הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

qPCR הוא שיטה רגישה ומהירה לאיתור של Cytomegaloviral DNA בקבועה פורמלין, רקמות ביופסיה מוטבעות פרפין

15.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51570

⸱

9 ביולי 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Indiana University School of Medicine, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Indiana University Health

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר זיהוי qPCR של ציטומגלווירוס ברקמת ביופסיה קבועה בפורמלין, משובצת פרפין, שהיא מהירה, רגישה, ספציפית ושימושית לפירוש דפוסי צביעה דו-משמעיים של המטוקסילין ואאוזין או אימונוהיסטוכימיה.

תקציר

זה חיוני כדי לזהות זיהום ציטומגלווירוס (CMV) במערכת העיכול (GI) בדרכי של חולי immunosuppressed, בהתחשב בסיכון גבוה יותר שלהם לפיתוח זיהום חמור. שיטות מעבדה רבות לזיהוי של זיהום CMV פותחו, כולל סרולוגיה, תרבות נגיפית, ושיטות מולקולריות. לעתים קרובות, שיטות אלו משקפות את מעורבות מערכתית עם CMV ולא באופן ספציפי לזהות מעורבות רקמות מקומית. לכן, זיהוי של זיהום CMV במערכת העיכול הוא לעתים קרובות נעשה על ידי היסטולוגיה המסורתית של רקמת ביופסיה. מכתים Hematoxylin ו eosin (H & E) בשיתוף עם אימונוהיסטוכימיה (IHC) נשאר מעמודי התווך של בדיקת ביופסיה אלה. H & E וIHC לפעמים לגרום לדפוסי מכתים לא טיפוסיים (דו משמעיים), מה שהופך את הפרשנות קשה. זה היה הראה כי תגובת שרשרת של פולימראז כמותית (qPCR) לCMV יכולה להתבצע בהצלחה על, רקמת ביופסיה (FFPE) מוטבע פרפין קבוע פורמלין למאודרגישות גבוהה וספציפיות. המטרה של פרוטוקול זה היא להדגים כיצד לבצע בדיקות qPCR לגילוי CMV ברקמת הביופסיה FFPE במעבדת הגדרה קלינית. שיטה זו עשויה להיות יתרון גדול עבור חולים במקרים של כתמים חד משמעיים לCMV בביופסיות במערכת העיכול.

מבוא

הפרשנות של זיהום ציטומגלווירוס (CMV) בדגימות קליניות חשובה באופן קריטי. CMV הוא חבר בתת משפחת betaherpesvirinae של הרפס. דומה להרפס אחר, יש CMV היכולת להקים זיהום מתמשך או סמוי מאופיינת בחוסר השכפול נגיפי פעיל 1. הפעלה מחדש של נגיף עלולה להתרחש בזמנים של לחץ או דיכוי חיסוני אחר, מה שמוביל לשכפול נגיפי פעיל מאופיין בשחרור virion, אשר עשוי להיות מלווה בגילויי מחלה 2-4. במערכת העיכול (GI) תסמיני המחלה CMV בתדירות גבוהה כוללים כאבי בטן ו / או צואה דמה 1.

האבחנה של גסטרואנטריטיס CMV ידי היסטולוגיה מנצלת hematoxylin ו eosin (H & E) לזהות תכלילים נגיפיים CMV. במקרים בהם חשד קליני גבוהה עדיין אין תכלילים ברורים הם נצפו, אימונוהיסטוכימיה (IHC) משמשת לעתים קרובות כשיטת בדיקה נלווית. עם זאת, IHCיכול גם להיות הקשתה על ידי דפוסים נדירים לא קלאסיים המופיעים כתמים סלולריים (דו משמעיים), מה שהופך את הפרשנות קשה (איור 2) 5. הוא ביקש להשתמש DNA שנלקח קבוע פורמלין, פרפין, מוטבע (FFPE) רקמת ביופסיה במערכת העיכול ותגובה הכמותית פולימראז שרשרת (qPCR) כדי לזהות CMV בביופסיות במערכת העיכול. טכניקה זו הוכח להיות בעל ערך בזיהוי של CMV בביופסיות במערכת העיכול, ומועילה במיוחד במקרים מכתים IHC המשמעיים 5,6. כמו כן, qPCR גם הוכח לתאם גם עם נתוני בדיקה נוספים קליניים CMV כאשר הוא זמין 6. שימוש בqPCR באיתור CMV עלול להוביל לאבחון מוקדם וטיפול במקרים בהם חשד קליני לCMV הוא גבוה, אבל H & E ו-CMV IHC הוא שליליים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

