השתמש בקוד פשוט נכתב בLabVIEW (מידע נוסף) לקלט הלחץ הרצוי.
      הערה: ממיר אלקטרו פנאומטי משתמשת בלולאת משוב פנימית כדי להתאים את לחץ יציאת שסתום כדי להתאים את הלחץ שצוין על פני מכשיר microfluidic.
    3. הגדרת תא לחץ לנהוג זרימה של ההשעיה התא. להרכיב תא השעיה תא מתוך זרימה סטנדרטית cytometer צינור וכובע במכונה שיוצר חותם לחץ חזק על הצינור.
      הערה: כובע תא לחץ מכיל שני פתחים: כניסה המתחברת למכל האוויר הדחוס, ושקע שדרכו תאים לזרום מהחדר בלחץ לתוך המכשיר (figurדואר 2).
  3. הגדרת מיקרוסקופ הפוכה מצוידת במצלמה שיש שיעור לשנייה לפחות 100 מסגרות רכישה כדי ללכוד תמונות של התאים זורמים דרך מערך ההתכווצות. ממשק המצלמה עם כרטיס לכידה וידאו ומחשב.
  4. הכן פתרון פעילי שטח המניה של 10% w / w Pluronic F-127 בופר פוספט (PBS) כהוספת כמות קטנה של F127 לפתרון התקשורת הסלולרי יסייע למזער הידבקות תא לקירות PDMS. כדי להכין את פתרון F127, המערבולת וחום בעדינות על 37 מעלות צלזיוס לפרק את F127. לפני שימוש, להעביר את הפתרון דרך פילטר מזרק 0.2 מיקרומטר ולאחסן בטמפרטורת חדר. הכן את פתרון השטח מראש כvortexing וסינון יפיק בועות שנמשכות יותר מ 24 שעות.

.3 ייצור מכשיר microfluidic

  1. לפברק בלוק PDMS עם ערוצי microfluidic.
    1. המיקס PDMS ביסודיותיחס ta של 1:10 (w / w) סוכן ריפוי לבסיס.
    2. יוצקים את התערובת על פני אדון המכשיר (שלב 2.1). דגה בצנצנת פעמון עם ואקום שיושם עד לבועות וממולכד תיעלם, או כ 10-20 דקות.
      הערה: לאחר פרק זמן זה, יש עדיין עשויה להיות בועות בממשק האוויר PDMS, וזה נורמלי; אלה בדרך כלל יתפוגגו במהלך אפייה. זה קריטי ביותר כדי להבטיח כי אין בועות שנותרו בסמוך לערוצים.
    3. אופים את מכשיר degassed על 65 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות. כדי למנוע ערוצים מקריסה, לאפות את מכשיר לילה לcrosslink נוסף PDMS למכשיר עם מודול אלסטי גבוה שהוא עמיד יותר בפני קריסת ערוץ. עם זאת, הערה שהשתרעה אפייה גם embrittles PDMS ועלולה להוביל לפיצוח כאשר ניקוב חורים (שלב 3.3).
  2. הסר התקני microfluidic מעובש האב. חותך מכשירי microfluidic בודדים מתוך בלוק PDMS עם סכין גילוח ולהסיר את ההתקן מהתורןאה. התחל על ידי בעדינות מרים את פינה אחת של המכשיר; קילוף איטי ועדין, בניגוד להרמה ישר בלוק PDMS, מפחית את הלחץ בשני PDMS והאדון.
  3. חורי אגרוף במכשיר PDMS ליצור יציאות חיבור לגישה בין צינורות וmicrochannels. צור חורים באמצעות ביופסיה, ואגרוף מהצד הערוץ עד לצד החיצוני של המכשיר.
    הערה: ביופסיה עם גודל שעם 0.75 מ"מ יוצרת חורי ממשק שבצורה מושלמת עם polyetheretherketone צינורות (קוטר חיצוני = 1/32 (פיק) "או מ"מ 0.79) או צינורות פוליאתילן (PE-20, קוטר חיצוני = 0.043" מ"מ או 1.09 ). השתמש באור טבעת כדי לעזור לדמיין חורים במכשירים עם תעלות רדודות 18. הקפד הביופסיה היא חדה; לאחר חזר שימוש חוד החנית מקהה והביופסיה צריכה להיות מושלכת והוחלפה.
