מודל של עכברים של דלקת כרונית הנגרם על ידי פתוגן באתרים מקומיים ומערכתיים

סיכום

מודלים של בעלי החיים הוכיחו להיות כלי רב ערך בהגדרת מנגנונים ספציפיים מארח ופתוגן שתורמים להתפתחות של דלקת כרונית. כאן אנו מתארים מודל עכבר של זיהום אוראלי עם הפתוגן האנושי Porphyromonas gingivalis ומתודולוגיות פרט כדי להעריך את ההתקדמות של דלקת באתרים מקומיים ומערכתיים.

תקציר

דלקת כרונית היא נהג עיקרי של נזק לרקמות פתולוגית ואופייני מאחד של מחלות כרוניות רבות בבני אדם, כולל גידולים, אוטואימוניות, ומחלות דלקתיות כרוניות. מתעורר ראיות מסבכות דלקת כרונית הנגרם על ידי פתוגן בהתפתחות וההתקדמות של מחלות כרוניות עם מגוון רחב של ביטויים קליניים. עקב אטיולוגיה המורכבת וכמה גורמים למחלות כרוניות, תכנון ניסויים להוכחת סיבתיות והקמת קישורים מכניסטית הוא כמעט בלתי אפשרי בבני אדם. יתרון של שימוש במודלים של בעלי חיים הוא שגורמים גנטיים וסביבתיים גם שעשויה להשפיע על מהלך מחלה מסוימת יכולים להיות נשלטו. כך, בעיצוב מודלים של בעלי חיים רלוונטיים של זיהום, מהווה צעד מרכזי בזיהוי מנגנונים ספציפיים מארח ופתוגן שתורמים לדלקת כרונית.

כאן אנו מתארים מודל עכבר של infla הכרוני הנגרם על ידי פתוגןmmation באתרים מקומיים ומערכתיים בעקבות זיהום עם הפתוגן האוראלי Porphyromonas gingivalis, חיידק קשור קשר הדוק עם מחלת חניכיים אנושית. Oral זיהום של עכברים חופשיים הספציפי לפתוגן גורם תגובה דלקתית מקומית וכתוצאה מכך ההרס של שן התמיכה עצם מכתשי, סימן היכר של מחלת חניכיים. במודל שהוקם בעכבר של טרשת עורקים, זיהום עם P. gingivalis מאיץ בתצהיר רובד דלקתי בתוך עורק סינוס וinnominate אב העורקים, מלווה בהפעלה של האנדותל כלי הדם, חודר לתוך תא חיסוני מוגבר, וביטוי מוגבר של מתווכים דלקתיים בנגעים. אנו מתודולוגיות פרט להערכה של דלקת באתרים מקומיים ומערכתיים. השימוש בעכברים מהונדסים ומוטציות של חיידקים מוגדרים הופכים מודל זה מתאים במיוחד לזיהוי שני מארח וגורמי חיידקים מעורבים בייזום, ההתקדמות, והתוצאה של מחלה. Additionally, המודל יכול לשמש מסך לאסטרטגיות טיפוליות חדשניות, הכוללים חיסון והתערבות תרופתית.

מבוא

דלקת כרונית היא נהג עיקרי של נזק לרקמות פתולוגית ואופייני מאחד של מחלות כרוניות רבות בבני אדם. מחלות אלה כוללות גידולים, אוטואימוניות, ומחלות דלקתיות כרוניות ^1. אטיולוגיה של מחלות כרוניות רבות עדיין לא ברורה, אבל הוא הבין להיות מורכב וכמה גורמים ומעורבים הן נטייה גנטית לבין המבוא של גורמים סביבתיים. בעוד המנציחים של דלקת להישאר חמקמקים, הפרופילים התאיים ומולקולריים של הפעלה חיסונית חופפים במידה ניכרת עם אלה דפוסים שנצפו בתגובות מארח לפתוגנים ^2.

ראיות מצטברות מפלילות זיהום עם פתוגנים חיידקים בהתפתחות והתקדמות של דלקת כרונית והביטויים הקליניים המגוונים שלה ^2,3. פתוגנים יכולים לגרום ולקיים דלקת כרונית ישירות על ידי חתירה תחת המערכת החיסונית המארח והקמת זיהומים מתמשכים ^{4. בהיעדר ההתמדה של חיידקים, זיהום יכול לזרז דלקת כרונית מתגובות אוטואימוניות מופעלות על ידי חיקוי מולקולרי לאנטיגנים עצמיים, שינויים באנטיגנים עצמי ההופכים אותם חיסוני, או נזק שמשחרר אנטיגנים מארח רעול פנים בעבר. לעיתים נדירות אך יש לי פתוגנים ספציפיים זוהו כגורם האוניברסלי של מחלה כרונית מסוימת. במקום זאת, רוב הנתונים שבידינו עולה כי פתוגנים להשתמש במנגנונים שונים כדי לעורר דלקת כרונית עם קשת רחבה של ביטויים קליניים ותוצאות מחלה במארח גנטי רגיש 3. לפיכך, הבנה מפורטת של המנגנונים שבאמצעותם פתוגנים ספציפיים לגרום לדלקת כרונית עשויים להיות השלכות משמעותיות על בריאות ציבור, כמו גם טיפול ומניעה של מחלות כרוניות רבות.}

למרות שהמנגנונים הספציפיים המארח והפתוגן תורמים לאינדוקציה והתחזוקה של דלקת כרונית הםהבין היטב, והתקדמות במודלים של דלקת כרונית הנגרם על ידי פתוגן החלה לקדם את ההבנה של תהליכים אלה שלנו. פ מודל זיהום אוראלי gingivalis הוא מודל ייחודי, מאופיין היטב בעכבר של דלקת כרונית הנגרם על ידי פתוגן המאפשרת הניתוח של מנגנוני מארח והפתוגן ספציפיים תורמים לדלקת כרונית ב( אובדן עצם אוראלי) מקומי ואתרים מערכתיים (טרשת עורקים) ^5,6.

