ליניארי ההגברה המתווכת PCR - לוקליזציה של אלמנטים גנטיים ואפיון ידוע האיגוף DNA

Summary

ליניארי הגברה בתיווך (לאם)-PCR היא שיטה שפותחה כדי לזהות את העמדות של שילוב וקטורים ויראליים בגנום המדויקות. הטכניקה התפתחה להיות השיטה מעולה ללמוד דינמיקה משובט בחולי ריפוי גנטי, בטיחות ביולוגית של טכנולוגיות חדישות וקטורית, גיוון תא T, מודלים תא גזע סרטני, וכו '

Abstract

PCR מתווך הגברה ליניארית (LAM-PCR) פותח כדי לחקור המטופואיזיס בתאים מתוקנים גנטית של חולים שטופלו בריפוי גנטי עם מערכות וקטוריות משולבות. בשל האינטגרציה היציבה של וקטורים רטרו-ויראליים, ניתן להשתמש באתרי אינטגרציה כדי לחקור את גורלם המשובט של תאים בודדים וצאצאיהם. LAM-PCR סיפק לראשונה ראיות לכך שלוקמיה בטיפול גנטי בחולים שטופלו מקורה בביטוי יתר של פרוטו-אונקוגן שכן. הרגישות והספציפיות הגבוהות של LAM-PCR בהשוואה לשיטות קיימות כמו PCR הפוך ותיווך קשירה (LM)-PCR מושגת על ידי שלב הגברה ראשונית (PCR ליניארי של 100 מחזורים) באמצעות פריימרים ספציפיים לווקטור ביוטיניל המאפשרים לבצע שלבי תגובה עוקבים על פאזה מוצקה (חרוזים מגנטיים). LAM-PCR היא כיום השיטה הרגישה ביותר הקיימת לזיהוי DNA לא ידוע הממוקם בסמיכות ל-DNA ידוע. לאחרונה פותחה גרסה של LAM-PCR העוקפת את עיכול ההגבלה ובכך מבטלת את הטיית האחזור של אתרי אינטגרציה ומאפשרת ניתוח מקיף של מיקומי פרו-וירוסים בגנום המארח. הפרוטוקול הבא מסביר צעד אחר צעד את ההגברה של רצפי 3'- ו- 5' הסמוכים לווקטור המשולב של הלנטי-ויראלי.

Introduction

ליניארי הגברה בתיווך PCR (לאם-PCR) מאפשר זיהוי ואפיון DNA איגוף לא ידוע הסמוך לDNA ידוע מכל מקור. באופן ספציפי יותר, לאם-PCR פותח כדי לבצע לוקליזציה של אתרי אינטגרציה וקטור ויראלי (IS) בתוך הגנום המארח ^1,2. אלמנטים גנטיים כמו רטרווירוסים או transposons לשלב הגנום שלהם לתוך הגנום המארח באופן אקראי (למחצה) ^3-6. במקרים רבים זה הוא מכריע לדעת בדיוק המצב שבו הווקטורים האלה משולבים. לאם-PCR הוכח להיות עדיף על שיטות אלטרנטיביות כמו בתיווך קשירת PCR ⁷ וגרסותיה או PCR ההפוך ^8. הרגישות וחוסנה של שיטה זו נובעים מpreamplification הראשוני של צמתים וקטור הגנום ובחירה מגנטית של מוצרי ה-PCR מוגבר. כמו השיטות חלופיות שהוזכרו, לאם-PCR מסתמך על השימוש באנזימי הגבלה, מציג נטייה ליכולת אחזור של IS ^9-11. כך,רק קבוצת משנה של הרפרטואר (integrome) ניתן לאתרם בתגובה אחת. הטיה זו היא למזער על ידי הניתוח המקביל של מדגם נתון באמצעות שילובים אופטימליים של אנזימי הגבלה ^9. לאחרונה, גרסה של הטכנולוגיה שמכונה שאינם מגבילה לאם-PCR (nrLAM-PCR) פותח שעוקפת את השימוש באנזימי הגבלה ומאפשרת ניתוח הגנום משוחד של מדגם בתגובה אחת ^9,12.

