היווצרות של microarrays Biomembrane עם שיטת הרכבה מבוססת מגב

Summary

bilayers שומנים נתמך וחלקיקי קרום טבעיים הם מערכות נוחים שיכול להתקרב למאפיינים של קרום תא ולהיות משולבות במגוון רחב של אסטרטגיות אנליטיות. כאן אנו מדגימים שיטה להכנת microarrays המורכב של SiO ₂ חרוזים נתמכים שומנים מצופים bilayer, שלפוחית ​​פוספוליפידים או חלקיקי קרום טבעיים.

Abstract

קרומי bilayer שומנים מהווים את קרום הפלזמה של תאים ולהגדיר את הגבולות של אברונים subcellular. בטבע, קרומים אלה תערובות הטרוגנית של סוגים רבים של שומנים, מכילים חלבוני קרום הנכנס ומעוצבים עם פחמימות. בניסויים מסוימים, רצוי לנתק את מאפייני biophysical או ביוכימי של bilayer שומנים מאלה של הקרום הטבעי. מקרים כאלה קוראים לשימוש במערכות מודל כגון שלפוחית ​​ענקית, ליפוזומים או bilayers נתמכת שומנים (SLBs). מערכים של SLBs הם אטרקטיביים במיוחד ליישומי חישה ומחק תאי תאי אינטראקציות. כאן אנו מתארים שיטה חדשה ליצירת מערכי SLB. ₂ חרוזים SiO submicron בקוטר הם מצופים ראשון עם bilayers שומנים ליצירת SLBs הכדורי (SSLBs). אז חרוזים מופקדים לתוך מערך של microwells submicron בקוטר מפוברק מיקרו. טכניקת ההכנה משתמשת "מגב" כדי לנקות את שטח המצע, בעוד leavinגרם מאחורי SSLBs שהתמקם microwells. שיטה זו לא דורשת שינוי כימי של מצע microwell, ולא כל ligands מיקוד מיוחד על SSLB. Microwells תפוס על ידי חרוזים בודדים בגלל הקוטר גם הוא מכוון להיות גדול יותר מקוטר חרוז. בדרך כלל, יותר 75% מהבארות שנכבשו, ואילו השאר יישאר ריק. במאגר מערכי SSLB להציג יציבות לטווח הארוך של יותר משבוע אחד. סוגים שונים של SSLBs יכולים להיות ממוקמים במערך יחיד בתצהיר סדרתי, והמערכים יכולים לשמש לחישה, שאנחנו מדגימים על ידי המאפיינים את האינטראקציה של רעלן הכולרה עם ganglioside GM1. כמו כן, אנו מראים כי שלפוחית ​​פוספוליפידים ללא תומך חרוז וbiomembranes ממקורות סלולריים יכולה להיות מסודרת עם באותה השיטה וניתן לזהות שומני קרום תא ספציפי.

Introduction

קרומי bilayer שומנים הם מבנים חיוניים בטבע. ממברנות פלזמה נייד וקרומים אברון מורכבים מbilayers שומנים המשלבים מספר המולקולות שאינן הכרחיים לחיים. תהליכי חיים מקיימים רבים מתרחשים על פני השטח של תאים או מתווכים על ידי מולקולות הקשורות לממברנות שומנים בדם bilayer. למעשה, תהליכים רבים תרופות יעד או מולקולות נמצאים על או בקרומי ^1,2. לכן, יש לחקור בצורה אנליטית תהליכים, כגון תגובות כימיות או אירועים המחייבים noncovalent המתרחשים על פני שטח של קרום. מכיוון שקרומים טבעיים יכולים להיות קשים לבודד ו / או ממשק עם חיישנים, חוקרים רבים להעסיק ממברנות מודל פשוטות לבצע מחקרים אנליטיים. מספר מערכות קרום מודל מתוארים בספרות, החל משלפוחית ​​ענקית שיכולים להיות עשרות עד מאות מיקרונים בקוטר ליפוזומים עם ממדים ננומטריים ^3,4. Alternatively, bilayers שומנים מישוריים שהופקד על תמיכה מוצקה, כלומר, נתמך bilayers שומנים (SLBs), יכול להיווצר במספר המשטחים השונים והיה בשימוש נרחב ביישומי biophysical, ביוכימיות, ואנליטיות ^5. צימוד SLBs עם חומרים חשמליים או אופטיים מאפשר חקירה לביוכימיה וביופיסיקה קרום באמצעות השימוש בטכניקות אנליטיות שונות. מיקרוסקופ פלואורסצנטי ^6, אלקטרוכימיה ^7, ספקטרוסקופיה אופטית ^8, בדיקה סריקה מיקרוסקופית ^9, plasmon משטח התהודה ^10, וספקטרומטריית מסת ¹¹ כולם הועסקו כדי לחקור את המבנה והמאפיינים של SLBs.