פ gingivalis הוא, הפתוגן האוראלי אנאירובי גראם שלילי מעורב במחלת חניכיים אנושית, מחלה דלקתית כרונית המונע זיהום מאופיין בהרס של שן תמיכה ברקמה ^7. בנוסף לפתולוגיה באתר הראשוני של זיהום, ראיות מצטברות מפלילות פ gingivalis -induced דלקת כרונית בהתפתחות וההתקדמות של מחלות מערכתיות כוללים טרשת עורקים ^5, מחלה המאופיינת בinflammatio הכרוניn של קיר כלי דם. Oral זיהום של עכברים חופשיים הספציפי לפתוגן עם פ gingivalis גורם תגובה דלקתית מקומית שגורמת להרס של שן תמיכה עצם מכתשי ^8. פ ניתן לשחזר gingivalis מפיהם של עכברים נגועים עד 42 ימים שלאחר זיהום ⁸ ועכברים לפתח רמות גבוהות של טיטר נוגדנים בסרום הפתוגן ספציפי ^9. במודל שהוקם בעכבר של טרשת עורקים באמצעות אפוליפופרוטאין-E ^{- / -} עכברים (ApoE ^{- / -),} זיהום אוראלי עם פ gingivalis גורם לדלקת כרונית המניעה את תצהיר פלאק דלקתי בתוך הסינוס אב העורקים ¹⁰ ועורק innominate ^11. דלקת מתקדמת בתוך עורק innominate של פ gingivalis -infected ניתן לנטר עכברים בבעלי חיים באמצעות בMRI vivo. בהיסטולוגיה, נגעים בעורקים מפ gingivalis -infected עכברי תערוכת הצטברות מוגברת של שומני accompanied על ידי הפעלה של האנדותל כלי הדם, חודר לתוך תא חיסוני מוגבר, וביטוי מוגבר של מתווכים דלקתיים ^12. שימוש במודל זה בעכברי נוקאאוט כבר הובהר תפקידם של רכיבי איתות מארח ומתווכים דלקתיים, כמו גם תא אינטראקציות ייחודיות המניעות פ gingivalis -induced immunopathology ^{12 - 14.} בנוסף, ניסויי ניצול מוטציות חיידקים מוגדרים זיהו פ הקריטי gingivalis ארסיות גורמים תורמים לדלקת כרונית באתרים מקומיים ומערכתיים ^15.

מאמר זה מפרט שיטות להערכת פ gingivalis -induced דלקת כרונית באתרים מקומיים ומערכתיים. אנו מספקים פרוטוקול מפורט לניתוח של איבוד מסת עצם מכתשי על ידי microCT באמצעות תוכנת עמירה. בנוסף, אנו מגדירים את תוכנית השירות של סידורי בMRI החי vivo להערכת מתקדמת בflammation בתוך העורק innominate. אנו כוללים מתודולוגיות להדמיה וכימות של פלאק הדלקתי בנגעים בעורקים, ומתארים את האפיון היסטולוגית שלהם. השימוש בעכברים מהונדסים ומוטציות של חיידקים מוגדרים הופכים מודל זה מתאים במיוחד לזיהוי שני מארח וגורמי חיידקים מעורבים בייזום, ההתקדמות, והתוצאה של מחלה. בנוסף, המודל יכול לשמש מסך לאסטרטגיות טיפוליות חדשניות, הכוללים חיסון והתערבות תרופתית.

פרוטוקול

.1 צמיחה וטיפוח של חיידקים

1. מניות Streak קפוא של פ gingivalis 381 על גבי צלחות אגר דם אנאירובי ודגירה של 3 - 5 ימים בתא אנאירובי (H 10% _2/10% N CO _{2/80% 2)} על 37 מעלות צלזיוס.
2. השתמש באורגניזמים שגודל בצלחת לחסן 5 מ"ל תרבויות נוזלית של מרק עירוי לב המוח (BHI) בתוספת תמצית שמרים (0.5%), hemin (10 מיקרוגרם / מ"ל), וmenadione (1 מיקרוגרם / מ"ל). בעקבות O צמיחה / N, להעביר 5 מ"ל התרבויות ל45 מ"ל של BHI.
3. דגירה 50 מ"ל תרבויות נוזליים אנאירובי לadditional18 - 24 שעות וקציר באמצע לשלב יומן מאוחר. טוהר הערה של התרבות תמיד צריך להיות מאומת על ידי כתם גרם לפני החדרת חיידקים לתוך בעלי חיים.
4. לקצור את החיידקים על ידי צנטריפוגה ב7,000 XG עבור 10 דקות. לשאוב supernatant וביסודיות resuspend גלולה תא החיידק ב5 מ"ל PBS באמצעות pipet סרולוגיות. הוספה נוספת45 מ"ל של PBS ו צנטריפוגות ב 7,000 XG עבור 10 דקות. חזור על פעולה זו פעמיים עבור הסכום כולל של שלושה שוטף.
5. לאחר השטיפה האחרונה, resuspend התא גלולה ב PBS כך שדילול 1:10 של התרבות יש צפיפות אופטית של 1.0 ב660 ננומטר (OD ₆₆₀ של 1 הוא שווה ערך ל -10 ⁹ CFU / ml). לשקול את מספיק תאית carboxymethyl (viscocity הבינוני) כדי להשיג / פתרון 2% v w (למשל, 0.1 גרם לכל 5 מ"ל של תרבות). לאט לאט להוסיף תאית carboxymethyl להשעית החיידקים תוך vortexing על מנת למנוע התקבצות.

.2 שבעל פה זיהום

הערה: כפי שמודגם באיור 1, תוך שימוש במודל המתאים העכבר ומשטר זיהום אוראלי, פ gingivalis גורם לדלקת כרונית וimmunopathology ב( חלל פה) מקומי ואתרים מערכתיים (עורקים).

