הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

גזירה ללא מזין של תאים עצביים קרסט אב קדמון מפלוריפוטנטיים אדם בתאי גזע

14K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/51609

⸱

22 במאי 2014

 ,  ,  , 
1Developmental Biology, Center for Stem Cell Biology, Sloan-Kettering Institute for Cancer Research, 2St. Giles Laboratory of Human Genetics of Infectious Diseases, The Rockefeller University

במאמר זה

סיכום

יש תאי רכס עצבי (NC) שמקורם בתאים אנושיים גזע pluripotent (hPSC) פוטנציאל גדול לפיתוח מודלים ומחלות של בני אדם ועבור טיפולי החלפת תא. הנה, הסתגלות מזין ללא ממשמש כיום באופן נרחב במבחנה פרוטוקול בידול לגזירה של תאי NC מhPSCs מוצג.

תקציר

תאים אנושיים גזע pluripotent (hPSCs) יש פוטנציאל גדול ללימוד התפתחות עוברית אנושית, לדוגמנות מחלות אנושיות בצלחת וכמקור לתאים להשתלה, שיישומי משובי לאחר מחלה או תאונה. תאים עצביים לפסגה (NC) הם סימנים מקדימים למגוון גדול של תאים סומטיים בוגרים, כגון תאים ממערכת העצבים ההיקפית וגליה, מלנוציטים ותאי mesenchymal. הם מקור חשוב של תאים ללמוד היבטים של התפתחות עוברית אנושית, כוללים מפרט גורל תא והגירה. הבחנה נוספת של תאי אב NC לסוגי הבדיל סופני סלולריים מציעה את האפשרות למודל מחלות אנושיות במבחנה, לחקור מנגנוני מחלה וליצור תאים לרפואת רגנרטיבית. מאמר זה מציג את העיבוד של במבחנה פרוטוקול בידול זמין כרגע להפקת תאי NC מhPSCs. פרוטוקול חדש זה דורש 18 ימי differentiation, כלומר, להרחבה בקלות ושחזור מאוד בין תאי גזע עובריים אנושיים קווים (hESC), כמו גם בתאי גזע pluripotent אדם הנגרם על קווים (hiPSC) ללא מזין. שני פרוטוקולים הישנים וחדשים יניבו תאי NC של זהות שווה.

מבוא

תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) ותאי גזע pluripotent מושרה (hiPSC) הראו פוטנציאל עצום, בפרט לבירור ולטיפול עתידי במחלות בבני אדם שלמודלים של בעלי חיים לא טובים ולא רקמות עיקריות זמינות. דוגמאות יישום לטכנולוגית hESC / hiPSC הן כדלקמן: תאים בעלי עניין מיוחד ניתן להפיק מן hESC / hiPSCs לרפואת רגנרטיבית בכמות בלתי מוגבלת 1. יכולים להיות מיוצרים בתאים של חולים שנשאו מחלה ספציפית ושימשו להקמה במודלי מחלה מבחנה 2,3. מודלים מחלה כזו אז יכול להיות מועסק להקרנת סמים בקנה מידה גדולה בחיפוש אחר תרכובות תרופה חדשות 4, כמו גם בדיקות של תרופות קיימות ליעילות ורעיל 5. במבחנה מודלים מחלה יכולים להוביל לזיהוי מנגנוני מחלה רומן. עבור כל היישומים של טכנולוגית hESC / iPSC חשוב לעבוד עם מסוים, גם להגדיר-סוגי תאי ד המושפעים במחלה של עניין. לפיכך, על זמינותו של במבחנה פרוטוקולי בידול מוצקים ושחזור היא חיונית עבור כל היישומים של טכנולוגית hESC / hiPSC. פרוטוקולים רצויים שמראה השתנות מינימאלית, הוצאות זמן, מאמץ, קושי ועלות, כמו גם שחזור מקסימאלי בין קווי hESC / hiPSC וחוקרים שונים.