  4. יש לשטוף את מכשיר PDMS עם isopropanol (כיתה HPLC) כדי להסיר גושי אבק ונתקע של PDMS. הפוך בטוחנוקב ברורים של פסולת על ידי הפניית זרם יציב של isopropanol הטהורה מבקבוק לחיץ דרך החורים. מכה יבשה עם אוויר מסונן. לאחר ניקוי מקום בלוקים PDMS עם ערוצים, עם הפנים כלפי מעלה בצלחת פטרי נקייה כדי לשמור על ניקיון מכשיר. במידת צורך, מכשירי חנות בצורה זו עד שמליטה.
  5. נקה את מצע הזכוכית על ידי שטיפה עם מתנול (כיתה HPLC), מכה יבשה עם אוויר מסונן, והנח על פלטה חמה C ° 200 ל5-10 דקות כדי להבטיח את הזכוכית היא לגמרי נקייה ויבשה לפני טיפול פלזמה.
    הערה: מצע הזכוכית מהווה את החלק התחתון של כל אחד מערוצים. בדרך כלל שקופיות זכוכית די, שכן מטרת 10X או 20X היא אידיאלית להדמית מספר רב של ערוצים במקביל. להדמיה ברזולוציה גבוהה יותר, להתחבר למכשיר coverslip (# 1.5 עובי).
  6. בונד מכשיר PDMS למצע הזכוכית.
    1. פלזמה חמצן הטיפול בצד הערוץ של גוש PDMS וצד 1 של שקופית זכוכית.
      הערה: With יחידת פריקת כף יד, משתמש בזמן טיפול של 1 דקות, אבל לייעל את זמן טיפול בכל מכשירי פלזמה חמצן.
    2. הנח את צד הערוץ של PDMS על גבי צד המטופלים של הזכוכית מייד לאחר טיפול.
    3. להחזיק יחד עם לחץ קל ל~ 10 שניות כדי לקדם מליטה. אופים את המכשיר כולו בטמפרטורה גבוהה (60-80 ° C) לפחות 15 דקות כדי לשפר את חוזק קשר.

.4 עיוות תאים דרך ערוצים מכווצים

  1. בדוק את מכשיר microfluidic תחת מיקרוסקופ. ודא שהערוצים לא התמוטטו או שבורה וששני חורי הכניסה והיציאה להתחבר ישירות לערוצי המכשיר באמצעות מטרת צריכת חשמל נמוך (10X). לייעד מכשירים פגומים על ידי הבקיע פני השטח של PDMS בסכין גילוח ולא משתמש בם לניסויים.
  2. הכן את דגימות תרבית תאים להיות assayed. תרבות תאים באמצעות תנאים סטנדרטיים.
    1. Fאו דוגמא, תרבות HL-60 תאים בינוניים RPMI-1640 בתוספת 1% פתרון פניצילין, סטרפטומיצין ו10% בסרום שור עוברי ב5% CO 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס.
    2. לתאים חסיד, למסוק אותם על ידי trypsinization וגלול במדיום גידול טרי. השתמש בפרוטוקול trypsinization סטנדרטי; למשל, להוסיף ~ 0.5 מ"ל טריפסין לבקבוק עם 25 אזור תרבות 2 סנטימטר, וresuspend ב~ 30 מ"ל בינוניים טרי. להבדיל HL-60 תאים לתאי נויטרופילים מסוג על ידי כל טרנס רטינואית (אתרא) בריכוז סופי של 5 מיקרומטר לכל 1 x 10 5 תאים / מ"ל כפי שתואר קודם לכן 19,20.
    3. צנטריפוגה התאים XG 300 3 דקות, לשאוב בזהירות את תאי supernatant ו resuspend לצפיפות הסופית המתאימה במדיום תרבות הטרי עם 0.1% v / v F-127.
  3. ספירת התאים באמצעות דלפק קולטר, hemacytometer, או לזרום cytometer. התאם את ההשעיה התא לצפיפות של 1 x 06-5 אוקטובר x 10 6 תאים / מ"ל. ברגע שצפיפות ההשעיה מוגדרת, תוספת כ 0.1% v / v F-127.
    הערה: צפיפות התאים וריכוז חומרים פעילי שטח ייתכן שתהיה הצורך לשנות בהתאם את מערכות תא מסוימות; טבלת 1 מספקת תיעוד של ריכוזים ששימשו בעבר של תאים וF-127 לתאים מסוגים שונים.