1. לנהל sulfamethoxazole (0.87 מ"ג / מ"ל) וסרימתופרים (0.17 מ"ג / מ"ל) (Sulfatrim) לשש עד 8-WK-oעכברי זכרי ld כרצונך מודעה במי השתייה שלהם במשך 2 שבועות כדי להפחית את הצמחייה הרגילה. שמור את הפתרון האנטיביוטי בבקבוקי זכוכית בצבע ענבר ולהגן עליו מפני אור כדי למנוע השפלה.
2. כדי למנוע שקיעה של פתרון האנטיביוטיקה, לנער את הבקבוקים פעם או פעמיים ביום (כלומר, בבוקר ואחר הצהריים מאוחרים). החלף עם פתרון מוכן טרי כל 3 - 5 ימים.
3. אחרי שבועיים, להחליף את הפתרון לאנטיביוטיקה במי שתייה רגילים. לאפשר תקופת מנוחת אנטיביוטיקה 2 ימים לפני ההדבקה דרך הפה.
4. טען את פ gingivalis השעיה / רכב לתוך מזרק טוברקולין 1 מ"ל עם מחט האכלה המצורפת. ידני לרסן את העכבר על ידי גרירה העורף בעורפם. להבטיח האחיזה איתנה מספיק כדי להגביל את הניידות של ראשו של העכבר.
5. להדביק עכברים על ידי יישום מקומי של פ gingivalis על פני השטח buccal של maxillae. מקם את tha כגון מחט ההאכלהt מיושר עם משטח buccal של שיניים טוחנות לסת תקין ולהוציא 50 ul של השעיה חיידקים. לפזר את הפתרון בעדינות לאורך חניכיימיים דקות 1 באמצעות הכדור של מחט ההאכלה.
6. אפשר העכבר כדי לנוח לתקופה של 30 שניות עד 1 דקות לפני חזרה את ההליך בלסת העליונה השמאלית. עכברי בקרה מקבלים טיפול מקדים האנטיביוטיקה וgavage האוראלי עם רכב לבד (2% מתיל צלולוזה carboxy PBS).
7. כדי לבחון דלקת כרונית הנגרם על ידי פתוגן באתרים מקומיים הנגרמים אובדן עצם מכתשי על ידי הדבקה של עכברים 3 פעמים במרווחי 2 ימים. להקריב את העכברים 6 שבועות מאוחר יותר להערכת אובדן עצם על ידי microCT.
8. כדי לבחון דלקת כרונית הנגרם על ידי פתוגן באתרים מקומיים ומערכתיים, להדביק טרשת עורקים נוטה ApoE ^{- / -} עכברים 5 פעמים בשבוע למשך 3 שבועות.
   הערה: התקדמות של מחלה בעורק innominate מנוטרת על ידי MRI הסידורי in vivo. עכברי תמונה בנקודות זמן שונים ולהקריב 6-16 Wks מאוחרr. בעת ההקרבה, להעריך נטל טרשתי הגלובלי על ידי en פנים ניתוח ולקבוע אובדן עצם מכתשי על ידי microCT. לאפיין נגעים טרשתיים בהיסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה.

.3 מיקרו טומוגרפיה ממוחשב (microCT)

