שתואר כאן הוא פרוטוקול להדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הדמיה חצי אוטומטית של הקרינה רקמות ספציפיות בעוברי דג הזברה
במאמר זה
סיכום
תקציר
עוברי דג הזברה הם כלי רב עוצמה להקרנה בקנה מידה גדולה של מולקולות קטנות. דג הזברה מהונדס המבטאים את חלבוני כתב ניאון משמש לעתים קרובות כדי לזהות כימיקלים המווסתים את ביטוי הגנים. מסכי כימיים שassay הקרינה בדג הזברה לחיות לעתים קרובות מסתמכים על ציוד יקר, מיוחד להקרנת תוכן גבוה. אנו מתארים הליך באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence רגיל עם במה ממונעת באופן אוטומטי לעוברי דג הזברה תמונה ולזהות הקרינה רקמות ספציפיות. שימוש בדג זברה מהונדס שלדווח על פעילות קולטן אסטרוגן דרך ביטוי של ה-GFP, פיתחנו הליך חצי אוטומטי למסך לligands קולטן אסטרוגן המפעיל את הכתב באופן רקמות ספציפיות. בסרטון זה אנו מתארים נהלים לעריכת עוברי דג הזברה ב24-48 שעות שלאחר הפריה (hpf) בצלחת 96 היטב והוספת מולקולות קטנות אשר נקלטות קולטני אסטרוגן. ב72-96 hpf, תמונות של כל אחד גם מכל הצלחת באופן אוטומטי שנאספו ונבדקה באופן ידני לקרינת רקמות ספציפיות. פרוטוקול זה מדגים את היכולת לזהות אסטרוגנים המפעילים קולטנים במסתמי לב, אך לא בכבד.
מבוא
דג הזברה מהונדס פותחו המאפשרת הדמיה הישירה של פעילות במסלולי איתות, כגון צמיחת פיברובלסטים גורמי 1, חומצה רטינואית 2 ואסטרוגנים 3, בעוברים בשידור חי. כלים אלה מאפשרים הקרנה של כימיקלים שיוצרים הפרעת מסלולי איתות (assayed כשינוי בעוצמת הקרינה) או לכימיקלים המווסתים איתות באופן רקמות ספציפיות (שינוי בלוקליזציה הקרינה) 4. לכידת תמונה אוטומטית מגדילה את התפוקה של מסכי כימיים באופן דרמטי 5,6. מסכים שהקרינה באופן אוטומטי assay בדג הזברה לחיות לעתים קרובות מסתמכת על ציוד יקר, מיוחד. מה שנקרא גבוה הקרנת תוכן מספקת את היתרון של רזולוציה גבוהה, הדמיה כמותית אך במחיר של שימוש בקוראי צ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: פרוטוקול זה אושר על ידי אוניברסיטת אלבמה בועדת טיפול בבעלי חיים ושימוש המוסדית ברמינגהאם.
