מאמר שיטה

הדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה

DOI:

10.3791/51533

⸱

17 במאי 2014

 , 
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Alabama at Birmingham

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שתואר כאן הוא פרוטוקול להדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עוברי דג הזברה הם כלי רב עוצמה להקרנה בקנה מידה גדולה של מולקולות קטנות. דג הזברה מהונדס המבטאים את חלבוני כתב ניאון משמש לעתים קרובות כדי לזהות כימיקלים המווסתים את ביטוי הגנים. מסכי כימיים שassay הקרינה בדג הזברה לחיות לעתים קרובות מסתמכים על ציוד יקר, מיוחד להקרנת תוכן גבוה. אנו מתארים הליך באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence רגיל עם במה ממונעת באופן אוטומטי לעוברי דג הזברה תמונה ולזהות הקרינה רקמות ספציפיות. שימוש בדג זברה מהונדס שלדווח על פעילות קולטן אסטרוגן דרך ביטוי של ה-GFP, פיתחנו הליך חצי אוטומטי למסך לligands קולטן אסטרוגן המפעיל את הכתב באופן רקמות ספציפיות. בסרטון זה אנו מתארים נהלים לעריכת עוברי דג הזברה ב24-48 שעות שלאחר הפריה (hpf) בצלחת 96 היטב והוספת מולקולות קטנות אשר נקלטות קולטני אסטרוגן. ב72-96 hpf, תמונות של כל אחד גם מכל הצלחת באופן אוטומטי שנאספו ונבדקה באופן ידני לקרינת רקמות ספציפיות. פרוטוקול זה מדגים את היכולת לזהות אסטרוגנים המפעילים קולטנים במסתמי לב, אך לא בכבד.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דג הזברה מהונדס פותחו המאפשרת הדמיה הישירה של פעילות במסלולי איתות, כגון צמיחת פיברובלסטים גורמי 1, חומצה רטינואית 2 ואסטרוגנים 3, בעוברים בשידור חי. כלים אלה מאפשרים הקרנה של כימיקלים שיוצרים הפרעת מסלולי איתות (assayed כשינוי בעוצמת הקרינה) או לכימיקלים המווסתים איתות באופן רקמות ספציפיות (שינוי בלוקליזציה הקרינה) 4. לכידת תמונה אוטומטית מגדילה את התפוקה של מסכי כימיים באופן דרמטי 5,6. מסכים שהקרינה באופן אוטומטי assay בדג הזברה לחיות לעתים קרובות מסתמכת על ציוד יקר, מיוחד. מה שנקרא גבוה הקרנת תוכן מספקת את היתרון של רזולוציה גבוהה, הדמיה כמותית אך במחיר של שימוש בקוראי צלחת מיוחדים מצוידים למיקרוסקופיה confocal 7,8. מטרתה של שיטה זו היא באופן אוטומטי הקרינה רקמות ספציפיות assay בעוברי דג הזברהבצלחת 96 היטב באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence סטנדרטי. הקרינה רקמות ספציפיות ניתן להבחין באמצעות טכניקה זו ועלולה להיות גישה סבירה למעבדות שאין גישה לקוראי צלחת מיוחדות או ציוד גבוה הקרנת תוכן.

בפרוטוקול זה, אנו משתמשים בהדמיה אוטומטית כדי לזהות קולט רקמות ספציפיות אסטרוגן (ER) אגוניסטים בדג הזברה לחיות ב3 ימים לאחר הפריה (DPF). הקו המהונדס Tg (5xERE: GFP) c262/c262 מכיל 5 רצפי טנדם תגובת אסטרוגן אלמנט ה-DNA (ERE) במעלה הזרם של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) 3. בהעדר ליגנד, מיונים הם בדרך כלל לא פעילים. ליגנד מחייב מעורר שינוי קונפורמציה, המאפשר הקולטנים להיקשר ERE-DNA ולווסת את השעתוק 9. 5xERE: ניתן להשתמש בדגים GFP למסך ספריות כימיות למאפנני ER ויכולים לשמש מסך דגימות מים סביבתיים למזהמים אסטרוגניים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: פרוטוקול זה אושר על ידי אוניברסיטת אלבמה בועדת טיפול בבעלי חיים ושימוש המוסדית ברמינגהאם.