1. הכנת דגימה
   1. להקריב את עכברים שבלאחר זיהום נקודת זמן הרצוי. להרדים עכברים על ידי CO ₂ asphyxation או בדרך אחרת שאושרה על ידי מתקן בעלי החיים של המוסד.
      הערה: איסוף דם על ידי לנקב לב, סרום נפרד, וחנות ב-80 ° C לניתוח של אנטי P.gingivalis IgG כפי שתואר במקום אחר ^9.
   2. השתמש בזוג מספריים גדול עריפת ראש לחמור ראש העכבר בבסיס הגולגולת. הסר את הבשר עם זוג המלקחיים ומניח את הגולגולת לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל המכיל 30 מ"ל של 4% paraformaldehyde שנאגרו. לתקן את הדגימה ל24 - 48 שעות על 4 מעלות צלזיוס.
   3. בעקבות קיבעון, rinsדואר הדגימה ביסודיות עם PBS.
   4. צור ביופסיות בלוק לסת.
   5. אחסן את hemi-הלסת עליונה בEtOH 70% כיתה היסטולוגית על 4 מעלות צלזיוס עד הערכה על ידי microCT.
2. רכישת תמונה
   1. לבצע רכישות תמונה באמצעות סורק microCT שולחן העבודה. הגדר את מקור רנטגן לנוכחי של 114 מייקרו-אמפר ומתח של 70 ק. לטעון hemi-maxillae פרט לכלי ההדמיה וסריקה ברזולוציה של 12 מיקרומטר בכל שלושת הממדים מרחביים.
      הערה: טעינה כמה חמי-maxillae בו זמנית בתוך כלי ההדמיה.
   2. לבצע סריקה ברזולוציה נמוכה ראשונית המאפשרת למשתמש לשרטט את הגבולות לרכישת תמונה ולהגביל את הסריקה לאזור של העניין (ROI) באמצעות מערכת.
      הערה: עוצמת האמייל הופכת את הכתר של שיניים טוחנות לסת להבחין בקלות. שימוש בטוחנות כמדריך באופן רופף להגדיר את גבולות ההדמיה להקיף שלוש שיניים טוחנות ובון מכתשי מסביבדואר. פונקציה זו משמשת גם להבחין בין hemi-maxillae הבודד בעת סריקת דגימות מרובות בתוך אותו הכלי.
   3. כאשר הסריקה הושלמה, להמיר קבצי תמונת הגלם (.ISQ) לdicoms באיכות גבוהה (.DCM).
3. ניתוח תמונה
   בפרוטוקול זה, ניתוח תמונה מתבצע באמצעות הדמיה נתונים, עיבוד, ותוכנת ניתוח. ראשית, להשתמש בציוני דרך מורפולוגיים ליצור מטוס בכושר הטוב ביותר לצומת cementoenamel (CEJ). לאחר מכן השתמשתי בלהפוך את hemi-הלסת העליונה לכיוון סטנדרטי למדידה עוקבת של מכתשי עצם נפח.
   1. פתח את התוכנה ולחץ על סמל "להרחיב נתונים" הממוקם בפינה השמאלית העליונה של הבריכה. לחלופין, להשתמש בקובץ> פתיחת נתונים.
   2. בחר את ערימת תמונת DICOM ולחץ על טעינה. חלון DICOM Loader מופיע. לחץ על אישור.
   3. שים לב לנתונים שנקבעו כסמל ירוק בבריכה. שימו לב שהלחיצה על אובייקט נתונים גורמת נוספת, אבלטון שיוצג באזור הכפתור בחלק העליון של הבריכה. בחירת הסמל גורמת גם לקצת מידע על שיא נתונים שיוצג בשטח נכסים.
   4. כל סמל בברכה מספק תפריט קופץ שממנו ניתן לבחור מודולים שונים. הפעל את התפריט הקופץ על ידי לחיצה על החץ הלבן בפינה הימנית של סמל נתונים. תחת מודול התצוגה, בחר Isosurface (תצוגה> Isosurface). Isosurface האייקון יופיע באזור הבריכה. כאשר נבחרו, הגדרות נוספות מופיעות בשטח נכסים.
   5. הגדר את סגנון ציור של לשקוף והסף ל2,000. כפתורים ודא compactify וdownsample נבחרים תחת אפשרויות. תחת ממוצע, להבטיח x, y, z וכולם מוגדרים .2 לחץ על Apply על מנת ליצור את isosurface.
      הערה: שים לב לשחזור 3D שקוף של hemi-הלסת עליונה במציג 3D. היתרון של שימוש שקוף תיקו סגנון לשחזור תמונה הוא שהשורשים של השיניים הטוחנות יכולניתן לזהות בקלות. זה יהיה חשוב כאשר לשים את הדגימה לתוך אורינטציה סטנדרטית.
   6. בחר את סמל הנתונים הירוק ובשטח נכסים בחר את סמל היבול. שים לב חלון המציג את הממדים וקואורדינטות של נתונים. להגדיר את זה בצד לעת עתה. שים לב שתיבה תוחמת מופיעה בתצוגה 3D עם כרטיסיות ירוקות בכל פינה.
   7. בחר בלחצן הדדית בסרגל הכלים של המציג. לשנות את הגודל של התיבה התוחמת על ידי לחיצה וגרירה בפינות הירוקות. ודא שהתיבה שמקיפה את האזור של העניין (ROI) ומבטלת כמה שיותר שטח ופסולת מתים ככל האפשר. זה יקטין את הביקוש חישובית במחשב.
   8. השתמש בכפתור Trackball בסרגל הכלים הצופה כדי לסובב את האובייקט בתוך הצופה 3D להבטיח את ההחזר על השקעתו מוקפת לחלוטין על ידי התיבה התוחמת. כאשר מרוצה, לחץ על אישור בחלון היבול להפריש בשלב 8.
   9. בחר את סמל הנתונים ותחת מודול התצוגה לבחור אלכסוני Slice (OBS). (תצוגה> OBS)
   10. בחר את OBS. באזור המאפיינים, להגדיר את סוג המיפוי ליניארי, טווח חלון נתונים מ-200 ל10,000, ודגימה למיטב. עכשיו לסובב בחר תחת אפשרויות. שים לב לעבור סיבוב במרכז OBS.
   11. בחר בלחצן האינטראקציה בסרגל הכלים של המציג ולהשתמש בידיות של לעבור כדי להתאים את מטוס החיתוך של הפרוסה. צור מישור הסגיטלי שפועל במקביל לשורשי השיניים ובניצב לפני שטח occlusal של השיניים. המטוס צריך לחצות שלוש שיניים טוחנות (M1-M3), כפי שמודגם באיור 2.
   12. כבה את הסיבוב ולשכפל את OBS (אובייקט> אובייקט כפול). OBS חדש מופיע בשם OBS .2 הפעל סיבוב לOBS 2.
