הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
גזירה ללא מזין של תאים עצביים קרסט אב קדמון מפלוריפוטנטיים אדם בתאי גזע
במאמר זה
סיכום
תקציר
תאים אנושיים גזע pluripotent (hPSCs) יש פוטנציאל גדול ללימוד התפתחות עוברית אנושית, לדוגמנות מחלות אנושיות בצלחת וכמקור לתאים להשתלה, שיישומי משובי לאחר מחלה או תאונה. תאים עצביים לפסגה (NC) הם סימנים מקדימים למגוון גדול של תאים סומטיים בוגרים, כגון תאים ממערכת העצבים ההיקפית וגליה, מלנוציטים ותאי mesenchymal. הם מקור חשוב של תאים ללמוד היבטים של התפתחות עוברית אנושית, כוללים מפרט גורל תא והגירה. הבחנה נוספת של תאי אב NC לסוגי הבדיל סופני סלולריים מציעה את האפשרות למודל מחלות אנושיות במבחנה, לחקור מנגנוני מחלה וליצור תאים לרפואת רגנרטיבית. מאמר זה מציג את העיבוד של במבחנה פרוטוקול בידול זמין כרגע להפקת תאי NC מhPSCs. פרוטוקול חדש זה דורש 18 ימי differentiation, כלומר, להרחבה בקלות ושחזור מאוד בין תאי גזע עובריים אנושיים קווים (hESC), כמו גם בתאי גזע pluripotent אדם הנגרם על קווים (hiPSC) ללא מזין. שני פרוטוקולים הישנים וחדשים יניבו תאי NC של זהות שווה.
מבוא
תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) ותאי גזע pluripotent מושרה (hiPSC) הראו פוטנציאל עצום, בפרט לבירור ולטיפול עתידי במחלות בבני אדם שלמודלים של בעלי חיים לא טובים ולא רקמות עיקריות זמינות. דוגמאות יישום לטכנולוגית hESC / hiPSC הן כדלקמן: תאים בעלי עניין מיוחד ניתן להפיק מן hESC / hiPSCs לרפואת רגנרטיבית בכמות בלתי מוגבלת 1. יכולים להיות מיוצרים בתאים של חולים שנשאו מחלה ספציפית ושימשו להקמה במודלי מחלה מבחנה 2,3. מודלים מחלה כזו אז יכול להיות מועסק להקרנת סמים בקנה מידה גדולה בחיפוש אחר תרכובות תרופה חדשות 4, כמו גם בדיקות של תרופות קיימות ליעילות ורעיל 5. במבחנה
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת תרבות מדיה, כלים מצופים ותחזוקה של hPSCs
הכנת 1.1 מדיה
הערה: לסנן את כל התקשורת לעיקור ולאחסן ב 4 ° C בחושך עד 2 שבועות. מספרי שמות מגיב, חברה וקטלוג מפורטים בטבלת החומרים.
- DMEM/10% FBS: שלב 885 מיליליטר DMEM, 100 FBS מיליליטר, 10 מיליליטר פן / סטרפטוקוקוס ו5 מיליליטר L-גלוטמין.
- HES בינוני: שלב 800 מיליליטר DMEM/F12, 200 מיליליטר KS....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
שני שיפורים החשובים ביותר של פרוטוקול R-NC על פרוטוקול MS5-R-NC 11 הם, ללא תנאי המזין מוגדר בידול והקיצור הכללי של דרישת הזמן. תאים מזינים MS5 13 הם תאים עכבריים מח עצם נגזרים סטרומה שהוכחו לתמוך בידול עצבי מ14 hESCs. HESCs התרבית בתאים מזינים MS5 במבנים בצפיפות נמוכים טופס אפיתל ורוזטות העצבית 15, בפריפריה של בו תאי NC לצוץ 10, ובכך מחקה את ההתפתחות עצבית אנושית מוקדם. עם זאת, לא ברור מה מולקולות איתות וגורמי גדילה משתחררים מ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
לבידול המוצלח של תאי R-NC מhESC / hiPSCs השיקולים הבאים צריכים להיעשות. זה קריטי כדי לעבוד בתנאים סטריליים תרבות בכל העת. בפרט, חשוב לבחון תרבויות hPSC לזיהום Mycoplasma באופן קבוע, שכן זיהום זה יפריע בידול מוצלח, אבל לא יכול בקלות להיות מזוהה מבחינה ויזואלית בתרבויות hPSC. בידול R-NC צריך להיות יזם ב90-100% צפיפות תאים; צפיפות תא נמוכה משפיעה על הישרדות תא ויעילות של בידול R-NC. זה קריטי כדי לאמת באופן אמפירי ריכוזים אופטימליים ומספרים הרבה של חלק מחומרים הכימיים, בKSR מסוים לתמי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש המחברים אין אינטרסים מנוגדים לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענק לחוקרים מתקדמים מהשויצרי הקרן הלאומית למדע ובאמצעות מענקים מNYSTEM (C026446; C026447) והיוזמה Tri-המוסדית בתאי גזע (סטאר קרן).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 11965-092 | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMEM/F12 | Gibco-Life Technologies | 11330-032 | |