עם אישורו של דירקטוריון סקירה המוסדי, חיפוש של מסד הנתונים מעבדה האלקטרוני בוצע לזהות קבוע פורמלין, פרפין המוטבע בלוקים (FFPE) המייצגים מקרים של זיהום ציטומגלווירוס (CMV) במערכת עיכול ביופסיות (GI) שאובחנו על ידי histopathology (hematoxylin ו eosin (H & E) ו / או אימונוהיסטוכימיה (IHC)).

1. עיבוד רקמות מרקמות FFPE GI ביופסיה

  1. לאסוף בלוקים רקמת הביופסיה FFPE GI לציטומגלווירוס (CMV) תגובת שרשרת של פולימראז כמותית (qPCR). בלוקים אלה מאוחסנים בטמפרטורת חדר.
  2. צינורות microfuge 1.7 מיליליטר מראש תווית עם מספר זיהוי הייחודי של הבלוק.
  3. נעל את Handwheel microtome.
  4. סיאט גוש הרקמה לתוך מהדק הקלטת.
  5. באמצעות סכין טרי, שאינו בשימוש, ויישר את הבלוק לזווית הסכין על microtome.
  6. התאם את microtome לחתוך 10 מיקרומטר חלקים עבים.
  7. נעילת הHandwheel דואר ומראש לחסום כיוון הלהב.
  8. לחתוך 5 סעיפים של הבלוק ב10 מיקרומטר מרווחים עבים, המאפשר לכל חתך לגלגל לגלילה של רקמה. ודא כי כל מגילה מכילה ייצוג נאות של רקמות ביופסיה הרצויות.
  9. נעל את Handwheel microtome.
  10. עם מלקחיים, למקם את כל 5 המגילות של רקמה לתוך צינור צנטריפוגות מראש שכותרתו, נזהר רק לתפעל את המגילה על ידי פרפין על מנת להפחית את הפוטנציאל לזיהום לחצות. הצמד את הכובע על הצינור ומניח אותו בחזרה על המדף.
  11. להסיר את חסימת הרקמה מmicrotome.
  12. להסיר ולסלק את הלהב.
  13. לטהר כל משטחים או מכשירים שייתכן שבאים במגע עם הרקמה הקודמת.
  14. הנח להב טרי, שאינו בשימוש לתוך מחזיק הסכין.
  15. חזור על שלבים 1.4-1.14 עבור כל בלוק נוסף לעיבוד. צינורות microfuge המכילים את מגילות הרקמה עשויים להיות מאוחסנים בטמפרטורת חדר עד timדואר של מיצוי DNA.

2. מיצוי DNA ממגילות של רקמות FFPE GI ביופסיה

הערה: פרוטוקול זה מותאם מהעלון של ערכת FFPE רקמת DNA חילוץ (זהירות: מתייחס לגיליון בטיחות חומרים (MSDS)).