   13. השתמש בידית הסיבוב לארגון מחדש של OBS 2 כך שיהיה ניצב עם OBS 1 (ראה איור 2).
   14. התור לסובב את לOBS 2 וליצור 3 פרוסות כפולות. אלה יהיו שם 3 OBS, 4, ו -5.
4. בחירת נקודות עבור המטוס של Best Fit
   הערה: שלבי 3.4.1-3.4.5 לתאר את המיקום של 8 נקודות לאורך CEJ יוצר מטוס בכושר הטוב ביותר. בחר ארבע נקודות מפרוסות sagittal וארבעה אחרים מפרוסות העטרה (ראה איור 3). כאשר בוחרים נקודות ממוקמות על פרוסות sagittal ב3.4.6, ייתכן שיהיה צורך להתאים 1 OBS.
   1. יישר 1 OBS עם מרכז שורש mesial ביותר של M1 במישור הסגיטלי. יישר OBS 2 עם מרכז שורש mesial ביותר של M1 במטוס העטרה.
   2. יישר OBS 3 עם מרכז שורש הבוק-הדיסטלי של M1 במטוס העטרה. במידת צורך, להתאים 1 OBS כך שהוא מתמקד בערך עם שורש הבוק-הדיסטלי של M1 במטוס saggital בעת בחירת נקודות בשלב 20.
   3. יישר 4 OBS עם מזלוג של שורשי buccal של M2. 4 OBS צריך להיות מרוכז בין שורשי הבוק-mesial והבוק-הדיסטלי של M2. במידת צורך, להתאים את השנינות 1 OBS כך שהוא מרוכז כh שורש הבוק-הדיסטלי של M2 במישור הסגיטלי בעת בחירת נקודות בשלב 20
   4. התאם OBS 5, כך שהוא רץ במורד מרכז M3 במישור העטרה. במידת צורך, להתאים 1 OBS כך שהוא מתמקד בערך עם השורש הדיסטלי ביותר של M3 במישור הסגיטלי בעת בחירת נקודות בשלב 20.
   5. לשכפל כל אחד מOBSs (6 OBS) ובחר לנכון נקודות בחלון המאפיינים. נכון נקודות לעבור מאפשר לחוקר לבחור 3 נקודות או יותר על 2D או 3D אובייקטים בתוך הצופה ולאחר מכן מחשב את המטוס בכושר הטוב ביותר. במקרה זה, OBSs 2D שתואר בשלבים הקודמים משמש לבחירה 8 נקודות לאורך CEJ.
   6. הסתר 6 OBS מצופת 3D על ידי לחיצה על התיבה הכתומה בפינה הימנית של סמל נתונים. הסתר isosurface מצופת 3D כדי להפוך את CEJ גלוי על כל פרוסות 2D. Shift-לחץ ובחרו את נקודות 8 לאורך CEJ כפי שתואר לעיל.
      הערה: אם מקש Shift אינו מוחזק למטה בעת הבחירהנקודות, מטוס באופן אוטומטי מחושבת לאחר שלוש הנקודות הראשונות.
   7. לאחר בחירת כל 8 נקודות, להפוך את OBS 6 גלוי. שים לב שזה פרוס צירי הפועל כ מקביל את מטוס occlusal.
5. שינוי והארגון מחדש הערה: המטוס בכושר הטוב ביותר משמשת להעברת נתונים לכיוון סטנדרטי למדידות נפח שלאחר מכן.
   1. לחץ נתונים אייקון> מחשוב> ApplyTransform. סמל ApplyTransform מופיע באזור הבריכה. לחץ על הריבוע הלבן בפינה של סמל ApplyTransform, התייחסות בחר, ולחץ על OBS 6.
   2. בשטח נכסים, רמה בחר לשיטת אינטרפולציה והוארכה למצב. החל השינוי.
   3. צור isosurface וOBS העטרה לקובץ נתונים החדש. סובב את OBS בכיוון הצירי כך שזה כ בניצב עם M1 (שמוצג באיור 2). השתמש בcusps של טוחנת וג occlusalurvatures כמדריך.
   4. השתמש במטוס הזה כדי להפוך את הנתונים כמו בשלבי 3.5.1 ו3.5.2. שמור את קובץ הנתונים הפך.
6. מדידת פילוח ונפח העצם
   הערה: השלבים הבאים מתארים את הפילוח ומדידה של עצם מכתשי. הפרוסה המקבילה למישור של ההתאמה הטובה ביותר עבור CEJ מזוהה ומטוס התייחסות נבחר. עצם מכתשי בין CEJ ומטוס ההתייחסות על הפנים הלחי של השיניים הטוחנות הוא מפולח ונמדד. שורש mesial ביותר של M1 והשורש הדיסטלי ביותר של M3 לשרת ציוני דרך נקודת סיום כ. הגדרת מטוס התייחסות 15-20 פרוסות מתחת לCEJ מניבה תוצאות אופטימליות. הכללה של פרוסות נוספות מציגה השתנות שמסכות הבדלים בנפח עצם בקרב קבוצות טיפול.
   1. פתח את עורך פילוח וליצור תווית חדשה לנתונים הפכו.
   2. ליצור חומר חדש בשם עצם מכתשי.
   3. מתחת לחלון זום ונתונים, קבע את הנתונים נעים הלוך ושובמ '-200 ל10,000.
   4. תחת תצוגה ומיסוך לבחור 2D הכוונת, 3D MPR, וסמלי נפח טיוח 3D. הגדר את טווח הנתונים מ2,500 ל8,000. אפשר מיסוך נתונים.
   5. בחר את תצוגת ארבעה צופים הגדרה מסרגל הכלים הצופה. התצוגה מחולקת לארבעה רבעים המאפשרים בחינה בו זמנית של saggital, וערימות העטרה, תמונה צירית, כמו גם שניתנו 3D הנפח.
   6. השתמש בכל ארבעת הרביעים לזהות את הפרוסה האחרונה שבו האמייל גלוי על פניהם buccal של M1 ו M3. מיקום זה מתאים למטוס בכושר הטוב ביותר עבור CEJ. רשום את מספר פרוסה הצירי.
   7. במישור הצירי, ימשיך 15-20 פרוסות כלפי רכס עצם מכתשי. זה מייצג את מטוס ההתייחסות.
   8. להשתמש בכל שילוב של כלים פילוח כדי לבחור עצם מכתשי על פני הלחי של השיניים הטוחנות בין CEJ ומטוס ההתייחסות. השתמש בשורש mesial ביותר של M1 והשורש הדיסטלי ביותר של M3 כציוני דרך של נקודות קצה.
   9. כאשר מרוצים, להוסיף את הבחירה למכתשי עצם תחת רשימת חומרים.
   10. לחזור לבריכת האובייקט. סמל חדש עם הסיומת ".Labels" יש לצרף לסמל נתוני תמונה. בחר בסמל התוויות ובתפריט הנפתח בחר חומרים> MaterialStatistics.
   11. באזור המאפיינים, בחר חומר ופגע להחיל. שולחן מופיע בו מוצגות מספר פרמטרים עבור כל חומר ברשימת החומרים. רשום את הנפח של מכתשי עצם.