תאי רכס עצבי (NC) לצוץ במהלך neurulation חוליות בין האפידרמיס ואפיתל העצבי. הם להתרבות ולהעביר באופן נרחב ברחבי העובר המתפתח ולהצמיח מגוון מרשים של סוגי תאי צאצאים, כוללים עצם / סחוס, שלד craniofacial, עצבים חושיים, תאי שוואן, מלנוציטים, תאי שריר חלק, תאי עצב enteric, הנוירונים אוטונומיים, תאי chromaffin , תאי מחיצת לב, שיניים ובלוטות יותרת הכליה תאים / בלוטת התריס 6. לכן, תאי NC הם סוג תא אטרקטיבי עבור שדה תאי גזע וחשוב עבורמודלים של מגוון רחב של מחלות, כגון מחלת הירשפרונג 7, המשפחתי דיסאוטונומיה 8, כמו גם סוגי סרטן כגון נוירובלסטומה 9. יתר על כן, הם מציעים את האפשרות ללמוד היבטים של התפתחות עוברית אנושית במבחנה.

זמין כרגע ומיושמים באופן נרחב בפרוטוקול בידול מבחנה להפקת תאי NC מhESCs 10,11 דורש עד 35 ימים של בידול וזה כרוך באינדוקציה עצבית בתאים מזינים סטרומה כגון תאי MS5 ומתבצע כך בתנאים מוגדרים היטב. למרות שזה יכול להיות עד בקנה מידה כדי לייצר כמויות גדולות של תאי NC, למשל נדרש להקרנת סמים תפוקה גבוהה 4, זה עבודה ועלות אינטנסיבית. יתר על כן, היא כרוכה passaging הידני של רוזטות העצבית, שיכול להיות קשה ללהתרבות ולכן כפופה לשונות הכוללות, בפרט כאשר הוא מוחל על מגוון גדול של hESC או hiPSCקווים. הנה, את הגזירה בשלבים של תאי NC בפרוטוקול 18 יום שהוא ללא תאים מזינים מוצגת. שיטה זו היא קצרה יותר ומוגדרת יותר מאשר הפרוטוקול המשמש כיום. יתר על כן, זה מאוד חזק ביצירת תאי NC בין קווי hiPSC שונים. חשוב מכך, הוא הראה כי תאי NC הניבו ידי שני הפרוטוקולים מופיעים בגבול של רוזטות העצבית (שושנה-NC מכונה להלן או R-NC). התאים שמקורם באחת משני הפרוטוקולים נראים מורפולוגית זהים, הם מבטאים את אותו סמני NC ולהתקבץ יחדיו בניתוח microarray. תאי NC נגזרים באמצעות הפרוטוקול החדש (R-NC) הם פונקציונליים, בדומה לתאי NC נגזרים באמצעות הפרוטוקול הישן (MS5-R-NC) באופן שהם יכולים להעביר ועוד להתמיין לתאי עצב. לכן, ניתן להשתמש בתאים במקביל לתאי MS5-R-NC. פרוטוקול תא R-NC לגזירה של תאי NC מhESC / iPSC יהיה שימושי עבור כל היישומים של טכנולוגית hESC / iPSC מעורב שושלת NC.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת תרבות מדיה, כלים מצופים ותחזוקה של hPSCs

הכנת 1.1 מדיה

הערה: לסנן את כל התקשורת לעיקור ולאחסן ב 4 ° C בחושך עד 2 שבועות. מספרי שמות מגיב, חברה וקטלוג מפורטים בטבלת החומרים.