  4. מניחים השעיה תא בcytometer זרימת צינור ולהתחבר לכובע הלחץ. לפני חיבור הצינור למכשיר microfluidic, להתאים את הלחץ לכ 14-21 kPa וסומק עד ההשעיה התא עולה מקצה הצינור. זה יעזור למזער בועות אוויר בצינור והמכשיר.
  5. הכנס את הקצה של הצינור המכיל את ההשעיה התא לתוך כניסת המכשיר. אם ההתקן הוא ערובה לcoverslip, להניח את המכשיר על משטח שטוח, מוצק כגון הבמה מיקרוסקופ לפני חיבור צינורות; coverslip הוא שביר ועשוי אחרת לשבור.
  6. הכנס חתיכת int צינורותo נמל היציאה והמסלול אותו לתוך צינור ריק לאיסוף פסולת כגון צינור פלקון ריק שהודבק לצד השני של הבמה מיקרוסקופ. לעקביות בהתנגדות fluidic הכוללת של המכשיר בין ניסויים, להבטיח שצינורות הכניסה ויציאה הוא מאותו קוטר ובערך באותו האורך לכל ניסוי.
  7. בעדינות כבש את הלחץ לכ 28 kPa או עד תאים לזרום בצינורות. מקם את המכשיר כך שמספר רב של ערוצים נמצאים בשדה הראייה והם ניצבים לחלק התחתון של המסך. אם המצלמה היא מוגבלת על ידי גודל נתונים, לרכוש קטעי וידאו מרובים כדי ליצור מספר מספיק של נקודות נתונים עצמאיות. התאם את מסגרת השיעור במידת הצורך לפלט נתונים הרצוי. כדי ללכוד את השינויים בצורת תא, להשתמש בהדמיה במהירות גבוהה ב 300 מסגרות לשנייה (fps); כדי למדוד זמני מעבר של תאים, להשתמש שיעורי מסגרת של כ 100 fps.

ניתוח .5 נתונים

  1. פתח את תורן הקובץer_script.m (קובץ נוסף להורדה) ולהפעיל את התכנית.
  2. בחר את הווידאו הראשון שנתח זאת מחלון Windows Explorer שמופיע. ציין את מסגרת הדולר לוידאו שנבחר ולחץ על Enter.
    הערה: דמות תופיע, המנחה את המשתמש לבחור חלון חיתוך מלבני לוידאו הראשון.
  3. בחר חלון שמקיף את כל ערוצים משמאל לימין וחוצה את הערוצים בדיוק מעל הנורה הראשונה של המערך של ערוצים בחלק העליון ותחתון (איור 3).
  4. בחר את אזורי כיווץ מהתמונה החתוכה. להקדיש תשומת לב מיוחדת לשמירה על מרחק פיקסל קבוע בין חלון הגבול העליון ותחתון לכל וידאו שנבחר.
    הערה: חלון הקצה העליון מציין את ההתכווצות העליונה וחלון קצה תחתון מציינת את ההתכווצות התחתונה (איור 4); אילוצי ביניים מקורבים מקלט משתמש זה. בשלב הבא, האלגוריתם מציג את יםegmentation של תאים ל50 המסגרות הראשונות של כל וידאו (איור 5).
  5. צג התמונה השמאלית העליונה (איור 5A) בשיתוף פעולה הדוק כדי לקבוע אם האלגוריתם מדויק איתור תאים; תמונת binarized היא על גבי מקור וידאו כדי להדגים את מיקומם של תאים מזוהים.
    הערה: החלונות השונים, (איורים 5 ב-5D) הם לאבחון קוד ולהפגין וידאו מסגרות לאחר פעולות עיבוד תמונה ספציפיות.
  6. בחר את הווידאו הבא להיות מעובד מחלון Windows Explorer.
    הערה: האלגוריתם יחזור על השלבים 5.2-5.5 עבור כל סרטון וידאו שנבחר.
  7. בחרו באפשרות ביטול פעם אחת את כל הסרטונים הרצויים נוספו דרך החלון של Windows Explorer להורות לפונקציה שרשימת וידאו מלאה.