.4 הערכה של טרשת עורקים

1. אב העורקים Dissection
   1. להקריב את העכבר על ידי CO ₂ מחנק בזיהום שלאחר נקודת זמן הרצויה.
   2. מניחים את העכבר בצד הגב, הקלטת מטה ולנגב עכבר עם EtOH 70%. חותך את העור בצד הגחון מאמצע הבטן רק כדי מעל לתהליך xyphoid.
   3. חותך את עור הבטן עד שתהליך xyphoid גלוי. הרם את תהליך xyphoid עם הרשות הפלסטינית קטנהir מלקחיים, לבצע חתכים בכל צד של כלוב הצלעות, ולחתוך את הסרעפת. ואז לעשות שני חתכים את שני הצדדים של כלוב הצלעות כדי לחשוף את הלב.
   4. Exsanguinate העכבר באמצעות מזרק אינסולין 27 G ממוקם לתוך שיאו של החדר ממני. במהלך איסוף דם, מעת לעת לסובב את המחט על מנת למנוע חסימה של הפתיחה על ידי הקיר של החדר. בדרך כלל, 0.8 - ניתן להשיג 1 מ"ל של דם בשיטה זו.
   5. sup> הערה: סרום נפרד ולאחסן ב -80 ° C לניתוח של אנטי P.gingivalis IgG כפי שתואר במקום אחר ⁹
   6. השתמש במספריים כדי להסיר את העלייה הימנית.
   7. אתר את החדר השמאלי בצד האחורי של הלב. להציג את מחט G 21 לשיא של החדר השמאלי, עם השיפוע של המחט מול מרכז החדר ולשטוף לאט מערכת הדם עם 3 - 5 מ"ל של מקבע רקמה.
   8. שומן לקצץ והתימוס המקיף את הלב.
   9. הסר את luמהה.
   10. אתר את קשת אב העורקים עם שלושה סניפים ולנקות את שכבות שומן שמסביב לחשיפה טובה יותר.
   11. המשך לנתיחה של אב העורקים מהקשת לבסיס של הסרעפת.
   12. הסר את הכבד ולעקור רקמת מעי לחשוף את אב העורקים היורדים. לנתח את אב העורקים דיסטלי עד לסניפי עורק הכליה.
   13. חותך את עורקי הכליות ולהמשיך את הנתיחה עד להסתעפות ileal.
   14. ברגע שהאב העורקים הוא חופשי מרוב רקמות חיבור, לחזור לחלק העליון של אב העורקים ולגזור את חלקו העליון של שלושה מסתעף מאב העורקים מעל ללב.
   15. לב קליפה כלפי מעלה, לגזום רקמות שומן שבבסיס על מנת להפריד לב מהגוף.
   16. החזק את הלב עם מלקחיים ולמשוך כלפי מעלה, חיתוך רקמת חיבור שעלול עדיין להיות מחוברת, וממשיך עד לכליות ומעקב עד לרגליים ולגזור בנקודה הנמוכה ביותר האפשרית.
   17. תקן את אב העורקים ב10% פורמלין עבור שעה 1 עם subsequent PBS לשטוף עבור 1 שעות. לחלופין, אב העורקים חנות ב10% פורמלין O / N, לשטוף בPBS היום הבא ולהמשיך בנתיחה.
   18. אב העורקים מקום לתוך צלחת פטרי 10 סנטימטר המכילה PBS.
   19. שימוש בהיקף לנתח, להסיר בזהירות רקמת adventitial מאב העורקים.
   20. כאשר אב העורקים הוא ללא שומן ורקמה עודפים, נותק שני שליש תחתון של לב. מתחיל לקלף שריר לב משם בסוף ההפך הלב של קשת אב העורקים. הנורה של אב העורקים אמורה להופיע לאט, שתהיה לבן בצבע.
   21. המשך לנתיחה זהירה תוך שימוש בשני מלקחיים עד נורות אב העורקים חופשיות של רקמת שריר לב.
   22. הנח אב העורקים ניקו לתוך מגש לנתח שחור ולכסות עם PBS.
2. מצמיד של אב עורקים
   1. שמור אב העורקים המכוסים בPBS ברחבי מצמיד.
   2. הנח אב העורקים במצב האנטומי עם נורות של אב העורקים בצד שמאל.
   3. הנח סיכות minutien זמניות ב5 מקומות החל משעת 1) החלק עליון של אב העורקים, 2) להלן שלישיסניף של קשת, 3) באמצע הדרך של ירידת אב העורקים 4) ליד קצה תחתון של אב העורקים יורדים 5) מעל הסניף של עורק הירך.
   4. בעזרת מספריים אביב קנס נוספים, לחתוך את הצד השמאלי של אב העורקים, החל משעת הסניף השמאלי של עורק הירך כל הדרך עד לאב עורקים לסניף מתחת הנמוך ביותר של האאורטה עולה.
   5. לחתוך מהצד שמאלה של הנורה אב העורקים הנמוכה ביותר בנקיק ולהמשיך לחתוך להגיע צומת של חתך לאורך חתך אנכי של אב העורקים.
   6. חוצה אב העורקים אופקי כדי להגיע לנקודה של הענף הנמוך ביותר של האאורטה עולה
   7. לחתוך כלפי מעלה בצד ימין לסניף מעל הגבוה ביותר של אב העורקים.
   8. חותך כל סניף לחשוף המשטח הפנימי שלה.
   9. להסיר חלק מסיכות זמניות ולהחליף עם סיכות קבועות עם מטרה של מצמיד את כל אב העורקים במיקום האנטומי ללא קיפול, מתיחה של אב העורקים. מטרה היא לחשוף את פני השטח פנימיים של אב העורקים.
   10. המשך תולה עד שכל פני השטח הפנימיים של אב העורקים חשופים וגלויים לעין מלמעלה באופן ברור וללא int החזותיerference מפינים.
3. שומנים בדם מכתים ונגע כימות
   1. הכן פתרון מכתים סודאן IV (5 מ"ג / מ"ל ​​בisopropanol 70%). מערבבים היטב ולסנן כדי להבטיח שאין גבישים נמצאים.
   2. אב העורקים כיסוי תלו בפתרון IV סודן ל50 דקות.
   3. לשטוף עם isopropanol% 70 ל1 - 5 דקות. לשטוף בעדינות אב העורקים עם ddH20 עד שהמים מגיעים מאב העורקים הוא כבר לא אדומים.
   4. כסה אב העורקים עם PBS. צלמו תמונות של אב העורקים עם מצלמה ברזולוציה גבוהה שמחוברת למיקרוסקופ לנתח ולשמור קבצים דיגיטליים כתמונה (.TIFF). הנח שליט ליד כל תמונה על מנת לסייע בכיול.
   5. השתמש בתוכנת ImageJ כדי לקבוע את האזור של אינטימה והשטח של נגעים. ידני לעקוב אחר פני השטח אינטימה לקבוע אזור. אזור נגע יכול להיות מחושב באמצעות thresholding צבע האוטומטי. זה דורש קביעת סף להגדרת עוצמת צבע שמפלה נגעים מאזורים רגילים.
   6. חישוב אחוזימשטח אינטימה מכוסה על ידי טרשת עורקים.