בעבר, לאם-PCR נעשה שימוש כדי לזהות את רטרווירלי סיבתי נותן עלייה לוקמיה בכמה חולים בניסויים בריפוי גנטי קליניים ^13-15. מאז, לאם-PCR הותאם לזהות IS מוקטורים אחרים שילוב (וקטורי lentiviral, transposons) וגם לזהות דפוסי השתלבות של פסיבי שילוב וקטורים כמו וקטורי adeno קשור (AAV) או וקטורי lentiviral אינטגראז פגום (IDLV) ^{16 -21.} יישומים של האם-PCR הם רחב התפשטו: מסורתיly, הטכניקה היא בשימוש נרחב כדי לחקור את ההרכב המשובט של תאי גנים שונה בחולים שעברו טיפול גנטי או להעריך את הבטיחות הביולוגית של מערכות וקטור רומן של התרת האינטגרציה שלהם התנהגות ^15,16,22-24. לאחרונה, לאם-PCR אפשר קביעת הספציפיות ופעילות מחוץ היעד של nucleases מעצב ידי assay השמנת IDLV ^25.

יתר על כן, לאם-PCR מאפשר לעקוב בקלות את גורלו של תא transduced לאורך הזמן באורגניזם. זה מאפשר לזהות אב - אונקוגנים כמו גם גנים מדכאי סרטן וגם ללמוד ביולוגיה של תא גזע סרטני hematopoiesis או ^26-28. אחרון אך לא פחות חשוב, לאם-PCR הותאם ללמוד גיוון קולט תא T בבני אדם ²⁹ (ונתונים שלא פורסמו).

הכוח הפנימי של הטכנולוגיה מקבל חיזוק על ידי קישור השיטה לטכנולוגיות רצף עמוקים המאפשרות אפיון מיליונים DNA ידוע איגוף עם r נוקלאוטיד יחידesolution בגנומים שלמים. בפרוטוקול הבא, אנו מתארים צעד אחר צעד ההגברה וזיהוי של איגוף DNA ידוע exemplarily לזהות וקטור lentiviral IS. Oligonucleotides שימוש בפרוטוקול מפורטת בטבלה 1. חולץ DNA או cDNA של כל מקור יכול לשמש כתבנית ה-DNA לאם-PCR וnrLAM-PCR.

Protocol

1. הכנת קלטות לינקר (LC)

1. מערבבים 40 μl של oligonucleotide LC1 (טבלת 1), 40 μl של oligonucleotide LC2 (טבלת 1, עם הסככה אנזים הגבלה מתאימה), 110 μl טריס-HCl (100 מ"מ, pH 7.5), ו10 μl 250 מ"מ MgCl _2.
2. לדגור על 95 מעלות צלזיוס למשך 5min ולתת התגובה להתקרר באיטיות לטמפרטורת חדר. הוסף 300 μl H ₂ O ולהתרכז dsLinker-DNA על מסנן צנטריפוגה. הוסף 80 μl H ₂ O לeluate וaliquot 10 μl של קלטת מקשר מוכנה ב0.2 צינורות PCR.

2. Preamplification של צמתי הגנום וקטור

1. עבור כל מדגם להיות מנותחים להכין תגובת PCR 50 μl.
   1. לקבוע את הריכוז של דגימות דנ"א. פיפטה x μl (1-1,000 ng לLAM/100-1, 000 ng לnrLAM) של ה-DNA לתוך צינור PCR 0.2 מיליליטר. נפח של ה-DNA צריך להיות שווה בכל דגימה וברןGE של 0.5-25 μl.
   2. הכן תערובת אב PCR כפי שמתואר בטבלה 2 מיקס (50 - x). Μl של תמהיל ההורים עם כל דגימת ה-DNA ב0.2 מיליליטר צינורות PCR.
2. צמתים הגנום וקטור Preamplify באמצעות תנאי PCR שהודגם בטבלה 2. לאחר השלמת PCR להוסיף 0.5 μl תקי פולימראז לכל צינור PCR ותכנית ה-PCR בשידור חוזר. ניתן לאחסן את מוצרי ה-PCR על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 4 ימים או לטווח ארוך ב -20 ° C.