1. רבייה דג הזברה ואוספי ביצה

  1. שלושה ימים לפני תחילת חשיפה לחומרים כימיים, להרכיב טנקי רבייה עם חוצצים לזכרים ונקבות נפרדים. ממלא כל מחצית הדרך מיכל עם מים מערכת חקלאות ימית. שימוש ברשת, להעביר Tg (5xERE: GFP) דגי c262/c262 לטנקים רבייה, הצבת 2 זכרים ונקבות 3 בכל אחד טנק מופרד על ידי מחיצה. מניחים את המכסה על כל טנק ותווית עם תאריך וזנים שחצו.
  2. למחרת בבוקר, להסיר את כל המחסומים והטיה מתסכלת ליצור אזור רדוד בקצה אחד של מיכל הרבייה. לאפשר דג הזברה להזדווג, איסוף עוברים ב10 מרווחי דקות כדי להבטיח היערכות התפתחותית מדויקת. ביצים נקיות על ידי שטיפה דרך מסננת תה באמצעות מדיום E3B ועוברים בעדינות סומק לצלחות פטרי. חזור דגים בוגרים לקבועיםטנקים.
  3. באמצעות מיקרוסקופ לנתח, למיין, לספור, והסר את כל עוברים מופרים, נורמליים או פגומים. עוברי מקום בצלחות פטרי במדיום E3B ובית ב28.5 ° C עם אור 14:10: מחזור כהה. צפיפות עובר יכולה להשפיע על התפתחות. מניחים לא יותר מ 100 עוברים בצלחת מ"מ 100 x 35 ולא יותר מ 50 עוברים בצלחת מ"מ 60 x 15.
  4. על ידי 24 hpf, להחליף מדיה עם E3B מכיל 200 1 מיקרומטר-פניל 2-thiourea (PTU). PTU מונע היווצרות פיגמנט ושומר על עוברי דג הזברה וזחלים שקופים לבהירות תמונה משופרת. זהירות: מניית PTU מרוכזת היא מסוכנת; ללבוש כפפות בעת ביצוע פתרון E3B + PTU.
  5. ביום 1 לאחר ההפריה (DPF), להסיר באופן ידני את סיסי מכל עובר באמצעות מלקחיים בסדר. סיסי אינו מופיע כדי להשפיע על חדירה של אסטרוגנים, עם זאת ההסרה משפרת את בהירות תמונה. אין צורך להסיר את chorions מהתקשורת. הערה: כחלופה לdechorionation הידני, ניתן צ'ה קבוצות של עובריםmically dechorionated באמצעות 1 מ"ג / מיליליטר pronase טיפול, כפי שתואר 11 בעבר.