  1. DMEM/10% FBS: שלב 885 מיליליטר DMEM, 100 FBS מיליליטר, 10 מיליליטר פן / סטרפטוקוקוס ו5 מיליליטר L-גלוטמין.
  2. HES בינוני: שלב 800 מיליליטר DMEM/F12, 200 מיליליטר KSR, 5 מיליליטר L-גלוטמין, 5 מיליליטר פן / סטרפטוקוקוס, 10 מיליליטר MEM פתרון חומצות אמינו חיוני מינימאלי, 1 מיליליטר β-mercaptoethanol. הוסף 10 מיליליטר / ng FGF-2 לאחר הסינון הבינוני.
    זהירות: β-mercaptoethanol הוא רעיל, יש להימנע משאיפה, בליעה ומגע עם עור.
  3. מדיום KSR-בידול: שלב 820 מיליליטר נוק DMEM, 150 מיליליטר KSR, 10 מיליליטר L-גלוטמין, 10 מיליליטר פן / סטרפטוקוקוס, 10 מיליליטר MEM פתרון חומצות אמינו חיוני ומינימום 1 מיליליטר β-mercaptoethanol.
  4. N2-differentiatiעל מדיום: ממיסים אבקת DMEM/F12 גרם 12 ב980 מיליליטר DH 2 O, להוסיף 1.55 גלוקוז גרם, 2 גרם נתרן ביקרבונט ו100 מ"ג transferrin אדם APO. מערבבים 2 מיליליטר DH 2 O עם אינסולין אנושי 25 מ"ג ו40 μl 1 N NaOH, להוסיף את הפתרון המומס למדיום. הוספת 100 dihydrochloride μl putrescine, 60 סלניום μl, 100 פרוגסטרון μl ולהביא את הנפח של עד 1 ליטר עם DH 2 O.

1.2 ציפוי של מנות התרבות

  1. ציפוי Matrigel: 1 מיליליטר הפשירו aliquot קפוא matrigel ידי pipetting 19 מיליליטר DMEM/F12 מעל aliquot עד שהוא נמס. להסיר גושים ידי העברתו דרך מסננת תא 40 מיקרומטר וצלחת 8 ml/10 צלחת סנטימטר. דגירה הצלחות עבור שעה 1 ב RT. לשאוב matrigel מייד לפני ציפוי התאים.
    שים לב: עבודה במהירות עם matrigel כי זה יכול גוש בטמפרטורות מעל 4 ° C.
  2. ציפוי PO / לאם / FN: הוסף 10 מיליליטר של 1x PBS המכיל 15 מיקרוגרם / hydrobromide פולי-L Ornithin מיליליטר למנת 10 סנטימטר. דגירה את הצלחת מעל בלילה 37 ° C. לשטוף צלחות עם 1x PBS אחת ולהוסיף 10 מנה ml/10 סנטימטר של 1x PBS המכילה 2 מיקרוגרם / מיליליטר עכבר Laminin-I ו 2 מיקרוגרם / מיליליטר פיברונקטין. דגירה הצלחות לאורך הלילה ב 37 ° C. לפני ציפוי התאים, להסיר לחלוטין את הפתרון ולתת לצלחות להתייבש היטב על RT במשך 15-20 דקות על ידי עמידתם לקיר מכסה המנוע בתרבית הרקמה ללא המכסה.
    הערה: המנות הן יבשות לחלוטין ומוכנות לציפוי תא כאשר אחד יכול לראות מבנים גבישיים על פני השטח (גלוי לפי העין). יכולות להיות כל הזמן הצלחות ב RT לכמה שעות במצב היבש הזה. מנות PO / לאם / FN צריכים להיות מוכנות 2 ימים לפני הזמן. במקרים חירום לאם / FN ניתן טופח במשך 2-4 שעות בלבד. עם זאת, זה עלול לסכן את תוצאות בידול / הישרדות הכי מוצלח.

1.3 תחזוקה של hPSCs

הערה: hPSCs נשמרים בג'לטין 0.1% ועכבר mitotically מומת fibroblasts העוברי (MEFS) בHES הבינוני בתוספת 10 / מיליליטר ng כפי שתואר לעיל 10,12 FGF-2. יש לפצל את התאים בכל 6-8 ימים.

  1. מעיל צלחת 10 סנטימטר עם 8 מיליליטר 0.1% ג'לטין (ב 1x PBS ללא מגנזיום או סידן) בשעה RT למשך 5 דקות.
  2. להפשיר MEFs קפוא במהירות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. להוסיף 1 מ'MEFs ל10 מיליליטר DMEM/10% FBS.
  3. לשאוב את הג'לטין וצלחת התאים. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות 6 שעות.
  4. לשאוב FBS% DMEM/10 מצלחת MEF מוכנה, לשטוף צלחת עם 1x PBS אחת ולהוסיף 10 מיליליטר הס בינוני בתוספת dihydrochloride Y-27632 10 מיקרומטר. לאפשר את המדיום כדי להתחמם על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
    הערה: פיצול ידני של hPSCs זרימה למינרית עם מיקרוסקופ הגלום בשימוש. עם זאת, ניתן passaged התאים באמצעות שיטות חלופיות מתאימות.
  5. תחת זרימה למינרית עם מיקרוסקופ מוטבע, לנתק את המושבות נפרדות באמצעות מרים תא ולתת להם לצוף.
  6. השתמשמזרק 1 מיליליטר לשאוב המושבות צפות ולשגר אותם על גבי הצלחת הטרי, החמה MEF. העבר כ רבע מהתאים למנה החדשה. לדגור על 37 ° C.
  7. להאכיל את התאים יומיים עם מדיום HES טרי.