3. הפרדה מגנטית של מוצרי ה-PCR

1. הכנת חרוזים מגנטיים
   1. פיפטה 20 μl (200 מיקרוגרם) של חרוזים מגנטיים streptavidin המצופה לתוך צינור 1.5 מ"ל ולחשוף דקות 1 על מפריד החלקיקים המגנטי (MPS) בטמפרטורת חדר. בטל supernatant.
   2. הסר את הצינור מMPS ו resuspend חרוזים מגנטיים ב40 PSB μl / BSA 0.1% (pH 7.5). לחשוף לMPS דקות 1 וזורקים supernatant. חזור על פעולה זו פעם אחת.
   3. לשטוף חרוזי wiה 20 μl של 3 פתרון M LiCl (3 M LiCl, 10 מ"מ טריס-HCl, 1 mM EDTA) לחשוף לMPS דקות 1 וזורקים supernatant. חרוזים resuspend ב 50 μl של 6 פתרון M LiCl (6 M LiCl, 10 מ"מ טריס-HCl, 1 mM EDTA).
2. מערבבים את תגובת PCR כל משלב 2.2 עם 50 μl של חרוזים מגנטיים שהוכנו מראש. דגירה על שייקר אופקי (300 סל"ד) לפחות לשעה 2 בטמפרטורת חדר. שלב זה מאפשר קשירה של מוצר ה-PCR biotinylated לstreptavidin חרוזים מצופים (מורכב ה-DNA ביד). מורכב חרוז ה-DNA יכול להיות מודגרות שבייקרה לילה או מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 4 ימים.
3. לחשוף מורכב-DNA חרוז לMPS 1 דקות בטמפרטורת חדר, להסיר supernatant, resuspend מורכב-DNA חרוז ב100 μl H ₂ O. מייד להמשיך בשלב 4 לאם או על שלב 5 עבור nrLAM.

4. לאם-סדר דין

1. הכפול הגדיל DNA (dsDNA) סינתזה (לאם בלבד)
   1. לחשוף את ה-DNA המורכב ביד מהשלב 3.3 לMPS דקות 1 ודיסsupernatant כרטיס. הוספת 8.25 μl של H ₂ O, 1 μl חיץ 10x hexanucleotide, 0.25 dNTPs μl (10 מ"מ) ו0.5 μl (2 U) פולימראז Klenow. לדגור על C ° 37 במשך שעה 1.
   2. הוספת 90 μl של H ₂ O ולחשוף לMPS דקות 1. בטל supernatant ומורכב ה-DNA חרוז resuspend ב 100 μl H ₂ O.
2. ההגבלה Digest
   1. לחשוף מורכב-DNA חרוז לMPS דקות 1 וזורקים supernatant. הוספת 8.5 μl H ₂ O, 1 μl חיץ 10x אנזים הגבלה ו0.5 μl של אנזים הגבלה ודגירת תגובה במשך שעה 1. חזור על השלב 4.1.2.
      הערה: דגירה תגובה בטמפרטורה המומלצת על ידי היצרן של אנזים ההגבלה. ודא כי אין כיום אתר הגבלה בתוך או במורד הזרם של האתר מחייב פריימר משמש לpreamplification ב-DNA של עניין. לבחירה של שילובי אנזים אנזימי הגבלה / הגבלה המתאימים להתייחס ^ל9.
3. קשירה של ds לינקר (LK)
   1. לחשוף מורכב-DNA חרוז לMPS דקות 1 וזורקים supernatant. הוסף 5 μl H ₂ O, 1 μl חיץ 10x Fastlink, ATP μl 1 (10 מ"מ), 2 μl קלטת לינקר משלב 1.2, ו1 μl מהיר-Link-DNA אנזים (2 U / μl). דגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. חזור על השלב 4.1.2.
4. Denaturation של המסונתז dsDNA
   1. לחשוף מורכב-DNA חרוז לMPS דקות 1 וזורקים supernatant. מורכב resuspend-DNA חרוז ב5 μl 0.1 N NaOH. דגירה 5 דקות בטמפרטורת חדר על שייקר אופקי.
   2. לחשוף מורכב-DNA חרוז לMPS דקות 1 ולאסוף צומת וקטור הגנום preamplified המכילה supernatant בצינור 1.5 מיליליטר חדש. מייד להמשיך בשלב 6 או supernatant חנות ב -20 ° C.