  1. הוספת קסילן 1 מיליליטר (זהירות: עיין MSDS) לכל דגימת צינור microfuge. סגור את המכסה והמערבולת במרץ ל10 שניות.
  2. להמשיך במיצוי DNA באופן ספציפי שתואר בעלון המוצר של היצרן בשינויים הבאים.
  3. להוסיף ראשון 6 μl של הבקרה הפנימית (IC) על צינור אחד microfuge.
    1. לאחר הדגירה ATL / proteinase K תמוגה ב56 מעלות צלזיוס במשך שעה 1, לדגור על 99 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, ולא 90 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
    2. במהלך שלב elution DNA הסופי, לפתוח בזהירות את המכסה של עמודת טיהור DNA ולהחיל 50 μl DNAse / מים RNase ללא מזוקקים במרכזו של הקרום, ולא buffer-ATE.
      הערה: עיין בעלון לאחסון וההכנה של חומרים כימיים המתאימים. ה-DNA צריכה להיות מופק מכל 5 מגילות FFPE. לבצע את כל שלבי צנטריפוגה בטמפרטורת חדר (15-25 ° C).

3. QPCR לCMV

  1. תגובת שרשרת פולימרז נוהל (PCR)
    1. ליצור גיליון עבודה של Excel PCR לטווח assay CMV. גיליון עבודה של Excel זו מחשבת את הסכום הכולל של כל אחד מגיב הדרוש כדי להפוך את תערובת ההורים עם Mg. זה מכפיל את הכמות של כל אחד מגיב זקוקה לדגימה (מפורט בהמשך) פעמים מספר הדגימות והבקרה ועוד אחד (כדי לפצות על אובדן בשל pipetting).
      1. כוללים את ריאגנטים הבאים בכל תגובת PCR בסכום שצוינו:
        מגיב0; הסכום לדוגמה
        12.5 μl בקבוקון תערובת ההורים LC-CMV
        2.5 μl בקבוקון הצהוב פתרון מ"ג
        נפח כולל 15.0 μl
    2. לכלול בכל assay, המנוהל על מים או אין שליטת יעד (NTC), ביקורת שלילית, ביקורת חיובית נמוכה, בקרה חיובית גבוהה, וגם QS3 או QS4, וכל דגימות המטופל. יש להגדיר את נימי הדם בצו זה.
    3. השג ספציפי בלוק הקירור למכשיר ה-PCR בזמן אמת שמאוחסן ב 4 ° C. מניחים את צינורות נימים המתאימים בבלוק הקירור. אל תיגע במשטח של צינורות נימים. תמיד להשתמש בכפפות בעת הטיפול בנימי הדם.
    4. הגדר את כל תגובות שרשרת פולימראז במכסת מנוע נקייה אינו מזוהם בproduc ההגברהts.
      1. הסר את המספר הנכון של בקבוקוני הורים מערכת PCR כדי לבדוק את כל הדגימות החולים, בתוספת 5 פקדים. בואו בקבוקוני ההורים, פתרון Mg, והפשרת מים כיתה PCR בבלוק הקירור. כל בקבוקון אדון מכיל מספיק חומרים כימיים ל12 בדיקות.
      2. בעדינות מערבולת בקבוקוני האדון ומהיר לסובב אותם בצנטריפוגה במהירות המרבית.
      3. לשלב את התוכן של כל בקבוקון אדון לבקבוקון אחד, ובעדינות מערבולת שוב.
      4. מערבבים את תערובת ההורים ופתרון Mg בכמויות שצוינו בגיליון עבודת PCR לתוך צינור microfuge סטרילי אחת.
      5. מערבבים בעדינות וaliquot 15 μl תמהיל הורים עם Mg לתוך כל צינור נימים, למעט הנימים בעמדה 5 שהינה על רמת quantitation (QS).
    5. הזז את בלוק הקירור המכיל את צינורות נימים ושילוב הורים עם Mg ממכסת המנוע הנקי למכסת מנוע עיבוד.
    6. הוסף 2 μl של בקרה פנימית (IC) ל30 μl הנותר של אמןלערבב עם Mg. מערבבים בעדינות וaliquot 15 μl לתוך הנימים בעמדה 5 (עמדה לQS).
    7. פיפטה 10 μl מים, לשלוט DNA, או דנ"א מדגם לתוך צינור הנימים המתאים. מכסה את צינורות נימים באמצעות כלי מכסת.
    8. קח קירור בלוק / דגימות למכשיר ה-PCR בזמן אמת.
  2. לתכנת בזמן אמת PCR המכשיר (ראה טבלה 1)
  3. הגברה והאיתור שבוצעו על מכשיר ה-PCR בזמן אמת
    1. להתחבר למחשב
    2. לחץ לחיצה כפולה על סמל המכשיר ולהיכנס לתוכנה.
    3. הפעל את המכשיר בזמן אמת PCR
    4. לחץ על "CMV / EBV" מהמסך הקדמי.