2. טיפול הכימי של עוברים

  1. היום לפני הטיפול, להכין פתרונות מניות של כל כימי בריכוז של פי 1,000 בDMSO (או ממס מתאים). לדוגמה, כדי לחשוף את העוברים ל10 יספנול מיקרומטר (BPA), להכין פתרון מניות 10 מ"מ BPA ב100% DMSO. זה מבטיח ריכוז DMSO אחיד בכל טיפול ומאפשר 1:1,000 דילול רעיל של DMSO לשמש כשליטה ברכב. פתרונות מניות חנות ב -20 ° C. עבור פרוטוקול זה, עוברים יהיו חשופים ל1 מיקרומטר ומיקרומטר 10 BPA, 18.5 ננומטר ו1.85 מיקרומטר גניסטאין, 367 אסטרדיול ננומטר (בקרה חיובית) ורכב (DMSO 0.1%, בקרה שלילית).
    זהירות: כימיקלים כגון BPA ואסטרדיול הם מסוכנים ויכולים להיות השפעה מזיקה על העובר האנושי. ידית משבשים האנדוקרינית בזהירות ותמיד להשתמש בציוד מגן אישי מתאים.
  2. ביום של טיפול, הפשרה הכינה פתרונות כימיים מניות. לדלל 1:1,000 ידי pipetting 1 מיליליטר E3B + PTU לתוך צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge והוספת 1 μl של תמיסה כימית מניות. וורטקס במרץ. לדלל DMSO 1:1,000 לE3B + PTU כמו שליטה ברכב. השתמש 1 מ"ל E3B + PTU בצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר כביקורת שלא טופלה.
  3. בעזרת פיפטה העברה פלסטיק גדולה נשא, עוברי העברה מצלחות פטרי לבאר כל צלחת 96 היטב, 3 עוברים לכל טוב, 3 בארות לכל מצב. על מנת למנוע אידוי במהלך טיפול ממושך, להשמיט עוברים משורות ועמודות חיצוניות של הצלחת (שורות ו-E, עמודות 1 ו 12). יכולות להיות מלאות בארות חיצוניות עם 300 μl של E3B + PTU. לתייג את המכסה הצלחת כראוי.
  4. הסר את המדיה מכל טוב עם פיפטה העברה פלסטיק קנס הטתה. לעבוד במהירות כדי למנוע התייבשות העוברים.
  5. הוסף 200 μl של פתרון טיפול למתאים היטב. מניחים את המכסה underneath הצלחת כמדריך כדי להבטיח תוספת של טיפולים לתוך הבארות המתאימות. מערבולת צינור אחד לפני pipetting להפיץ הכימי בתמיסה. חזותי לאשר כל עובר הוא בפתרון הטיפול. אם הם עוברים בצד של הבאר, השתמש pipet העברה נקי כדי לשטוף אותם לתוך הבאר עם פתרון הטיפול.
  6. מניחים את הצלחת באינקובטור ב 28.5 ° C. עוברים ינותחו לקרינה ב72 hpf.

3. אוטומטית הדמיה של עוברים בצלחות 96 היטב

  1. הרדימי עוברים על ידי הוספת 10 μl של 4 מ"ג / מיליליטר tricaine היטב כל אחד.
    הערה: הרדימי עוברים לפני ההדמיה. ב24-96 hpf, דג הזברה תערוכת תנועה ספונטנית ותגובה בהלה למקור האור משתנה במהלך לכידת תמונה. הרדמה עובר מפחיתה את התנועה במהלך הדמיה.