.5 היסטולוגית הערכה של טרשת עורקים

1. למסוק קשת אב העורקים עם רקמת לב ולטבול ב אוקטובר בעובש בסיס חד פעמי.
2. לאסוף 5 מיקרומטר cryosections סדרתי כל 50 מיקרומטר בעורק סינוס וinnominate אב העורקים באמצעות cryostat להגדיר ב-17 ° C ו הר בסעיפי הרקמות על שקופיות מיקרוסקופ. חנות מחליקה ב-20 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
3. להערכה היסטולוגית, כתם עם hematoxylin & eosin באמצעות הנהלים המתאימים.

.6 אימונוהיסטוכימיים אפיון של טרשת עורקים.

השלבים הבאים מתאר פרוטוקול מבוסס נוגדנים כללי מועסק באופן שיגרתי כדי להעריך נגעים טרשתיים בפ gingivalis -infected עכברים. פרוטוקול זה דורש אופטימיזציה לכל נוגדן או מגיב.

1. הסר שקופיות מהמקפיא ולתקןלמשך 2 דקות במקבע קר כקרח (אצטון או מקבע אחרים).
2. לאפשר שקופיות לבוא לRT ולתייג עם עט עמיד ממס.
3. יש לשטוף את שקופיות 3x בPBS להסיר מטריצת הקפאת הרקמות
4. לחסום את פעילות peroxidase אנדוגני על ידי דוגרים השקופיות בH 0.3% ₂ O ₂ פתרון בPBS עבור 10 דקות.
5. יש לשטוף את שקופיות 3x ב PBS למשך 2 דקות בכל פעם.
6. לחסום הלא ספציפי מחייב על ידי דוגרים בחסימת המאגר (10% בסרום ארנבת PBS) למשך 30 דקות ב RT.
7. לדלל את הנוגדן הראשוני 01:50 ב10% בסרום ארנבת.
8. החל הנוגדן המדולל לקטעי הרקמה בשקופית.
9. דגירה עבור שעה 1 ב RT.
10. יש לשטוף את שקופיות 3x ב PBS עבור 2 דקות כל אחד.
11. לדלל אנטי עכברוש biotinylated נוגדנים משני 1: 100 ב10% בסרום ארנבת.
12. אחול על סעיפי רקמות בשקופית ודגירת 30 דקות ב RT.
13. יש לשטוף את שקופיות 3x ב PBS עבור 2 דקות כל אחד.
14. הכן פתרון מצע DAB על ידי הוספה1 טיפה של chromogen DAB לכל חיץ DAB 1 מ"ל.
15. מסננים PBS מהמגלשות וליישם את פתרון מצע DAB. לאפשר שקופיות לדגירה של 5 דקות או עד שתגיע לעוצמת הצבע הרצויה.
16. 3x לשטוף במים למשך 2 דקות כל אחד.
17. כתם דלפק עם hematoxylin.
18. ליבש באמצעות 4 שינויים של אלכוהול (95% 1 דקות, 95% 1 דקות, 100% 1 דקות ו100 דקות% 5).
19. ברור ב3 שינויים של קסילן.
20. Coverslip באמצעות פתרון הרכבה ולנתח באופן איכותי על ידי מיקרוסקופ. לניתוח כמותי, לרכוש תמונות ולחשב שטח צביעה עם ImageJ באמצעות סף אוטומטי.