    5. בצע את ההנחיות של אשף המאקרו.
    6. בחר בתיבה כדי להפעיל בדיקה עצמית כאשר תתבקש לעשות זאת על ידי התוכנה. בדיקה עצמית יש לבצע פעם אחת בכל יום המכשיר נמצא בשימוש.
    7. שם הארוך.
    8. התאם את ספירת המדגם ממוקמת בLEF העליוןהפינה לא של הדף לסכום של בקרות וחולים שנכללה בריצה והזן את מספר זיהוי של כל דגימת חולה.
    9. לחץ על הלשונית "אבס קוואנט".
    10. תחת "סוג לדוגמא", להקצות את סוג הדגימה המתאים לסטנדרט.
    11. הקלד בריכוזים הצפויים לסטנדרטי quantitation (QS).
    12. הסר את צינורות נימים מהגוש הקריר ומניח אותם למצב המקביל בקרוסלה (קירור מדגם # 1 בלוק צריך להיות ממוקם בעמדת המס '1 על הקרוסלה, וכו').
    13. הנח את הקרוסלה לתחילת צנטריפוגות והעיתונות של המכשיר.
    14. פתח צנטריפוגות ולהסיר את הקרוסלה.
    15. הנח את הקרוסלה למכשיר ה-PCR בזמן אמת. סגור את המכסה.
    16. לחץ על "התחל הפעלה".
    17. מכשיר ה-PCR בזמן אמת יבדוק כל עמדה למדגם. לא להתרחק מהמכשיר עד סימון זו הושלם, ובייחודcially אם אחד מנימי הדם לא נמצא בקרוסלה. המכשיר יהיה לציין זאת ולשאול אם הריצה היא להמשך יבוא. לענות בחיוב לפני שעזבתי.
    18. לאחר הריצה תושלם, סגור את הדו"ח שנוצר.
    19. לחץ על "המוחלט Quantitation".
    20. לחץ על החץ שליד צבע פיצויים.
    21. לחץ על "בחר צבע פיצוי" מהתיבה הנפתחת.
    22. בחר את קובץ פיצוי צבע העדכני ביותר לפנות לריצה.
    23. לחץ על אישור כאשר התיבה יצוץ.
    24. לחץ על החץ בתקן Curve.
    25. בחר באפשרות "שימוש חיצוני" מהתפריט הנפתח.
    26. בחר את קובץ עקומת סטנדרט החיצוני העדכנית ביותר, ולאחר מכן לחץ על אישור.
    27. תסתכל על כל עקומה תחת התפריט המוחלט כימות כדי להבטיח שעקומות נמצאות ולא קו ישר, אם ריכוז מוקצה. כימות מוחלטת ל530 705/Back הוא ניתח באופן אוטומטי.
  4. Quשליטת ality
    1. ליצור עקומת סטנדרט חדשה בכל פעם שמספר הרבה חדש של חומרים כימיים הוא קיבל, או כל שישה חודשים, לפי תכוף יותר.
    2. הוסף 10 μl של כל תקן לתערובת ההורים עם Mg. קחו למשל את הסטנדרטים כלולים בערכה ה-DNA שחולצה בעבר.
    3. הוסף 1 μl של בקרה פנימית עבור כל תקן לתערובת ההורים עם Mg שימוש בתהליך יצירת העקומה סטנדרטית כדי להבטיח quantitation מדויק. אל תוסיף IC לתערובת ההורים עם Mg לשום תבנית הבקרה (NTC).
    4. הכן NTC ושלושה משכפל של Quantitation התקנים 4 QS, 3, 2, 1, ודילול של 1:10 QS4 לריצה כדי ליצור את עקומת הסטנדרט, בהיקף ב16 נקודות נתונים.
    5. בחר באפשרות "לשכפל של" בתפריט הנפתח לסטנדרטים חוזרים ונשנים
    6. בחר אף 530/back ערוץ ולהדליק פיצוי צבע בעת ניתוח הארוך,
    7. תחת "Curve הרגיל (בהפעלה)", בחר "שמירה בשם לשעברשלהן פנימי "ושם העקום. הזן את התגובה "מיושמת כעקומת סטנדרט" בעת שמירה.
    8. גרף התוצאות. מקדם ליניאריות וכתוצאה מכך יש ≥ 0.81.
    9. לריצות יומיות, כולל עותק אחד של QS3 או QS4 כשליטה בריצה. עקומת הסטנדרט החיצונית הנוכחית עשויה להיות מיובאת לתוך הריצה בשלב הניתוח.
    10. הפעלת פקדים: אין שליטת DNA, בקרה שלילית, נמוכה, ובקרות חיוביות גבוהות. עומס נגיפי צפוי נקבע ומותאם לכל ספק ומספר הרבה.
    11. הוספת IC לכל דגימה ולשלוט במיצוי DNA.
    12. אם כל אחד מהפקדים נופל מחוץ לטווח, רשום את התוצאות בלתי מתקבלות על הדעת ולהתייחס assay לפתרון בעיות.
  5. תדר של בקרות
    1. לכלול בכל ריצה: NTC, ביקורת שלילית, נמוכה חיובית, גבוהה חיובית, וסטנדרטית.