| החלפת סרום נוקאאוט | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | יש לבדוק |
| L-גלוטמין | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| פניצינלין/סטרפטומיצין | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | |
| תמיסת חומצות אמינו חיוניות מינימליות MEM | גיבקו-לייף טכנולוגיות | 11140-050 | |
| &בטא;-מרקפטואתנול | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | רעיל |
| רקומביננטי אנושי FGF בסיסי (FGF2) | מו"פ & D Systems | 233-FB-001MG/CF | |
| נוקאאוט DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| אבקת DMEM/F12 | Invitrogen | 12500-096 | |
| גלוקוז | Sigma | G7021 | |
| נתרן ביקרבונט | Sigma | S5761 | |
| APO טרנספרין אנושי | Sigma | T1147 | |
| אינסולין אנושי | Sigma | I2643 | |
| Putriscine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| פרוגסטרון | Sigma | P8783 | |
| מטריצת מטריג'ל | BD Biosciences | 354234 | |
| Poly-L Ornithin hydrobromide | Sigma | P3655 | |
| Mouse Laminin-I | R& המגבר; D Systems | 3400-010-01 | |
| פיברונקטין | BD Biosciences | 356008 | |
| Dispase בתמיסת המלח המאוזנת של האנק 5 U/ml | טכנולוגיות תאי גזע | 7013 | |
| טריפסין-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 דיהידרוכלוריד | Tocris-R& D Systems | 1254 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SB431542 | Tocris-R& D Systems | 1614 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| חומצה אסקורבית | סיגמא | A4034 | |
| BDNF | מו"פ D Systems | 248-BD | |
| FGF8 | מו"פ D Systems | 423-F8 | |
| עכבר קיפוד קולי רקומביננטי (SHH) | R& D Systems | 464SH | |
| HBSS | Gibco-Life Technologies | 14170-112 | |
| HEPES | Gibco-Life Technologies | 1563-080 | |
| EGF רקומביננטי אנושי | D Systems | 236EG | |
| ג'לטין (PBS ללא Mg/Ca) | בבית | ||
| נוגדנים: | |||
| Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM | Sigma | C6680-100TST | יש לבדוק |
| אנטי-p75 mIgG1 (קולטן גורם גדילה עצבי) | יש לבדוק מערכות מיקוד מתקדמות | AB-N07 | הרבה |
| APC חולדה אנטי-mIgM | BD יש לבדוק את Parmingen | 550676 | lot |
| AlexaFluor 488 עז נגד עכבר IgG1 | יש לבדוק את | מגרש Invitrogen | A21121 |
| Anti Oct4 mIgG2b (בשימוש בדילול של 1:200) | יש לבדוק את | מגרש Santa Cruz | sc-5279 |
| חומר/ציוד: | |||
| פיברובלסטים עובריים של עכבר (7 מיליון תאים / בקבוקון) | GlobalStem | GSC-6105M | |
| כלי תרבית תאים: צלחות 10 ס"מ ו -15 ס"מ, צינורות צנטריפוגה, צינורות FACS, פיפטות, פיפטה טיפים | |||
| המטוציטומטר | |||
| צנטריפוגה | |||
| חממת תרבית תאים (CO2, לחות וטמפרטורה מבוקרת) | |||
| מכסה מנוע זרימה למינרית של תרבית תאים עם מיקרוסקופ | |||
| מכסה מנוע | בטיחות ביולוגית של תרבית תאים | ||
| מכונת מיון תאים, כלומר | |||
| 1 מ"ל מזרק שחפת 27Gx1/2 | BD Biosciences | 309623 | |
| מרים תאים פוליאתילן | קורנינג משולב | 3008 | |
מקורות
- Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat Methods. 7, 25-27 (2010).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