2. ציפוי של hPSCs לבידול

שים לב: יש לפצל hPSCs או מצופה לבידול כאשר המושבות גדולות, אבל עדיין יש קצוות חדים עם מעט ככל תאים מבדלים אפשריים בגבולות שלהם (ראה איור 1). כאשר התאים נשמרים באמצעות passaging מדריך למושבות צריכה להיות גדולות מספיק כדי לראות בקלות על ידי העין. כדי לקבל את התחושה הנכונה לנקודת זמן זו ניתן לשמור על צלחת hPSC נפרדת לשבועיים ללא passaging ולראות את התאים להגיע ולעבור את נקודת הזמן האידיאלית לpassaging / הבחנתם.

  1. הכן 10 מנות סנטימטר עם hr matrigel 1 לפני שמתחיל את הבידול. ציפוי matrigel מוצלח יכול להיותאימת בהגדלה 4x.
  2. כאשר hPSCs מוכן להיות מפוצל, לשאוב את המדיום ולהוסיף 4 מיליליטר של 0.05% טריפסין-EDTA לתאים.
  3. לנער את הצלחת אופקית למשך 2 דקות במרץ עד שאחד יכול לראות את MEFs כתאים בודדים מרימים את הצלחת מתחת למיקרוסקופ. מושבות hPSC להישאר מצורפים כמושבות.
  4. מייד וביסודיות, לשאוב טריפסין ולתת את הצלחת לעמוד על RT במשך 2-4 דקות.
  5. הוסף 2 מיליליטר של HES-בינוני עד הצלחת ובאמצעות פיפטה P1000, לנתק את התאים.
    הערה: אם לא ניתן להרים את תאי השטח בקלות, הצלחת ניתן מודגרות ריקה ב RT לעוד דקות 2-3.
  6. להעביר את התאים 8 מיליליטר הס הבינוני בתוספת dihydrochloride Y-27632 10 מיקרומטר.
  7. לשאוב matrigel מצלחת סנטימטר שהוכנה קודם לכן 10. פלייט התאים ביחס של 1:1 או 1:2 (לדוגמא: התאים מצלחת 10 סנטימטר אחד מתפצלים לשתי 10 מנות סנטימטר) על גבי צלחת matrigel. לדגור על 37 מעלותC במשך הלילה.
    הערה: ציפוי זה אמור לגרום כ -100,000 תאים / 2 סנטימטר.

3. אינדוקציה של בידול העצבי

הערה: הבידול יכול להיות יזם (יום 0), כאשר התאים מחוברות 90-100% (ראה תרשים 1C), בדרך כלל ביום שלמחרת. אם confluency מדויק לא הגיע עדיין, יכולים להיות מוזנים בתאים יומיים עם HES-בינוני עד שהם מוכנים לבידול. לחלופין, ניתן להגדיל את המספר הראשוני של תאים מצופים.

  1. ביום 0 עד 3, להאכיל את התאים יומיים עם 10 ml/10 סנטימטר צלחת בינוני KSR-בידול מכיל 0.1 LDN193189 מיקרומטר ומיקרומטר 10 SB431542.
  2. על הזנת יום 4 ו -5 תאים עם 75% מדיום KSR-בידול ו25% בינוניים N2-בידול שני המכילים LDN193189 וSB431542.
  3. על הזנת יום 6 ו 7 תאים עם 50% מדיום KSR-בידול ו50% בינוניים N2-בידול שני המכילים LDN193189 וSB431542.
  4. על הזנת יום 8 ו -9 תאים עם 25% מדיום KSR-בידול ו75% בינוניים N2-בידול שני המכילים LDN193189 וSB431542.
  5. ביום 9 ו10 להכין מנות PO / לאם / FN כפי שצוינו ב1.2.2 לreplating של התאים ביום 11.
  6. ביום 10 תאי הזנה עם מדיום N2-בידול המכילים LDN193189 וSB431542.