  2. מניחים את צלחת 96, גם בשלב הממונע ולכייל את הבמה. באמצעות Zeiss זן הכחול 2011 תוכנה לאוטומצית מיקרוסקופיהובבקרה, בחר באפשרות ספק מדגם ובחר 96 multiwell. בחר לכייל. בצע את ההוראות בשלבים לכייל את הבמה.
    הערה: אל תסיר את סימון כפתור האריחים לאחר שלב זה. אם לחצן האריחים אינו מסומן, הגדרות כיול עלולות ללכת לאיבוד וצלחת 96 היטב תהיה צורך recalibrated.
  3. באמצעות 10x אובייקטיבי וbrightfield (BF) הגדרה, לזהות עובר בקרה חיובי ולהגדיר הגדרות חשיפה הולמת לBF וערוצי ה-GFP, ולוודא כי אות הקרינה לא להרוות את המצלמה. התמקד בעובר יחיד ולתכנת את מיקרוסקופ כדי לרכוש 3 Z-סעיפי סך הכל, תמונה אחת 50 מיקרומטר לעיל ואחד 50 מיקרומטר מתחת למישור המוקד הנוכחי.
    הערה: מאחר שרקמות שונות לכבוש מטוסי מוקד שונים, זה יבטיח שלכל תמונות דג הזברה שנתפסו עם הלב וכבד בפוקוס.
  4. להגדיר את הפרמטרים בתוכנה כדי לרכוש תמונת רעפים באמצעות GFP וchanne BFls. תחת לשונית הרכישה, בחר התקנה מתקדמת. אזורי אריח בחרו, אז אריחים. בחרו את האפשרות גם המעגל.
    הערה: אריח משמש ליצירת תמונה מורכבת של כל אחד. שדה ראייה של יחיד לוכדת רק חלק קטן מכל אחד. פונקצית הריצוף יכולה באופן אוטומטי ללכוד מרובה סמוכה משדות של נוף כל טוב, ויוצרת תמונה מורכבת של כל כן. ניתן, אפוא, כדי ללכוד באופן אוטומטי 96 תמונות משולבות לכל צלחת, שבו כל תמונה מורכבת מכילה כמה עשרות תמונות בודדות מבאר אחת.
  5. בחר ספק ולמלא גורם 90%. בחירת גורם מילוי של 90% יהיה ללכוד מספר תמונות של הבארות שנבחרו כך ש90% מהשטח של כל אחד גם יהיו גלויים בתמונה המורכבת.
    הערה: בעת בחירת גורם מילוי, תרשים יוצג מייצג את האזור להיות צילם. בחר אחוז שיכלול את האזור היטבמתאים לניסוי.
  6. תחת אפשרויות, בחר את מידת חפיפה הרצויה.
    הערה: כאשר תופרים יחד אריחים לתמונת נציג יחיד, חפיפה של 5-10% מאפשרת תפר חלק בין תמונות. עם זאת, אם תפרים תמונה הוא מיותרים, באמצעות חפיפה 0% יפחית את זמן הדמיה. שימוש 90% גורם מילוי וחפיפה של 5%, תמונה מורכבת של גם אחת מורכבת מ59 תמונות בודדות.
  7. להתחיל הדמיה. מיקרוסקופ באופן אוטומטי לרכוש תמונות.
  8. באופן ידני לבדוק תמונות משולבות של כל טוב לקרינת רקמות ספציפיות (איור 1).
  9. הערה: עדיף להתחיל עם הביקורת החיובית כדי לאשר שהחשיפה הכימית עבדה לפני התבוננות בארות טיפול ניסיוני.

