טכניקה לבודד cholangiocytes מצינורות המרה extrahepatic של עכברים בילוד מתוארת. הצינורות בקפדנות הם גזורים, ולאחר מכן תאים מבודדים על ידי תולדה בג'ל קולגן העבה. שיטה זו מספקת כלים שימושיים ללימוד פיתוח extrahepatic מרה צינור ופתולוגיה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
דרכי מרת התוך וextrahepatic של הכבד הן התפתחותית מובהקת, ועשויה להיות מושפע באופן דיפרנציאלי על ידי מחלות מסוימות. עם זאת, הבדלים בין cholangiocytes הפנים וextrahepatic, ובין תאי יילודים ומבוגרים, אינם מובנה היטב.
שיטות לבידוד של cholangiocytes מצינורות המרה intrahepatic מבוססים היטב 1-4. בידוד של תאי ductal extrahepatic, במיוחד מהילוד, עדיין לא תאר, אם כי זה יהיה יתרון גדול בהבנת ההבדלים בין אוכלוסיות שונות וcholangiocyte בחקר מחלות כמו atresia מרה המופיעות למקד את צינוריות extrahepatic. שתואר כאן הוא טכניקה מותאמת לבודד תאי צינור המרה extrahepatic שני יילודים ועכבר מבוגר. טכניקה זו מניבה אוכלוסיית תא טהורה עם זיהום מינימאלי מתאי mesenchymal כמו fibroblasts.
metho זהד מבוסס על הסרת צינוריות extrahepatic וכיס המרה, ואחריו לנתיחה קפדנית וגירוד כדי להסיר שכבות שומן ופיברובלסטים. מבנים מוטבעים בשכבות עבות של קולגן ותרבית למשך כ 3 שבועות כדי לאפשר תולדה של cholangiocytes בmonolayers, אשר לאחר מכן ניתן trypsinized ומחדש מצופים לשימוש ניסיוני.
מבוא
המקור וההתפתחות של cholangiocytes הפנים וextrahepatic הם שונים במידה ניכרת. הכבד מתפתח מdiverticulum של האנדודרם המעי הקדמי הגחון 5. אזור הזנב של diverticulum מהווה את עץ המרה extrahepatic, ואילו באזור הגולגולת יוצר עץ המרה intrahepatic 5. cholangiocytes צינור intrahepatic נגזרים מתאים סביב צלחת ductal באזורי פורטל פרי 6. תאים אלה היכולת להתמיין גם hepatocytes או cholangiocytes 6. יש לכך השלכות קליניות משמעותיות בהתחשב בעובדה שcholangiopathies עשוי במיוחד למטרת קטגוריה אחת של cholangiocytes. לדוגמא, atresia מרה בתחילה משפיע על צינוריות extrahepatic של הילוד, בעוד Alagille תסמונת משפיעה על צינוריות intrahepatic.
יש תיאורים רבים של הבידוד של cholangiocytes intrahepatic ויחידות צינור מרה מעכברים וחולדות. בתוךvestigators הצליח לבודד תאים בודדים על ידי בידוד צינור ותוצאה שלאחר מכן, או על ידי עיכול כבד ונוגדנים לנתץ של cholangiocytes להביע סמנים פני תא ספציפיים 1-4. יחידות צינור מרה פונקציונליות ומקוטבות היו מבודדות על ידי עיכול כבד וסינון גודל 7. יחידות צינור מרה הן מסוגלים להגיב לגירויי הפרשה ולהפגין הפרשת נוזלי 7, בעוד cholangiocytes המבודד הוכחו לפתח מבני ductular במבחנה 1,2. מגבלות של שיטות אלה כוללים את הצורך במומחיות מיוחדת טכנית וציוד מיוחד לזלוף כבד עם אנזימי עיכול. בנוסף, קיים סיכון של זיהום עם תאי mesenchymal 3.
שיטה לבודד cholangiocytes צינור המרה extrahepatic, במיוחד מצינורות מרה extrahepatic בילוד, לא תוארה בעבר. מאמר זה מתאר טכניקה פשוטה לבודד בילודזה גם תאי צינור המרה extrahepatic מבוגרים ברמות גבוהות של טוהר. טכניקה זו תאפשר המחקר של הבדלים בין cholangiocytes ומחקר במנגנונים של מחלות כמו atresia מרה שכוללות צינורות extrahepatic הפנים וextrahepatic.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
התהליך כולו מתבצע בטמפרטורת חדר, אלא אם כן צוין אחרת. כל העבודה של בעלי החיים צריכה להתבצע בתנאים אנושיים תחת פרוטוקול שאושר על ידי הוועדה המקומית בבעלי חיים מוסדיים טיפול ושימוש (IACUC).
1. הכנת הציוד ופתרונות
- הגדר את השולחן כירורגית העכבר בסמיכות למכסת המנוע בתרבית הרקמה והחממה (איור 1 א). הערה: ציוד הנדרש כולל מיקרוסקופ לנתח, מקור אור, איריס מספריים ארוכה וישרה 12.5 סנטימטר, מלקחיים 6 אינץ שאינו משוננים מעוגלים עם טיפים בסדר, ו4 אינץ מלקחיים משוננים, עם קצוות מעוגלים (איור 1).
- מקום מכשירים מעוקרים בכוס זכוכית של אלכוהול 70% על שולחן הניתוחים.