5. NrLAM-סדר דין

1. קשירה של מקשר חד גדילים (ssLC) (nrLAM בלבד)
   1. לחשוף את ה-DNA המורכב ביד מהשלב 3.3 לMPSדקות 1 ו supernatant קלפים שנזרקו. הוספת 6.5 μl H ₂ O, μl 1 CircLigase 10x תגובת הצפת, 0.5 μl MnCl ₂ (50 מ"מ), 0.5 μl-ATP (1 מ"מ), oligonucleotide ssLinker μl 1 וCircLigase 0.5 μl (100 U / μl). לדגור על C ° 60 במשך שעה 1.
   2. הוספת 90 μl של H ₂ O ולחשוף לMPS דקות 1. בטל supernatant ולשטוף מורכבים-DNA חרוז ב100 μl H ₂ O. שוב לחשוף לMPS דקות 1, supernatant קלפים שנזרקו ומורכב ה-DNA חרוז resuspend ב H μl 10 ₂ O.

6. מעריכי ההגברה אני

1. עבור כל מדגם להיות מנותחים להכין תגובת PCR 50 μl.
   1. פיפטה 2 תבנית ה-DNA μl (משלב 4.4.2 (לאם) או 5.1.2 (nrLAM)) לתוך צינור PCR 0.2 מיליליטר.
   2. הכן תערובת אב PCR כפי שמתואר בטבלה 3. הוספת 48 μl של מיקס מאסטר כל דגימה מהצעד 6.1.1 ולהגביר צמתים הגנום וקטור ידי conditio PCRNS שהודגם בטבלה 3. ניתן לאחסן מוצרי ה-PCR על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 4 ימים או לטווח ארוך ב -20 ° C.

7. הפרדה מגנטית של מוצרי ה-PCR

1. הכן את חרוזים מגנטיים כפי שהודגם בצעדים 3.1.1 - 3.1.3. חרוזים resuspend ב 20 μl (לאם) או 50 μl (לnrLAM) של 6 פתרון M LiCl (6 M LiCl, 10 מ"מ טריס-HCl, 1 mM EDTA). מערבבים 20 μl (לאם) או 50 μl (nrLAM) של תגובת PCR מהצעד 6.1.2 עם חרוזים מגנטיים מוכנים (צעד 7.1) ו דגירה על שייקר אופקי (300 סל"ד) עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר. מורכב חרוז ה-DNA יכול להיות מודגרות שבייקרה לילה או מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 4 ימים.
2. לחשוף מורכב-DNA חרוז לMPS דקות 1, להסיר את supernatant ו resuspend מורכב-DNA חרוז ב100 μl H ₂ O. לחשוף מורכב-DNA חרוז לMPS דקות 1 וזורקים supernatant.
3. קומפלקס ה-DNA חרוז resuspend ב 20 μl (לאם) או 5 μl (nrLAM) 0.1 N NaOH. Incuבייט ל10 דקות בטמפרטורת חדר על שייקר אופקי, לחשוף לMPS דקות 1 ולאסוף supernatant DNA המכיל מוגבר בצינור 1.5 מיליליטר חדש. מייד להמשיך עם צעד 8.1 או supernatant חנות ב -20 ° C.