1. רבייה דג הזברה ואוספי ביצה
- שלושה ימים לפני תחילת חשיפה לחומרים כימיים, להרכיב טנקי רבייה עם חוצצים לזכרים ונקבות נפרדים. ממלא כל מחצית הדרך מיכל עם מים מערכת חקלאות ימית. שימוש ברשת, להעביר Tg (5xERE: GFP) דגי c262/c262 לטנקים רבייה, הצבת 2 זכרים ונקבות 3 בכל אחד טנק מופרד על ידי מחיצה. מניחים את המכסה על כל טנק ותווית עם תאריך וזנים שחצו. ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 1 מציג תמונות מרוכבים מבארות בודדות של צלחת 96 היטב. כל תמונה מורכבת מורכבת מ59 תמונות בודדות עם 5% חפיפה תמונה. שים לב שדג הזברה לחיות מכוונים באופן אקראי בתוך כל טוב, אך אנו מסוגלים להבחין הקרינה בלב מהכבד. תמונות brightfield שימושיות כמו אזכור להעריך נטייה דג הזברה ולדמיין מומים מורפולוגיים (איורים 1 א ו 1 ג). הדמיה אוטומטית באמצעות מטרת 10x משמשת לסינון כימיקלים ולקבוע איזו מתחייב הערכה ידנית בהגדלה גבוהה יותר. איור 2 מרא.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה לאוטומטי הקרינה רקמות ספציפיות תמונה בעוברי דג הזברה. הפרוטוקול פותח באמצעות Zeiss Axio אובזרוור. Z1 עם תוכנת זן 2011 כחול, עם זאת הטכניקה יכולה להיות מותאם באמצעות כל מיקרוסקופ הפוכה עם במה ממונעת ותוכנת שליטת מיקרוסקופ שיכול לבצע ריצוף כדי ליצור תמונות מורכבות. הצטיידות מיקרוסקופ הפוכה עם במה ממונעת יכולה לספק אלטרנטיבה מעשית, פחות יקרה לרכישת ציוד מיוחד לסינון גבוה תוכן. שלבים ממונעים נעים בין כמה אלף לעשרות אלפי דולרים בארה"ב, בהתאם לסוג והדגם .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש המחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
אנו מודים לסוזן פארמר ואת צוות של מתקן מחקר דג הזברה UAB לטיפול בדג זברה. מימון הניתן על ידי קופות הזנק מהמחלקה לפרמקולוגיה וטוקסיקולוגיה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| פיפטות העברת פלסטיק; פיפטות העברה מפלסטיק רחבות פישר | 13-711-23 | ||
| פיפטות העברת פלסטיק; קצה עדין | פישר | 13-711-26 | |
| 96 בארות, צלחות תחתונות עגולות ושטוחות | פישר | 21-377-203 | |
| צלחות 100 x 35 מ"מ | פישר | 08-757-100D | |
| 35 x 60 מ"מ צלחות | פישר | 08-757-100B | |
| Dumont #5 מלקחיים עדינים | Fine Science Tools | 11254-20 | מידות קצה 0.05 x 0.01 מ"מ, להסרה ידנית של כוריון מעוברים |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma Aldrich | A5040-25G | ראה ספר דג הזברה למתכון (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63) |
| 1-פניל 2-תיאוריאה (PTU) | סיגמא אולדריץ' | P7629-10G | הכן מלאי של 20 מ"מ (פי 100) והשתמש ב-200 μ M ב-E3B |
| פרוטוקול Zeiss Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | דורש מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך עם שלב ממונע | |
| 20x מטרת מרחק עבודה | ארוך Carl Zeiss | אנו משתמשים במטרה עם מרחק עבודה של 0.4 NA ו-8.4 מ"מ | |
| מצלמה דיגיטלית Axiocam HRm Carl | Zeiss | ||
| ZenBlue 2011 תוכנת בקרת מיקרוסקופ | Carl Zeiss | הפרוטוקול דורש תוכנת אוטומציה ובקרה של מיקרוסקופיה כדי לאפשר לכידת תמונות מרוצפות באמצעות שלב ממונע | |
| מתילן כחול | סיגמא אולדריץ' | MB-1; 25 גרם | מייצרים תמיסה של 2% במי RO לשימוש ב-E3B (להלן) |
| E3B | 60X E3 תמיסה: NaCl - 17.2 גרם KCl - 0.76 גרם CaCl2-2H2O - 2.9 גרם MgSO4-7H2O - 4.9 גרם או MgSO4 - 2.39 גרם ממיסים ב-1 ליטר מים Milli-Q; יש לאחסן בבקבוק סטרילי של 1 ליטר.תמיסת 1X E3B לדגי זברה: 60X E3 150 מ"ל 2% מתילן כחול 100 μ l מביאים ל-9 ליטר עם Milli-Q מים |
מקורות
- Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens. BMC Developmental Biology. 7, 62(2007).
- Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. Retinoic acid-mediated gene exp....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