4. Replating בטיפין למפרט NC

  1. יום 11 לאם לשאוב / FN מהצלחות הכינו בעבר ולתת להם להתייבש לחלוטין על RT במשך 20-30 דק ', כפי שהוסבר ב1.2.2.
  2. הסר בינוני מהתאים מבדלים, לשטוף את תאי פעם עם 1x PBS ולהוסיף 8 סנטימטר צלחת accutase/10 מיליליטר. דגירה עבור 20 דקות ב 37 ° C.
  3. באמצעות מרים תא, לנתק את תאי resuspend אותם בAccutase עם טפטפת 5 מיליליטר. מעביר את ההשעיה לצינור 15 מיליליטר.
  4. הוסף 5 מיליליטר של 1x PBS ולסובב את התאים 5 דקות ב114 x גרם.
  5. Resuspend התאים 10 מיליליטר 1x PBS. כדי להבטיח השעיה תא בודדת, לסנן אותם דרך מסננת תא 40 מיקרומטר ולספור את התאים באמצעות hemocytometer או טכניקה שווה ערך.
  6. ספין התאים למטה וresuspend אותם במדיום N2-בידול המכיל 200 מיקרומטר חומצה אסקורבית (AA), 20 ng / ml BDNF, 100 ng / ml FGF8, 20 ng / ml שש, 10 מיקרומטר Y-27632 dihydrochloride בריכוז של 100,000 -150.000 Cells/10 μl.
  7. שימוש חוזר-pipettor, צלחת 10 טיפות μl קרובים זה לזה בלעדיהם נגיעה אל PO המיובש / לאם / FN 15 מנות סנטימטר.
    הערה: אחת מנה 10 סנטימטר של תאים מובחנים בדרך כלל תוצאות בכ 2-3 פעמים 15 מנות סנטימטר או כ 100 x 10 צלחת סנטימטר droplets/15 μl.
  8. בואו הטיפות לעמוד על RT במשך 20-30 דקות, ולאחר מכן בזהירות רבה (שלא להפריע את הטיפות) להוסיף 30 מיליליטר של N2/AA/BDNF/FGF8/SHH/Y ולדגור על 37 ° C.
  9. ביום 12, להאכיל בזהירות את התאים עם 20 N2/AA/BDNF/FGF8/SHH המנה ml/15 סנטימטר.
  10. מday 14-17 להאכיל את התאים בכל שנייה או שלישי היום עם N2/AA/BDNF/FGF8.
  11. ביום 16 ו17 להכין PO / צלחות לאם / FN לreplate תאי NC לאחר FACS מיון.

5. סלולרי קרינה המופעל מיון (FACS) של תאי NC

הערה: הכנת התאים לFACS דורשת כ 2 שעות.