8. מעריכי ההגברה השני

1. עבור כל מדגם להיות מנותחים להכין תגובת PCR 50 μl.
   1. פיפטה 2 תבנית ה-DNA μl (משלב 7.3) לתוך צינור PCR 0.2 מיליליטר.
   2. הכינו תערובת אב PCR כפי שמתואר בטבלה 4. הוספת 48 μl של מיקס מאסטר כל דגימה מהצעד 8.1.1 ולהגביר צמתים הגנום וקטור ידי תנאי ה-PCR שהודגם בטבלה 4. ניתן לאחסן מוצרי ה-PCR על 4 מעלות צלזיוס עד 4 ימים או לטווח ארוך ב -20 ° C.
2. כדי להמחיש (ע"נ) מוצרים לאם-PCR, עומס 10 μl של המוצר ה-PCR מצעד 8.1.2 על ג'ל agarose 2%. אם להקות גלויות, לנתח 10 μl של המוצר לאם-PCR על ג'ל ברזולוציה גבוהה. זהירות: Etברומיד hidium הוא mutagenic. לעבוד בזהירות ותמיד ללבוש כפפות מתאימות.

9. הכנה לרצף תפוקה גבוהה

1. טיהור (ע"נ) מוצרים לאם-PCR
   1. מערבבים 40 μl PCR-מוצרים מהצעד 8.1.2 עם 44 μl של חרוזים מגנטיים טמפרטורת חדר AMPure XP. דגירה 5 דקות בטמפרטורת חדר ולחשוף לMPS למשך 2 דקות נוספות.
   2. בטל supernatant ולשטוף פעמיים עם 200 μl EtOH 70% על MPS.
   3. בטל supernatant ומורכב ה-DNA חרוז resuspend ב30 H μl ₂ O. דגירה 1 דקות וsupernatant העברה לצינור 0.2 מיליליטר טרי. לקבוע את הריכוז של ה-DNA מטוהר.
2. Fusionprimer PCR להוסיף רצף מתאמים ספציפיים.
   1. עבור כל מדגם להיות מנותחים להכין תגובת PCR 50 μl.
   2. פיפטה x μl (40 ng) של ה-DNA לתוך צינור PCR 0.2 מיליליטר. נפח של ה-DNA צריך להיות שווה בכל דגימה ובטווח של 0.5-25 μl.
   3. הכן תערובת אב PCR כפי שמתואר בטבלה 5 הוסף (50 - x). Μl של מיקס מאסטר כל דגימה מהצעד 9.2.2 ולהציג את מתאמי רצף ל( ע"נ) מוצרים לאם-PCR על ידי תנאי ה-PCR שהודגם בלוח 5 מוצרי ה-PCR. יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 4 ימים או לטווח ארוך ב -20 ° C.
   4. כדי להמחיש את עומס מוצרי Fusionprimer-PCR 10 μl של המוצר ה-PCR מהצעד 9.2.3 על ג'ל agarose 2%. לטהר את המוצר ה-PCR שנותר כפי שמתואר בצעדים 9.1.1 - 9.1.3. נתח 1 μl מוצר ה-PCR מטוהר מצעד 9.4 על מכשיר אלקטרופורזה ברזולוציה גבוהה אוטומטי מדויק לכמת גודל ריכוז ושבר של מוצרי Fusionprimer-PCR.

Results

לאם-PCR תוצאות בהגברה של צמתים הגנום וקטור עם גודל שבר שהוגדר עבור כל צומת. הגודל של שברי PCR פרט תלוי במרחק בין המיקום של ה-DNA הידוע בגנום ואתר ההכרה הקרוב ביותר הגבלת האנזים. זה מאפשר לדמיין את המגוון של צמתים מוגברות בדגימות נותחו על ידי ג'ל אלקטרופורזה, למשל., אם רק להקות בודדות (חד שבטי), כמה (oligoclonal), או מרובות (polyclonal) נמצאות על ג'ל. תוצאות לאם-PCR הם נראים במיטבו על ידי ג'לים ברזולוציה גבוה אלקטרופורזה (איור 2 א), אך יכולות גם להיות דמיי...