    הערה: האלגוריתם יבצע את הפעולות שנותרו ללא התערבות משתמש. זה ייקח כ 1-2 שעות, תלוי במספר של קטעי וידאו מעובד וPE מחשבrformance. עם ההשלמה, האלגוריתם יהיה לייצר היסטוגרמה של נתוני זמן המעבר ולשמור את הנתונים בספרייה כקובץ .mat MATLAB וקובץ xls Microsoft Excel.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לחקור את deformability סוגי תאים שונים, תאים אנושיים מיאלואידית לוקמיה (HL-60), תאי נויטרופילים מובחנים, תאי הלימפוציטים עכבר, ושורות תאי סרטן השחלות אנושיות (OVCAR8, HEYA8) שלהם הוערכו באמצעות טכניקת microfluidic 'תא deformer'. תוצאות עבור נציג את זמן המעבר של HL-60 תאי HL-60 ונויטרופילים הסוג להראות הזמנים לתא בודד למעבר דרך סדרה של התכווצויות, כפי שמוצגים באיור 6. זמן מעבר נמדד לאוכלוסייה של תאים בודדים ב כל התכווצות 7 מיקרומטר בסדרה של 7 אילוצים בלחץ נהיגה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מספקים הליך ניסיוני מקיף לניתוח העיוות של תאים העוברים דרך ערוצי microfluidic מכווצים באמצעות זרימה המונע על ידי לחץ. תסריט MATLAB מאפשר עיבוד נתונים אוטומטי (משלימה חומר); גרסה מעודכנת של הקוד נשמר (www.ibp.ucla.edu/research/rowat). באופן רחב יותר, ניתן להתאים את הטכניקות שהוצגו כאן במבחני microfluidic מבוססי תאים רבים, כוללים השפעת cytoskeletal וסוכני התקשות גרעיני 24,23 כמו גם מנסה לאמוד defo...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אי לנו ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להודות לויד Ung עבור קלט קונסטרוקטיבי בגרסאות המוקדמות של טכניקה זו, ד"ר ג'רמי Agresti לטיפים לעיצוב כובע לחץ, וד"ר Dongping צ'י על עזרתו בבודת כובע הלחץ. אנו מודים למעבדות של מ 'Teitell ופ Gunaratne למתן מגוון רחב של דגימות תאים לבדיקה. אנו מודים לקרן הלאומית למדע (קריירת פרס DBI-1,254,185), המרכז לסרטן באוניברסיטת UCLA Jonsson, וUCLA הקליני וTranslational Science Institute לתמיכה בעבודה זו.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
פלורוניק F-127 בלוק קופולימר פעילי שטח פישר סיינטיפיק 8409400מיוצר על ידי BASF, זמין גם באמצעות בסיס Sigma
PDMS ו-crosslinkerEssex BrownellDC-184-1.1מוצר בשם נפוץ Sylgard 184 Elastomer
חמצן יחידת פריקת פלזמהEnerconDyne-A-Mite 3D Treater
Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0.75 מ"מ)TedPella, Inc.15072
Fingertight Ferrule, 1/32 אינץ'Upchurch ScientificUP-F-113
Fingertight III Fitting, 10-32Upchurch ScientificUP-F-300X
Polyetheretherketone (PEEK), קוטר חיצוני = 1/32 אינץ' או 0.79 מ"מValcoTPK.515-25M
צינורות פוליאתילן (PE-20), 0.043 אינץ' או 1.09 מ"מBecton Dickinson427406
ווסת לחץצינורות Airgas או Praxair
פוליאוריתן, 15/32 אינץ' ODMcMaster Carr5648K284
אביזרי דחיפה לחיבורMcMaster Carr5111K91
ממיר מתח ללחץ (E/P) ממיר אלקטרו-פנאומטיאומגהIP413-020
16 סיביות, 250 kS/S, 80 כניסות אנלוגיות רב תכליתי DAQNational InstrumentsNI PCI 6225-779295-01
מחבר אנלוגי מסוף בלוק-בורגNational InstrumentsSCB-68-776844-01
LabView תוכנת עיצוב מערכתמכשירים לאומיים תוכנת
MATLABThe MathWorks, Inc.MATLAB R2012aדורש את ארגז הכלים לעיבוד תמונה
כבל מוגןNational InstrumentsSHC68-68
קוד

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Doerschuk, C. M., Beyers, N., Coxson, H. O., Wiggs, B., Hogg, J. C. Comparison of neutrophil and capillary diameters and their relation to neutrophil sequestration in the lung. Journal of applied physiology. 74 (6), 3040-3045 (1993).