מערכי SLB להציע צדדיות נוספת בעיצוב של חיישנים עבור מבחני זמנית ^12,13. יישומים אחרים להשתמש במערכי SLB לחקות את הצומת שיוצרת בין תאים חיסוניים ^14. שיטות הכנה למערכי SLB השתנו מmicrofluidic גישות ¹⁵ לאלה שמעסיקים מחסומים פיזיים בין טלאי SLB הסמוכים. ¹⁶ קבוצות אחרות השתמשו בשיטות הדפסה ^17, דפוסים פוטו ¹⁸ וnanoengineering השונות גישות ¹⁹ ליצור מערכי SLB.

במאמר זה ובוידאו המצורף אנו מדגימים שיטה ליצירת מערכי SLB ידי הפקדת SiO ₂ חרוזים מצופים SLB למערכים מסודרים של microwells ^20. אנו מתייחסים לSiO ₂ חרוזים מצופים SLB כbilayers הכדורית נתמכת שומנים (SSLBs). טכניקה זו היא הרחבה של עבודה קודמת שיצרו מערכים של שלפוחית ​​פוספוליפידים וbiomembranes נגזר ממקורות טבעיים ^21, שממנו אנחנו גם להראות תוצאות ירושלים. שיטות אחרות לעריכת חלקיקי biomembrane או שלפוחית ​​יש לסמוך על דפוסים של ligands מיקוד הספציפי על משטחים שמקשרים עם ligands המשלים הכיל על פני השטח של השלפוחית. דוגמאות כוללות יוטיןעמותת avidin ^22,23 וערכות הכלאת DNA ^24. הגישה שלנו דורשת רק מערך microwell ללא moieties מיקוד או הכרה הכרחי. הגודל של SSLBs מוגדר על ידי הקוטר של תומך חרוז SiO _2, שיש לי poly-dispersity נמוך. על ידי כוונון קוטר microwell רק גדול יותר מאשר קוטר SSLB, רק SSLB אחת ישקע לתוך כל microwell. מגב פולי (dimethylsiloxane) (PDMS) ואז מסיר מעל פני השטח כל SSLBs שאינם משותקים בmicrowells. יש לי microwells ומערכי SSLB תוצאת צפיפות גבוהה (~ 10 ⁵ SSLBs / ² מ"מ) עם 3 מיקרומטר מרווח ומחזוריות משושה מרכז למרכז. באופן סדרתי הפקדת SSLBs עם קומפוזיציות שומנים שונות, אפשר ליצור מערכי multicomponent עם SSLBs ממוקם באופן אקראי. כדי להדגים את יכולת החישה של מערכי SSLB, השתמשנו באינטראקציה של רעלן הכולרה (CTX) עם ganglioside (GM1) שולב SSLBs. עםחלקיקי קרום טבעיים, שהיינו מסוגלים לזהות שומני תא ספציפי במערכי multicomponent מכילים חומר קרום משני סוגי תאים שונים.

Protocol

1. Microfabrication של תשתית מערך microwell

1. התחל עם פרוסות סיליקון 4 אינץ' עם של תחמוצת מבוגרת תרמית 100 ננומטר.
2. ספין SPR-955 0.7 photoresist על פרוסות סיליקון ב4,000 סל"ד במשך 30 שניות.
3. אופים על פלטה חמה ב115 מעלות צלזיוס במשך 90 שניות.
4. לחשוף photoresist.
   1. השתמש במסיכה שתיצור 1 מיקרומטר חורים מסודרים במערך משושה עם 3 מיקרומטר תקופה שבה המערך משתרע על שטח מ"מ x 2 2 מ"מ.
   2. לחשוף רקיק בצעד i-קו באמצעות גודל צעד של 6 מ"מ וחשיפה של 200 mJ / ² סנטימטר.
5. אופים על פלטה חמה ב115 מעלות צלזיוס במשך 90 שניות.
6. לפתח באמצעות מפתח ספין להפקיד 2 שלוליות של CD-26 על פרוסות סיליקון לזמן פיתוח כולל של 90 שניות.
7. לשטוף ביסודיות עם מים ultrapure DI ויבשים עם N _2.
8. לחרוט תחמוצת בחרט תגובתי יון ל6 דקות עם 50 SCCM של Ar, 25 SCCM של ₄ CF, ו50 SCCM של ₃ CHF פלואגף בלחץ של 75 mTorr.
9. לחרוט סיליקון בחרט תגובתי יון עמוק תעלת ICP עבור 2 דקות עם 63 SCCM של ₄ C F _8, 27 SCCM של SF _6, 40 SCCM של Ar, ו10 SCCM של O ₂ זורם בלחץ של 14 mTorr.
10. יש לשטוף באצטון, מתנול, וisopropanol להסיר להתנגד.
11. מקום באמבטיה של H ₂ SO _4: H ₂ O ₂ 01:01 ל10 דקות כדי לנקות את השטח.
12. לשטוף ביסודיות עם מים ultrapure DI ויבשים עם N _2.
13. להפקיד 1,080 Å של Al ₂ O ₃ על ידי בתצהיר שכבה אטומי ב250 ° C.