Discussion

הטכניקה לאם-PCR מאפשרת זיהוי רצפי DNA ידועים כי האגף אזור ה-DNA ידוע. בגלל הרגישות הגבוהה וכתוצאה מpreamplification של צמתים עם הכלאת פריימרים ספציפיים ברצף ה-DNA הידוע, אפשר להגביר ולזהות אפילו צמתים נדירים עד לרמת התא הבודד. להיפך, במצב polyclonal לאם-PCR הוא מסוגל להגביר אלפי צמתים שונים בתגובה אחת.

עם זאת, בשל השימוש באנזימי ההגבלה רק subfraction של integrome יכול להיות מנותח על ידי אם-PCR לנוכחות של צמתים עם...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ניתן להשתמש ב-Taq DNA Polymerase	Genaxxon Bioscience GmbH	M3001.5000	ניתן להשתמש בפולימראזות חלופיות של Taq
Buffer	Qiagen	201203	השימוש במאגר זה מומלץ
dNTP-Blend	Genaxxon Bioscience GmbH	M3015.4020	או כל dNTPs אחר
אוליגונוקלאוטידים (פריימרים)	MWG Biotech		HPLC Dynabeads מטוהרים
M-280 סטרפטווידין	Invitrogen	11206D
PBS	Gibco	14190-086	0.1% משקל/נפח BSA
6 M LiCl	Roth	3739.1	10 מ"מ Tris-HCl (pH 7.5)/1 מ"מ EDTA
Tris-HCl, pH 7.5	USB Corporation	22637	או כל ספק אחר
EDTA	Applichem	A1103,0250	או כל ספק אחר
Klenow Polymerase	Roche Diagnostics	10104523001
תערובת Hexanucleotide	Roche Diagnostics	11277081001
Restriction endonuclease	NEB		או כל ספק אחר
ערכת	קשירת DNA Fast-LinkEpicentre Biotechnologies	LK11025
CircLigase ssDNA Ligase Kit	Epicentre Biotechnologies	CL4111K
NaOH	Sigma-Aldrich	72068	או כל ספק אחר
Agarose LE	Roche Diagnostics	11685660001	או כל ספק אחר
TBE buffer	Amresco	0658	או כל ספק אחר
אתידיום ברומיד	Applichem	A2273,0005	אתידיום ברומיד הוא מוטגני
100 bp סולם DNA	Invitrogen	15628-050	או כל סולם DNA אחר
20 מ"מ NaCl	Sigma-Aldrich	71393-1L	או כל ספק אחר
Magna-Sep מפריד חלקיקים מגנטי	Life Technologies	K158501	לשימוש עם צינורות 1.5 מ"ל
מפריד חלקיקים מגנטי Magna-Sep	Life Technologies	K158696	לשימוש עם צלחות 96 בארות
Amicon Ultra-0.5, ממברנה Ultracel-30	Millipore	UFC503096
PerfectBlue Gelsystem Midi S	PeqLab	40-1515	או מערכת אלקטרופורזה אחרת
TProfessional 96	Biometra	050-551	או Thermocycler אחר לצלחות 96 בארות
שייקר אורביטלי KS 260 בסיסי	IKA	2980200	או שייקר אופקי אחר
PCR softtubes 0.2 מ"ל	Biozym Scientific GmbH		711082 או צינורות PCR אחרים של 0.2 מ"ל
צינורות 1.5 מ"ל	Eppendorf	12682	או צינורות אחרים של 1.5 מ"ל
מערכת תיעוד ג'ל	PeqLab		או כל מערכת תיעוד ג'ל אחרת
Nanodrop ND-1000 ספקטרופוטומטר	Thermo Scientific	ND-1000
Spreadex EL1200 ג'ל טרומי	Elchrom Scientific	3497
מכשיר אלקטרופורזה ג'ל שקוע SEA 2000	Elchrom Scientific	2001E
2100 אלקטרופורזה ביואנלייזר	Agilent Technologies	G2939AA