  2. Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the `seed and soil’ hypothesis revisited. Nature Reviews Cancer. 3, 453-458 (2003).
  3. Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis. Integrative biology: quantitative biosciences from nano to macro. 2 (11-12), 648-658 (2010).
  4. Hou, H. W., Li, Q. S., Lee, G. Y. H., Kumar, A. P., Ong, C. N., Lim, C. T. Deformability study of breast cancer cells using microfluidics. Biomedical microdevices. 11 (3), 557-564 (2009).
  5. Byun, S., et al. Characterizing deformability and surface friction of cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (19), 7580-7585 (2013).
  6. Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry. Lab on a chip. 8 (7), 1062-1070 (2008).
  7. Chen, J., et al. Classification of cell types using a microfluidic device for mechanical and electrical measurement on single cells. Lab on a Chip. 11 (18), 3174(2011).
  8. Zheng, Y., Shojaei-Baghini, E., Azad, A., Wang, C., Sun, Y. High-throughput biophysical measurement of human red blood cells. Lab on a Chip. 12 (14), 2560(2012).
  9. Zheng, Y., Nguyen, J., Wang, C., Sun, Y. Electrical measurement of red blood cell deformability on a microfluidic device. Lab on a Chip. 13 (16), 3275(2013).
  10. Hogg, J. C. Neutrophil kinetics and lung injury. Journal of applied physiology. 67 (4), 1249-1295 (1987).
  11. Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. Journal of biomechanics. 33 (1), 15-22 (2000).
  12. Yap, B., Kamm, R. D. Cytoskeletal remodeling and cellular activation during deformation of neutrophils into narrow channels. Journal of applied physiology. 99 (6), 2323-2330 (2005).
  13. Bow, H., et al. A microfabricated deformability-based flow cytometer with application to malaria. Lab on a Chip. 11 (6), 1065-1073 (2011).
  14. Qi, D., Hoelzle, D. J., Rowat, A. C. Probing single cells using flow in microfluidic devices. The European Physical Journal Special Topics. 204 (1), 85-101 (2012).
  15. Doll, J. C., et al. SU-8 force sensing pillar arrays for biological measurements. Lab on a Chip. 9, 1449-1454 (2009).
  16. Huntington, M. D., Odom, T. W. A Portable, Benchtop Photolithography System Based on a Solid-State Light Source. Small. 7 (22), 3144-3147 (2011).
  17. Grimes, A., Breslauer, D. N., Long, M., Pegan, J., Lee, L. P., Khine, M. Shrinky-Dink microfluidics: rapid generation of deep and rounded patterns. Lab on a chip. 8 (1), 170-172 (2008).
  18. Rowat, A. C., Weitz, D. A. Chips & Tips: see where to punch holes easily in a PDMS microfluidic device. Lab on a Chip. 8, 1888-1895 (2008).
  19. Meyer, P., Kleinschnitz, C. Retinoic Acid Induced Differentiation and Commitment in HL-60 cells. Environmental Health Perspectives. 88, 179-182 (1990).
  20. Olins, A., Herrmann, H., Lichter, P., Olins, D. E. Retinoic Acid Differentiation of HL-60 Cells Promotes Cytoskeletal Polarization. Experimental Cell Research. 254 (1), 130-142 (2000).
  21. Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Force Microscopy of Nonadherent Cells: A Comparison of Leukemia Cell Deformability . Biophysical Journal. 90 (8), 2994-3003 (2006).
  22. Tsai, M., Waugh, R., Keng, P. Changes in HL-60 cell deformability during differentiation induced by DMSO. Biorheology. 33 (1), 1-15 (1996).
  23. Rowat, A. C., et al. Nuclear Envelope Composition Determines the Ability of Neutrophil-type Cells to Passage through Micron-scale Constrictions. Journal of Biological Chemistry. 288 (12), 8610-8618 (2013).
  24. Lam, W. A., Rosenbluth, M. J., Fletcher, D. A. Chemotherapy exposure increases leukemia cell stiffness. Blood. 109 (8), 3505-3508 (2007).
  25. Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxgen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
  26. Wu, M. H. Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion. Surface and Interface Analysis. 41 (1), 11-16 (2009).
  27. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microfluidic DeviceCell DeformabilityPressure Driven FlowMicron Scale ConstrictionsAutomated Image AnalysisHL 60 CellsTransit Time MeasurementPDMS FabricationFlow Cytometry TubeInverted Microscope

Related Articles