2. הכנה של פולי (dimethylsiloxane) מגב

1. במידת האפשר, לעבוד בחדר נקי. אחרת לעבוד בסביבה הנקיה ביותר האפשרית.
2. השג צלחת פטרי מפלסטיק (או מיכל חד פעמי נקי אחר) עם ≥ צדדים 13 מ"מ.
3. , במנה שישפוך את 5 סוכן ריפוי PDMS גרם, ואחריו 50 bas PDMS גרםסוכן דואר (או כל דבר עם יחס 1:10 שבעיקר ימלא את צלחת פטרי). מערבבים היטב עם טפטפת פלסטיק חד פעמי או מוט.
4. הסר בועות על ידי הצבת PDMS המעורבת בתא עם קו ריק, החלת ואקום עד בועות יצאו מהתערובת (כ 30 דקות).
5. אם לא כבר בצלחת פטרי, לשפוך PDMS בצלחת פטרי, הימנעות יצירה של בועות אוויר.
6. לרפא לילה על פלטה חמה ב> 50 מעלות צלזיוס (חום גבוה יותר עבור פחות זמן גם עובד).
7. עם סכין גילוח חדש / נקי, לחתוך בזהירות חתיכה כ 2.5 x 2.5 סנטימטר מלבני, שמירה על משטח עליון נקיים ככל האפשר. לקלף עם מלקחיים נקיים. לקצץ את קצה אחד (עד 1.5 סנטימטר) על ידי לחיצה על סכין גילוח בתנועה אחת, כדי להפוך את הקצה עליון חד ככל האפשר (זה יהיה בקצה המשמש בתהליך המגב).
8. נקי עם אצטון, מתנול, אלכוהול איזופרופיל, ומים די ultrapure, ולאחר מכן מכה יבשה בגז חנקן נקי. אחסן בצלחת פטרי נקייה.

3. הכנת שלפוחית

1. לאסוף פתרונות שומנים המניה של phosphatidylcholine ביצת 25 מ"ג / מיליליטר (PC) ו1 מ"ג / מיליליטר 1,2-dipalmitoyl-SN-glycero-3-phosphoethanolamine-N - (rhodamine lissamine B sulfonyl) מלח אמוניום (Rho-DPPE) בכלורופורם ו0.5 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות של monosialoganglioside GM1 בכלורופורם / מתנול (2:1 V / V).
2. בבקבוקון זכוכית קטנה לעשות תערובת כי התוצאות במחשב 97% mol, 2% mol% mol Rho-DPPE GM1 ו1 על ידי הוספת 18.9 μl של 25 מחשב מ"ג / מיליליטר, 39.6 μl של 0.5 מ"ג / מיליליטר GM1 ו7.9 μl של 1 מ"ג / מיליליטר Rho-DPPE באמצעות מזרקים זכוכית.
3. הערה:. החומר המשלים עבור Nair et al ²⁵ מכיל גיליון אלקטרוני של Excel להתאמה אישית מצוין לחישוב הסכומים של שומנים הנדרשים כדי ליצור שלפוחית ​​של כל הרכב רצוי.
4. הנח בקבוקון בייבוש ואקום ולהסיר הממס על ידי השארת הבקבוקון תחת ואקום במשך 6 שעות.
5. הפוך תמיסה מימית של 0.1M NaCl. הוסף 0.5 מיליליטר של פתרון M NaCl 0.1 לבקבוקון המכיל את סרט שומנים בדם היבש.
6. אפשר תערובת השומנים המימית לנוח למשך הלילה.
7. תמהיל בקצרה מערבולת כדי ליצור השעיה שלפוחית, אז sonicate עבור 20 דקות בsonicator אמבטיה בטמפרטורת חדר.
8. Extrude ההשעיה השלפוחית ​​דרך קרום פוליקרבונט עם 100 גודל נקבובית ננומטר. לעבור את ההשעיה השלפוחית ​​דרך 17x המסנן.
9. אחסן את שלפוחית ​​extruded בבקבוקון זכוכית ב 4 ° C.