הערה: גבולות מקובלים לבקרות. אין פסגות יש להתבונןד לשום תבנית (NTC) ופקדים שליליים. פסגות צריכה להיות נוכחים בערוץ 530 ועומס נגיפי צפוי נקבעים ומותאם לכל ספק ומספר הרבה לבקרות חיוביות נמוכות וגבוהות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כולל של 228 לוקי רקמות נבדקו על ידי תגובה כמותית פולימראז שרשרת (qPCR), שהיה מורכבת מ91 ציטומגלווירוס (CMV) מקרים חיוביים המבוססות על היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה החיובית (IHC), 18 עם דו משמעי CMV IHC, ו79 פקדים שליליים. כפי שמודגם באיור 2, במקרים חיוביים CMV היו הפגינו תכלילים טיפוסיים CMV נגיפיים (א) ו / או כתמים חיוביים IHC (ב '). מקרים דו משמעיים היו הפגינו דפוסים נדירים, לא קלאסיים המופיעים כתמים (C), ואי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שיטות מעבדה רבות זמינות עבור האבחנה של זיהום ציטומגלווירוס (CMV), כולל סרולוגיה, תרבות נגיפית, מבחני ירמיה מולקולריים, היסטולוגיה של חומר ביופסיה, וכפי שהוכיח לאחרונה מבחני, מולקולריים של, ביופסיה קבועה פורמלין פרפין, מוטבע (FFPE) 5,6 רקמות. סרולוגיה, ברגע שעמוד תווך של אבחנה, רק באופן מהימן מזהה חשיפה ואינה תואמים היטב עם זיהום CMV אקוטי 7. תרבות ויראלי, קונבנציונלית ובקבוקון פגז אנטיגן מוקדם, הקשו על ידי פעמים assay ממושכות, במקרה טוב 2-3 ימים במקרה של

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

יש המחברים אין לחשוף.