  1. 18 בינוני להסיר היום, לשטוף את התאים פעם עם 1x PBS בצלחת ולהוסיף Accutase מיליליטר 12. דגירה התאים עבור 20 דקות ב 37 ° C.
  2. באמצעות מרים תא, לנתק את התאים מפני השטח ולתת להם לצוף. פיפטה את התאים לתוך השעיה באמצעות פיפטה 5 מיליליטר, להעביר אותם לצינור 50 מ"ל ולהוסיף 30 מיליליטר של 1x PBS. ספין התאים 5 דקות ב114 x גרם.
  3. בעזרת פיפטה P1000, resuspend התאים 1 מיליליטר של 2% FBS / HBSS (HBSS מכיל 15 HEPES מ"מ). הוספת 19 מיליליטר של 2% FBS / HBSS ולסנן את התאים דרך מסננת תא 40 מיקרומטר כדי להבטיח השעיה תא בודדת. דגירה התאים על קרח במשך 15 מ 'לחסימת נוגדנים ולאחר מכן לספור אותם באמצעות hemocytometer.
  4. ספין התאים למטה וresuspend אותם בריכוז של 10 מיליון תאים / מיליליטר ב2% FBS / HBSS.
  5. להפריש 1 מיליון תאים כל אחד ל( HNK-1 ו-p75 רק בלבד) ללא רבב, מוכתם אחת ושני נוגדנים מוכתמים בלבד (APC בלבד ו488 בלבד) FACS שולט.
  6. הוסף 5 μl של HNK-1 ו -5 μl של p75 נוגדן ראשוני לכל 10 מיליון תאים בתרחיף 1 מיליליטר לדגימות התקינה ודגירה של 20 דקות על קרח.
  7. שטוף תאים ב10 מיליליטר 1x PBS (צנטריפוגות 5 דקות ב114 XG) וresuspend תאי מיליליטר 2% FBS 1 / HBSS. הוסף 2 μl של APC ו1 μl של 488 נוגדנים משני לכל 10 מיליון תאים בתרחיף 1 מיליליטר לדגימות התקינה ודגירה של 20 דקות על קרח בחושך.
    הערה: APC ו488 הם נוגדנים משני המשמשים כאן להכתמת HNK-1 ו-p75, בהתאמה.
  8. לשטוף את התאים ב10 מיליליטר 1x PBS פעמיים, resuspend 10 מיליון תאים ב500 μl של2% FBS / HBSS המכיל DAPI (ב0.5 ng / μl) או כתם החלופה מתאים לחיות תא להוציא תאים מתים מניתוח FACS.
  9. העברת הדגימות לנכס את צינורות FACS.
  10. הכן צינורות FACS עם 0.5 מיליליטר 2% FBS / HBSS לאוסף של תאים.
    הערה: התאים וצינורות איסוף נשמרים על קרח בחושך בזמן המיון.
  11. באמצעות מכונת מיון תא עם לייזרים שיכולים לזהות DAPI, APC ו488 סוג DAPI-/HNK-1 + / P75 + תאים חיוביים כפולים.
    הערה: זמן הכנה וטיפול בתאים מוביל לאחוז קטן של מוות של תאים, כתמי DAPI תאים מתים בלבד ובכך מאפשר לתאים אלה כדי לשלול מהאוכלוסייה הממוינת. כל כתם חי / מת חלופי עובד באותה המידה גם למטרה זו. DAPI עצמו אינו גורם לcytotoxicity באוכלוסיית התא החי.

6. Replating של תאים ממוין, NC תחזוקה והרחבה

הערה: תאי FACS מיון צריכים להיות ידהוביל בזהירות מיוחדת כדי להבטיח את הישרדותו האופטימלית. לשמור אותם על קרח עד replating. לא מערבולת או פיפטה אותם בחריפות. ניתן resuspended התאים על ידי מצליף את הצינורית.

  1. לאחר מיון FACS, לספור את תאי NC, אז לסובב אותם וresuspend במדיום N2-בידול בתוספת dihydrochloride Y-27632 10 ng / ml FGF2, 20 ng / ml EGF ו10 מיקרומטר בנפח המתאים לreplate ב30,000 תאים / 10 טיפות μl.
  2. יסודיות יבשה שהוכן קודם לכן PO / צלחות לאם / FN וצלחת כ 50-70 טיפות לכל צלחת 10 סנטימטר. תן את הכלים לעמוד על RT של 20-30 דקות.
  3. מוסיף בזהירות רבה 20 מנה ml/10 סנטימטר של N2/FGF2/EGF/Y-27632 מבלי להפריע את הטיפות. דגירה התאים ב 37 ° C.
  4. להאכיל את התאים בכל 2-3 ימים עם N2/FGF2/EGF.
    הערה: תאי NC מורחבים או passaged בערך כל 4-5 ימים או כשהם מתחילים נערמים בתוך הטיפות.
  5. למעבר תאי NC, להסיר את המדיום, וואsh התאים פעם אחת עם 1x PBS ולהוסיף 8 מיליליטר accutase/10 צלחת סנטימטר. דגירה עבור 20 דקות ב 37 ° C.
  6. פיפטה את התאים מהצלחת בעזרת פיפטה 5 מ"ל ולהעביר אותם לצינור 15 מיליליטר. הוסף 6 מיליליטר 1x PBS.
  7. ספין התאים 5 דקות ב114 x גרם.
  8. Resuspend התאים במדיום N2-בידול בתוספת 10 ng / ml FGF2, 20 ng / ml EGF ו10 מיקרומטר dihydrochloride Y-27632 כדי שיהיה לי 20,000 cells/10 μl רביב.
  9. Replate התאים ב10 טיפות μl לצלחות PO / לאם / FN מיובשים. תן את הכלים לעמוד על RT של 20-30 דקות.
  10. בזהירות להוסיף 20 מנה ml/10 סנטימטר של N2/FGF2/EGF/Y-27632. לדגור על 37 ° C.
    הערה: ניתן לשמור על תאי NC או מורחבים לתקופה של עד 2 שבועות כאוכלוסיית אב הומוגנית יחסית. תרבות ארוכה יותר עשויה להוביל אותם להתמיין לסוגי תאים שונים צאצאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