4. כינונה של bilayers שומנים נתמכים כדורי

1. לאסוף 700 ₂ חרוזים SiO קוטר ננומטר. חרוזים מסופקים במים מזוקקים עם ריכוז מניות של 1.4 x 10 ¹¹ מיליליטר / חרוזים.
2. בצינור 1.5 מיליליטר Eppendorf להכין השעיה חרוז 1 מיליליטר עם ריכוז של 1.5 x 10 ¹⁰ מיליליטר / חרוזים ידי הוספת 107 μl של פתרון מניות חרוז ל893 μl של 0.1 M NaCl.
3. מערבולת ההשעיה כדי להבטיח שהוא גם מיילXED.
4. צנטריפוגה ההשעיה ב1,700 XG עבור 20 דקות לאחר מכן לבטל את supernatant. Resuspend את החרוזים 1 מיליליטר של 0.1 M NaCl. חזור על פעולה זו עוד פעמיים כדי לשטוף ביסודיות את החרוזים.
5. כדי ליצור את SSLBs, בצינור 1.5 מיליליטר Eppendorf להוסיף 25 μl של ההשעיה חרוז SiO ₂ 200 μl של 1 מ"ג / מיליליטר השעיה שלפוחית. מערבולת את התערובת ולתת לעמוד במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. בשלב זה ריכוז SSLB צריך להיות 1.7 x 10 ⁹ מיליליטר / SSLBs.
6. צנטריפוגה ב 1,700 XG עבור 20 דקות עד גלולה SSLBs. גלולה אמורה להופיע ורוד בשל הקרע של שלפוחית ​​עם Rho-DPPE בחרוזים.
7. בטל supernatant ו resuspend ב 225 פוספט μl סליין (PBS), pH = 7.4. חזור על שלבי 4.6-4.7 עוד פעמיים כדי להסיר את כל שלפוחית ​​unruptured מהשעית SSLB.

5. עצרת של מערך SSLB

1. רקיק קליב של מערכי microwell וכתוצאה מחתיכות מלבניות עם 4-6 מיקרופוןמערכי Rowell ליחידה.
2. מערבולת לערבב את ההשעיה SSLB, ואז למקם 10 μl של ההשעיה SSLB על כל מערך microwell. שמא מנוחה לשעה 1 כדי לאפשר SSLBs להתיישב על פני השטח.
3. לשטוף בעדינות את שבב מערך microwell עם PBS מבקבוק לשטוף, ואז להשקיע באמבטית PBS שהוכנה בצלחת רדודה.
4. אמנם מתחת למים, מניח בעדינות את סומק PDMS מגב על שבב מערך microwell ועדינות חלק אותו על פני השטח 5x כדי להסיר SSLBs שאינם משותקים בmicrowells.
5. גריפ שבב מערך microwell עם פינצטה ובעדינות לנער באמבטיה PBS להסיר כל SSLBs עודף.
6. להסיר במהירות את השבב מאמבטית המגב ומניח באמבט PBS טרי עד לשימוש נוסף. ודא שהמשטח העליון של השבב נותר לח כדי לשמר את SSLBs.

הערה: שיטת ההרכבה שתוארה לעיל יכולה לשמש ליצירת מערכים של חלקיקי קרום טבעיים, כמו חלקיקי מיאלין מבודדים ממוח עכבר, או פושלפוחית ​​spholipid ללא תומך חרוז SiO _2. עבודה זו מתוארת בפירוט וביטנברג ואח'. ²¹ ותוצאות נציג מוצגות להלן.