4. לכידת תמונה ידנית של עוברים בצלחת 96 היטב

הערה: כדי לאשר את התוצאות, השתמש מטרת 20x מרחק עבודה ארוכה לacמקהלת תמונות מפורטות יותר באופן ידני (איור 2).

  1. באמצעות 20x אובייקטיבי וbrightfield (BF) הגדרה, לזהות עובר בקרה חיובי ולהגדיר הגדרות חשיפה לערוצי BF ו-GFP כראוי, ולוודא כי אות הקרינה לא להרוות את המצלמה.
  2. לזהות עוברי אדם וללכוד תמונות באופן ידני.
    הערה: ברגע שהגדרות החשיפה נבחרו לעובר השליטה החיובי, אינו משנה את ההגדרות. זה מאפשר השוואה של עוצמת הקרינה כמו כל תמונה שנתפס בתנאים אחידים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 מציג תמונות מרוכבים מבארות בודדות של צלחת 96 היטב. כל תמונה מורכבת מורכבת מ59 תמונות בודדות עם 5% חפיפה תמונה. שים לב שדג הזברה לחיות מכוונים באופן אקראי בתוך כל טוב, אך אנו מסוגלים להבחין הקרינה בלב מהכבד. תמונות brightfield שימושיות כמו אזכור להעריך נטייה דג הזברה ולדמיין מומים מורפולוגיים (איורים 1 א ו 1 ג). הדמיה אוטומטית באמצעות מטרת 10x משמשת לסינון כימיקלים ולקבוע איזו מתחייב הערכה ידנית בהגדלה גבוהה יותר. איור 2 מרא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה לאוטומטי הקרינה רקמות ספציפיות תמונה בעוברי דג הזברה. הפרוטוקול פותח באמצעות Zeiss Axio אובזרוור. Z1 עם תוכנת זן 2011 כחול, עם זאת הטכניקה יכולה להיות מותאם באמצעות כל מיקרוסקופ הפוכה עם במה ממונעת ותוכנת שליטת מיקרוסקופ שיכול לבצע ריצוף כדי ליצור תמונות מורכבות. הצטיידות מיקרוסקופ הפוכה עם במה ממונעת יכולה לספק אלטרנטיבה מעשית, פחות יקרה לרכישת ציוד מיוחד לסינון גבוה תוכן. שלבים ממונעים נעים בין כמה אלף לעשרות אלפי דולרים בארה"ב, בהתאם לסוג והדגם ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש המחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לסוזן פארמר ואת צוות של מתקן מחקר דג הזברה UAB לטיפול בדג זברה. מימון הניתן על ידי קופות הזנק מהמחלקה לפרמקולוגיה וטוקסיקולוגיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פיפטות העברת פלסטיק; פיפטות העברה מפלסטיק רחבות פישר13-711-23
פיפטות העברת פלסטיק; קצה עדיןפישר13-711-26
96 בארות, צלחות תחתונות עגולות ושטוחותפישר21-377-203
צלחות 100 x 35 מ"מפישר08-757-100D
35 x 60 מ"מ צלחותפישר08-757-100B
Dumont #5 מלקחיים עדיניםFine Science Tools11254-20מידות קצה 0.05 x 0.01 מ"מ, להסרה ידנית של כוריון מעוברים
Tricaine methanesulfonateSigma AldrichA5040-25Gראה ספר דג הזברה למתכון (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63) 
1-פניל 2-תיאוריאה (PTU)סיגמא אולדריץ'P7629-10Gהכן מלאי של 20 מ"מ (פי 100) והשתמש ב-200 μ M ב-E3B 
פרוטוקול Zeiss Axio Observer Z1Carl Zeissדורש מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך עם שלב ממונע
20x מטרת מרחק עבודהארוך Carl Zeissאנו משתמשים במטרה עם מרחק עבודה של 0.4 NA ו-8.4 מ"מ
מצלמה דיגיטלית Axiocam HRm CarlZeiss
ZenBlue 2011 תוכנת בקרת מיקרוסקופCarl Zeissהפרוטוקול דורש תוכנת אוטומציה ובקרה של מיקרוסקופיה כדי לאפשר לכידת תמונות מרוצפות באמצעות שלב ממונע
מתילן כחולסיגמא אולדריץ'MB-1; 25 גרםמייצרים תמיסה של 2% במי RO לשימוש ב-E3B (להלן)
E3B60X E3 תמיסה:
NaCl                                      - 17.2 גרם
KCl                                            - 0.76 גרם
CaCl2-2H2O        - 2.9 גרם
MgSO4-7H2O  - 4.9 גרם או MgSO4 - 2.39 גרם
ממיסים ב-1 ליטר מים Milli-Q; יש לאחסן בבקבוק סטרילי של 1 ליטר.תמיסת

1X E3B לדגי זברה:
60X E3          150 מ"ל
2% מתילן כחול        100 μ l 
מביאים ל-9 ליטר עם Milli-Q מים
 

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens. BMC Developmental Biology. 7, 62(2007).
  2. Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. Retinoic acid-mediated gene expression in transgenic reporter zebrafish. Developmental Biology. , 89-101 (2001).
  3. Gorelick, D. A., Halpern, M. E. Visualization of Estrogen Receptor Transcriptional Activation in Zebrafish. Endocrinology. 152, 2690-2703 (2011).
  4. Tsang, M. Zebrafish: A tool for chemical screens. Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 90, 185-192 (2010).
  5. Peravali, R., et al. Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos. Biotechniques. 50, 319-324 (2011).
  6. Walker, S. L., et al. Automated reporter quantification in vivo: high-throughput screening method for reporter-based assays in zebrafish. PLoS One. 7, (2012).
  7. Vogt, A., et al. Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos. Developmental Dynamics. 238, 656-663 (2009).
  8. Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. J. Vis. Exp. , (2010).
  9. Gruber, C. J., Gruber, D. M., Gruber, I. M., Wieser, F., Huber, J. C. Anatomy of the estrogen response element. Trends in Endocrinology and Metabolism. 15, 73-78 (2004).
  10. Rovira, M., et al. Chemical screen identifies FDA-approved drugs and target pathways that induce precocious pancreatic endocrine differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19264-19269 (2011).
  11. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th edn, University of Oregon Press. (2000).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

96GFPZ

מאמרים קשורים