.7 MRI

1. הכנת בעלי החיים לבדיקת MRI
   1. להרדים את העכברים לפני ניסויי MRI. לבצע אינדוקציה הראשונית של הרדמה באמצעות 4% isofluorane אדים ל2-3 דק 'בחדר אינדוקציה. לשמור על ההרדמה במהלך תקופת ההדמיה באמצעות זרימה רציפה של 0.5 - 2% מתאדים delivere isofluoraneד באמצעות התקנת חרטומו או מסכה.
   2. לאחר שהגיע המטוס של הרדמה כירורגית (כלומר, אין תגובת קמצוץ הבוהן), הנח את העכבר לבעל חיים עם האף שלה מוכנס לתוך חרטומו. ישנם מספר סוגים של מחזיקי בעלי חיים זמינים באופן מסחרי, שניתן להשתמש כדי למזער את התנועה פוטנציאלית במהלך הדמיה. אנו משתמשים במחזיק מעוצב בהתאמה אישית עם בר ביס.
   3. צג נשימה ומחזור לב ולסנכרן עם רכישת תמונה באמצעות כרית נשימה (דגש על הבטן של העכבר) מצוידים במערכת ניטור בעלי החיים וgating קטנה.
   4. אבטח את מערכת ניטור העכבר ועל בעל החיים עם סרט מעבדה.
2. רכישת נתונים MRI
   1. הנח את בעל חיים עם ראשו של העכבר הראשון במצב שכיבה לבדיקה אנכית 30 מ"מ (מיקרו 2.5) נשמרים ב23 ° C ולתוך האנכי נשא 11.7 סורק T MRI.
   2. יישר את בעל עם מרכז tהוא RF סליל.
   3. לנהל תהליך shimming באמצעות רצף דופק יחיד.
   4. תוך שימוש ברצף נדיר, לרכוש תמונות הסקאוט לאורך שלוש אוריינטציות המאונכות כדי ליצור תמונות ציריות, העטרה, וsagittal.
   5. לבצע אנגיוגרפיה ברזולוציה נמוכה תהודה מגנטית (MRA) באמצעות רצף הד שיפוע 3D ungated עם הפרמטרים הבאים: עובי לוח = 1.5 סנטימטר; זווית להעיף = 45 °; זמן החזרה = 20 ms; זמן הד = 2.2 ms; שדה ראיה = 1.5 × 1.5 × 1.5 סנטימטר; מטריצה ​​= 64 × 64 × 64; מספר זמן סריקה סה"כ = 1 ממוצע: 2~3 דקות. מטרת סריקה זו היא להבטיח כי תמונות שנרכשו באזור היעד (עורק innominate).
   6. לבצע ברזולוציה גבוהה MRA של עורק innominate עם רצף הד שיפוע 3D ungated באמצעות הפרמטרים הבאים: עובי לוח = 1.5 סנטימטר; זווית להעיף = 45 °; זמן החזרה = 20 ms; זמן הד = 2.2 ms; שדה ראיה = 1.5 × 1.5 × 1.5 סנטימטר; מטריצה ​​= 128 &215 #; 128 × 128; מספר זמן סריקה סה"כ = 4 הממוצע היה ~25 דקות.
   7. להשיג תמונות ציריות רציפות של 0.5mm עורק innominate מתחת להסתעפות subclavian.
3. ניתוח נתוני MRI
   1. לבצע שחזור תמונה וניתוח באמצעות תוכנת הדמיה קשורה לסורק. להשיג את שחזור 3D של תמונות MRA על ידי הקרנת עוצמה מקסימלית.
   2. השתמש בהסתעפות subclavian כסמן אנטומיים כדי ליישר נתונים שנרכשו מעכברים שונים או את אותו העכבר בנקודות זמן שונה. בחר חתך היעד של עורק innominate ב0.3- למרחק 0.5 מ"מ מתחת לsubclavianbifurcation.
   3. להגדיר ולחשב שטח luminal של החתך נבחר עם ImageJ. יש לבצע מדידות בצורה עיוורה על ידי שני משקיפים עצמאיים. ודא שחזור מדידה על ידי חישוב מקדמי מתאם interclass.
   4. עבור מחקרים ארוכי טווח עם מתאר לעצמי סידוריing, לנרמל אזור luminal לאזור לומן הושג בתחילת המחקר (הפחית הראשונה במחקר) לכל עכבר. לבטא אותן התוצאות כמו שינוי בשטח luminal לאורך זמן.
   5. לבצע ניתוחים סטטיסטיים המתאימים (כלומר, מבחן t סטודנט) כדי לקבוע הבדלים משמעותיים בין קבוצות ניסוי.

תוצאות

שימוש במודל המתאים העכבר ומשטר זיהום אוראלי, פ gingivalis גורם לדלקת כרונית וimmunopathology ב( חלל פה) מקומי ואתרים מערכתיים (עורקים) (איור 1).

בעכברים, זיהום אוראלי עם פ gingivalis גורם תגובה דלקתית מקומית שמניעה את ההרס של שן תמיכה עצם מכתשי ^8. פ gingivalis -infected עכברים לפתח תגובת נוגדנים בסרום לאורגניזם זה שהם בעיקר של אלוטיפ IgG ^9. תוצאות ...

דיון

פ מודל זיהום אוראלי gingivalis מספק כלי רב ערך ללימוד של דלקת כרונית הנגרם על ידי פתוגן באתרים מקומיים ומערכתיים. מודל ייחודי זה מאפשר האפיון של שני המנגנונים הספציפיים המארח והפתוגן תורמים לדלקת וimmunopathology כרוניות. בנוסף, המודל יכול לשמש מסך לאסטרטגיות טיפוליות חדשניות, הכוללים חיסונים והתערבות תרופתית. הצעדים המפורטים בפרוטוקול זה מתארים את השימוש המוצלח של מתודולוגיות מודל ופירוט זה להעריך את החניכה, התקדמות, ותוצאה של פ gingivalis -induced דלקת...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Amira תוכנת אנליזה	Visualization Sciences Group
תא אנאירובי DW Scientific Model MG500	מיקרוביולוגיה בינלאומית
BHI	בקטון-דיקינסון
Hemin	סיגמא-אולדריץ'	51280-5 גרם
מנדיון (ויטמין K)	סיגמא-אולדריץ'	M5625-25G
תמצית שמרים	בקטון-דיקינסון	212750
קרבוקסימתיל צלולוז (צמיגות בינונית)	סיגמא-אולדריץ'	C-4888
סולפאמתוקסזול ותרחיף אוראלי טרימתופרים 200 מ"ג/40 מ"ג ל-5 מ"ל	היי-טק פארמקל	NDC 50383-823-16
μ CT 40	Scanco
HistoChoice קיבוע רקמות	סיגמא-אולדריץ'	H2904
סודאן IV	סיגמא-אולדריץ'	S4261-25G
ספקטרומטר אוונס 11.7T עם קדח אנכי	Bruker
Paravision	Paravision
ImageJ	NIH Rat
נגד עכבר F4/80	Serotec	MCA497R
Rat נגד עכבר TLR2	eBioscience	13-9021-80
Leica S4 היקף ניתוח	Leica
Microm HM 550 cryostat	Microm