שני שיפורים החשובים ביותר של פרוטוקול R-NC על פרוטוקול MS5-R-NC 11 הם, ללא תנאי המזין מוגדר בידול והקיצור הכללי של דרישת הזמן. תאים מזינים MS5 13 הם תאים עכבריים מח עצם נגזרים סטרומה שהוכחו לתמוך בידול עצבי מ14 hESCs. HESCs התרבית בתאים מזינים MS5 במבנים בצפיפות נמוכים טופס אפיתל ורוזטות העצבית 15, בפריפריה של בו תאי NC לצוץ 10, ובכך מחקה את ההתפתחות עצבית אנושית מוקדם. עם זאת, לא ברור מה מולקולות איתות וגורמי גדילה משתחררים מ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

לבידול המוצלח של תאי R-NC מhESC / hiPSCs השיקולים הבאים צריכים להיעשות. זה קריטי כדי לעבוד בתנאים סטריליים תרבות בכל העת. בפרט, חשוב לבחון תרבויות hPSC לזיהום Mycoplasma באופן קבוע, שכן זיהום זה יפריע בידול מוצלח, אבל לא יכול בקלות להיות מזוהה מבחינה ויזואלית בתרבויות hPSC. בידול R-NC צריך להיות יזם ב90-100% צפיפות תאים; צפיפות תא נמוכה משפיעה על הישרדות תא ויעילות של בידול R-NC. זה קריטי כדי לאמת באופן אמפירי ריכוזים אופטימליים ומספרים הרבה של חלק מחומרים הכימיים, בKSR מסוים לתמי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