תודות

אנו מכירים את איימי Thomasson על סיועה בהכנת כתב היד הזה, ופרדריק Skarstedt וריאן כריסטי על מאמציהם בהכנה של דמויות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1.7 מ"ל צינורות מיקרופוגהCostar3620
מלקחיים משונניםשירותי מיקרוסקופיה אלקטרונית62086-1Sמיקרו מלקחיים MF-1
צנטריפוגות שולחניות (מיקרופוגה)Eppendorf5424
קסילןפישרפישר מדעי: X3P1 ליטר
אתנולפישרפישר מדעי: ET10896-100%
MicrotomeLeicaRM2255
QIAamp DNA FFPE רקמות ערכתQiagen56404
artus CMV LightCycler PCR ASRQiagen4500025
CMV LC PCR ערכת תוסףQiagen1031873
LightCycler צנטריפוגהRoche75005087
LightCycler קירור בלוקרוש
LightCycler כלי מכסהRoche3357317
ערכת פיצוי צבעRoche2158850
LightCycler 20 μ l נימיםRoche1 909 339
להביםסאקורהפישר מדעי: 4689Accu-Edge פרופיל נמוך
10800058001

מקורות

  1. Hodinka, R. L. Manual of Clnical Microbiology. 2, ASM Press. 1558-1574 (2011).
  2. Lasry, S., et al. Interstrain variations in the cytomegalovirus (CMV) glycoprotein B gene sequence among CMV-infected children attending six day care centers. The Journal of infectious diseases. 174, 606-609 (1996).
  3. Murph, J. R., Baron, J. C., Brown, C. K., Ebelhack, C. L., Bale Jr, J. F. The occupational risk of cytomegalovirus infection among day-care providers. JAMA : the journal of the American Medical Association. 265, 603-608 (1991).
  4. Pass, R. F., et al. Vaccine prevention of maternal cytomegalovirus infection. The New England journal of medicine. 360, 1191-1199 (2009).
  5. McCoy, M. H., et al. qPCR increases sensitivity to detect cytomegalovirus in paraffin-embedded, formalin-fixed tissue of gastrointestinal biopsies. Human Pathology. 45, 48-53 (2014).
  6. Mills, A. M., Guo, F. P., Copland, A. P., Pai, R. K., Pinsky, B. A. A comparison of CMV detection in gastrointestinal mucosal biopsies using immunohistochemistry and PCR performed on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. The American journal of surgical pathology. 37, 995-1000 (2013).
  7. Krech, U. Complement-fixing antibodies against cytomegalovirus in different parts of the world. Bulletin of the World Health Organization. 49, 103-106 (1973).
  8. Chou, S. Newer methods for diagnosis of cytomegalovirus infection. Reviews of infectious diseases. 12 Suppl 7, (1990).
  9. Brytting, M., Xu, W., Wahren, B., Sundqvist, V. A. Cytomegalovirus DNA detection in sera from patients with active cytomegalovirus infections. Journal of clinical microbiology. 30, 1937-1941 (1992).
  10. Revello, M. G., et al. Human cytomegalovirus in blood of immunocompetent persons during primary infection: prognostic implications for pregnancy. The Journal of infectious diseases. 177, 1170-1175 (1998).
  11. Shinkai, M., Bozzette, S. A., Powderly, W., Frame, P., Spector, S. A. Utility of urine and leukocyte cultures and plasma DNA polymerase chain reaction for identification of AIDS patients at risk for developing human cytomegalovirus disease. The Journal of infectious diseases. 175, 302-308 (1997).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

DNAqPCRFFPEDNAPCR
qPCR הוא שיטה רגישה ומהירה לאיתור של Cytomegaloviral DNA בקבועה פורמלין, רקמות ביופסיה מוטבעות פרפין
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.