6. Assay עקידת רעלן כולרה

1. הכן פתרון 2 מ"ג / מיליליטר של אלבומין בסרום השור (BSA) ב-PBS.
2. הכן פתרון עם ריכוז רצוי של אלקסה 488 מצומדות רעלן הכולרה B-למקטע ב-PBS עם 2 מ"ג / מיליליטר BSA.
3. הסר את שבב מערך SSLB מאמבטית PBS ופתיל משם את רוב פתרון PBS באמצעות מעבדה לנגב. השאר מספיק PBS על השבב כדי לשמור על מערך SSLB התייבשות.
4. כדי למנוע ספציפי מחייב, להוסיף 200 μl של 2 מ"ג / מיליליטר פתרון BSA לשבב מערך SSLB. תן מנוחה לשעה 1 בתיבת humidified.
5. עם micropipette, להסיר 200 μl של פתרון מהחלק העליון של שבב מערך SSLB.
6. הוסף 200 μl של פתרון רעלן הכולרה לשבב מערך SSLB ולתת מנוחה לשעה 1 בתיבת humidified.
7. לשטוף בעדינות את שבב מערך SSLB עם PBS מבקבוק לשטוף כדי להסיר כל רעלן הכולרה מאוגד.
8. PBS משם העודף וויק באמצעות מעבדה לנגב. לפני ההדמיה כיסוי שבב עם תלוש לכסות x 40 מ"מ 24 מ"מ.
9. מערכי תמונה עם מיקרוסקופ זקוף באמצעות מסנן קובע מתאימים לfluorophores של עניין.
10. נתח את עוצמת הקרינה של SSLBs הבודד במערך באמצעות פונקצית ניתוח חלקיקים האוטומטית של תוכנת ImageJ.
11. לקמפל עוצמות הקרינה ממוצעת מSSLBs הבודד לתוך היסטוגרמות המסכמות את העוצמות של SSLBs לציין במערך נתון.

Results

כאשר ₂ חרוזים SiO מעורבבים עם תמיסה של שלפוחית ​​המורכבת מפוספוליפידים, שומני ניאון ושומנים אחרים כגון gangliosides, שלפוחית ​​הקרע במשטחי חרוז SiO ₂ כדי ליצור SSLBs, כפי שמוצגת באופן סכמטי באיור 1 א. לאחר שטיפת SSLBs, ירידה של פתרון SSLB מושם על מערך microwell, והחרוזים מותר להתיישב על פני השטח. (איור 1B1) זה יכול להיעשות גם עם השעיה של שלפוחית ​​פוספוליפידים או חלקיקי קרום טבעיים, המוצגים באיור 1B2. תמונת ה...

Discussion

בעבודה זו אנו מראים כי SiO ₂ חרוזים monodisperse מצופים bilayers שומנים נתמכים ניתן ערוכים למערכי microwell ללא צורך במיקוד ligands על bilayers השומנים או פני המצע, והמערכים יכולים לשמש לאפיון אינטראקציות רעלן שומנים בדם. אנו קבועים דיסוציאציה שמחושבים לCTx/GM1 מחייב משווה לטובה, בהתחשב בפער הרחב של ערכים בספרות, בדו"ח קודם של חורף et al., שם הרכבה colloidal של חרוזים מצופים שומנים בדם שימשה לחישוב קבוע דיסוציאציה של כ 30 ננומטר. על ידי התאמת הנתונים למודל...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
פרוסות סיליקון 4 אינץ	פרוסות אוניברסיטה	425
שיפלי MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 פוטו-רזיסט	MicroChem	SPR955-CM
שיפלי MICROPOSIT CD-26 מפתח	MicroChem	CD-26
i-line stepper	Canon	2500 i3 stepper
Vision 320 תחריט יונים תגובתי	מתקדם ואקום	Vision 320 RIE
תחריט יונים תגובתי עמוק	Plasma Therm	SLR-770
מערכת פירוק שכבה אטומית	קיימברידג' NanoTech	Savannah
Dow Corning Sylgard 184 poly (dimethylsiloxane) ערכת	דבקים אלסוורת'	184 SIL ELAST KIT 0.5 ק"ג
ביצה פוספטידילכולין	Avanti Polar Lipids	840051C
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) מלח אמוניום	Avanti Polar Lipids	810158C
Monosialoganglioside GM1	Avanti Polar Lipids	860065P
חרוזי סיליקה	Bangs Laboratories	SS03N/4666	האריזה על מיכל החרוזים מציינת שהחרוזים בקוטר 900 ננומטר. עם זאת, לאחר פיזור אור ומיקרוסקופ אלקטרונים קבענו שהחרוזים הם בקוטר של כ-700 ננומטר.
תת-יחידה B של רעלן כולרה, Alexa 488-conjugate	בדיקות מולקולריות	C-34775
נוגדן אנטי-אוליגודנטרוציט IgM O4, NorthernLights 557 מצומד	R& D Systems	NL1326R
בדיקות מולקולריות	FM1-43	T-3136
צנטריפוגה Eppendorf MiniSpin	פישר סיינטיפיק	05-401-09