יש המחברים אין אינטרסים מנוגדים לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענק לחוקרים מתקדמים מהשויצרי הקרן הלאומית למדע ובאמצעות מענקים מNYSTEM (C026446; C026447) והיוזמה Tri-המוסדית בתאי גזע (סטאר קרן).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
DMEMGibco-Life Technologies11965-092
סרום בקר עוברי (FBS)Atlanta BiologicalsS11150
DMEM/F12Gibco-Life Technologies11330-032
החלפת סרום נוקאאוטGibco-Life Technologies10828-028יש לבדוק
L-גלוטמיןGibco-Life Technologies25030-081
פניצינלין/סטרפטומיציןGibco-Life Technologies15140-122
תמיסת חומצות אמינו חיוניות מינימליות MEM גיבקו-לייף טכנולוגיות11140-050
&בטא;-מרקפטואתנול Gibco-Life Technologies21985-023רעיל
רקומביננטי אנושי FGF בסיסי (FGF2)מו"פ & D Systems233-FB-001MG/CF
נוקאאוט DMEMGibco-Life Technologies10829-018
אבקת DMEM/F12 Invitrogen12500-096
גלוקוזSigmaG7021
נתרן ביקרבונט SigmaS5761
APO טרנספרין אנושיSigmaT1147
אינסולין אנושי SigmaI2643
Putriscine dihydrochlorideSigmaP5780
SeleniteSigmaS5261
פרוגסטרוןSigmaP8783
מטריצת מטריג'לBD Biosciences354234
Poly-L Ornithin hydrobromideSigmaP3655
Mouse Laminin-IR& המגבר; D Systems3400-010-01
פיברונקטיןBD Biosciences356008
Dispase בתמיסת המלח המאוזנת של האנק 5 U/mlטכנולוגיות תאי גזע7013
טריפסין-EDTA Gibco-Life Technologies25300-054
Y-27632 דיהידרוכלורידTocris-R& D Systems1254
LDN193189Stemgent04-0074
SB431542Tocris-R& D Systems1614
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
חומצה אסקורבית סיגמאA4034
BDNFמו"פ D Systems248-BD
FGF8מו"פ D Systems423-F8
עכבר קיפוד קולי רקומביננטי (SHH)R& D Systems464SH
HBSSGibco-Life Technologies14170-112
HEPESGibco-Life Technologies1563-080
EGF רקומביננטי אנושי D Systems236EG
ג'לטין (PBS ללא Mg/Ca)בבית
נוגדנים:
Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgMSigmaC6680-100TSTיש לבדוק
אנטי-p75 mIgG1 (קולטן גורם גדילה עצבי)יש לבדוק מערכות מיקוד מתקדמותAB-N07הרבה
APC חולדה אנטי-mIgMBD יש לבדוק את Parmingen550676lot
AlexaFluor 488 עז נגד עכבר IgG1 יש לבדוק אתמגרש InvitrogenA21121
Anti Oct4 mIgG2b (בשימוש בדילול של 1:200)יש לבדוק אתמגרש Santa Cruzsc-5279
חומר/ציוד:
פיברובלסטים עובריים של עכבר (7 מיליון תאים / בקבוקון)GlobalStemGSC-6105M
כלי תרבית תאים: צלחות 10 ס"מ ו -15 ס"מ, צינורות צנטריפוגה, צינורות FACS,   פיפטות, פיפטה טיפים
המטוציטומטר
צנטריפוגה
חממת תרבית תאים (CO2, לחות וטמפרטורה מבוקרת)
מכסה מנוע זרימה למינרית של תרבית תאים עם מיקרוסקופ
מכסה מנועבטיחות ביולוגית של תרבית תאים
מכונת מיון תאים, כלומר
1 מ"ל מזרק שחפת 27Gx1/2BD Biosciences309623
מרים תאים פוליאתילןקורנינג משולב3008
מו"פזכוכיתלתרבית תאיםמשובץ מיקרוסקופ הפוך MoFlo

מקורות

  1. Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat Methods. 7, 25-27 (2010).
  2. Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
  3. Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
  4. Lee, G., et al. Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression. Nat Biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).
  5. Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).
  6. Dupin, E., Sommer, L. Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood. Dev Biol. 366, 83-95 (2012).
  7. McKeown, S. J., Stamp, L., Hao, M. M., Young, H. M. Hirschsprung disease: a developmental disorder of the enteric nervous system. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 113-129 (2013).
  8. Slaugenhaupt, S. A., et al. Tissue-specific expression of a splicing mutation in the IKBKAP gene causes familial dysautonomia. Am J Hum Genet. 68, 598-605 (2001).
  9. Cheung, N. K., Dyer, M. A. Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy. Nat Rev Cancer. 13, 397-411 (2013).
  10. Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).
  11. Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
  12. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  13. Itoh, K., et al. Reproducible establishment of hemopoietic supportive stromal cell lines from murine bone marrow. Exp Hematol. 17, 145-153 (1989).
  14. Barberi, T., et al. Neural subtype specification of fertilization and nuclear transfer embryonic stem cells and application in parkinsonian mice. Nat Biotechnol. 21, 1200-1207 (2003).
  15. Elkabetz, Y., et al. Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage. Genes Dev. 22, 152-165 (2008).
  16. Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell Rep. 3, 1140-1152 (2013).
  17. Molofsky, A. V., et al. Bmi-1 dependence distinguishes neural stem cell self-renewal from progenitor proliferation. Nature. 425, 962-967 (2003).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Feeder freeFACSHNK 1 p75Poly L ornithinN2
גזירה ללא מזין של תאים עצביים קרסט אב קדמון מפלוריפוטנטיים אדם בתאי גזע
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.