- מלא שלוש 60 מ"מ צלחות פטרי סטרילית עם תקשורת בידוד סטרילי (טבלת 1); הנח שתי על שולחן ניתוחים ואחד בשכונה, כולם על קרח.
- הנח קולגן זנב חולדה,תמיסת מלח סטרילית 10x פוספט (PBS), מים סטריליים, סטרילי N NaOH 1 ותאים אפיתל מרה תקשורת (BEC) (טבלת 1) במכסת המנוע בתרבית הרקמה. הערה: קולגן צריך להיות על קרח.
2. בידוד המרה Duct ותרבות
- להרדים עכברים ילודים בין 0-3 ימים של חיים, על ידי חשיפה לפחמן דו חמצני עד אבדן הכרה ואחריו נקע בצוואר הרחם, על פי הנחיות IACUC (תרשים 1C).
הערה: ניתן להשתמש בעכברים מבוגרים בהתאם לצרכימים של ניסוי ספציפיים. - הנח לבעלי חיים במצב שכיבה ולעשות חתך אופקי קטן שחצה את קו האמצע באזור של האגן. הרחב את החתך הזה רוחבי ואת שני הצדדים של הבטן, ויצר דש בצורת U. הפעל דש כדי לחשוף את איברי הבטן. ברגע שהבטן פתוחה, לנוע בזהירות את המעיים מתוך חלל הבטן לכיוון צד ימין של בעלי החיים להדמיה טובה יותר של צינור הכבד ומרה משותפת. הערה: ייתכן שיהיה צורך להאריך את החתכים הרוחב לתוך בית החזה כדי לקבל זיהוי טוב יותר של הכבד.
- באמצעות מיקרוסקופ לנתח, לזהות את צינור מרה המשותפת, כבד ומעיים. זהה את צינור המרה המשותף ראשון (1D איור), תוך שימוש בזהירות, כמבנים הם מאוד עדינים. עם מלקחיים המשוננים המשוננים ולא, בקפדנות נקייה ולאסוף את רקמות חיבור כולל שומן המקיף את המרה. השתמש באחד מלקחיים להחזיק את הצינור ואחר לניקוי.
- השתמש בטכניקה דומה כדי לנקות את כיס המרה.
- מקם את הצינוריות וכיס המרה ניקו לתוך הצלחת הראשונה של מדיה בידוד על קרח. לעסות בעדינות את המבנים עם המלקחיים משוננים שאינו בזמן בתקשורת כדי להסיר עוד יותר רקמות חיבור ולהסיר מרה מן כיס המרה.
- העבר את הצינורות וכיס מרה למנה השנייה של תקשורת בידוד.
- לאחר הבידוד של צינורות וכיס מרה מ5 בעלי חיים, להעביר אתחתיכות לצלחת פטרי השלישית, במכסת המנוע. הערה: אם תאים הם להיות מבודדים יותר מ 5 בעלי חיים, לעשות בקבוצות, תוך שימוש בפתרונות מפתיעים לכל קבוצה של 5 בעלי חיים.
- הכן ג'לי קולגן עבה במכסת המנוע בתרבית רקמה:
הערה: כל מנה בגודל ניתן להשתמש. צלחת תרבות 60 מ"מ עם נפח סופי של 3 מיליליטר קולגן לכל קבוצה של 5 ילודים עובדת היטב. זה צריך להיות מוכן טרי בעת הטבעת צינורות מבודדים טרי.- הנח קולגן עכברוש זנב, תמיסת מלח סטרילית 10x פוספט (10x PBS), סטרילי DH 2 O, וסטרילי N NaOH 1 על קרח.
- לחשב את הכמויות של DH 2 0, 10x PBS, NaOH, וקולגן הנדרש לג'לי עם ריכוז סופי של 2 קולגן מ"ג / מיליליטר ב 1x PBS, באמצעות נפח של 1 N NaOH שווה 0.023 פעמים הנפח של קולגן, הוסיף. הערה: אם מקור חלופי של קולגן משמש, בצע את הוראות היצרן לנטרול והיווצרות ג'ל.
- מערבבים יחד DH 2 0, 10x PBS, ו1 N NaOH, ולאחר מכן להוסיף קולגן וגם פיפטה כדי להבטיח גם ערבוב.
- ברגע שפתרון קולגן התעבה לג'ל כמו עקביות בטמפרטורת חדר, כדי לשבץ באופן מיידי את הצינורות בקולגן.
- מקום בחממה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 30 דקות כדי לאפשר קולגן כדי לחזק.
- ברגע ג'ל יש הקרושה (שינויי צבע מברורים ללבן), כיסוי עם 3.5 מיליליטר של תקשורת BEC (טבלת 1) ו לדגור על 37 ° C CO, 2 5%.
- הסר תקשורת BEC 3 פעמים בשבוע ולהחליף עם תקשורת טרי 3.5 מיליליטר.
3. בידוד Cholangiocytes הראשי מהעבה קולגן ג'ל
הערה: תוך 3 שבועות, גיליונות של cholangiocytes (תאים עם גרעינים גדולים הארכה ישירות מצינורות מוטבעים) יהיו גלויים בקולגן העבה. אם יש מספר גדול של fibroblasts בצלחת, זה צריך להיות מושלך. אם יש כמה אזורים של המנהגידול פיברובלסטים, אלה ניתן לגזור עם אזמל ולהסיר לפני פיצול cholangiocytes.
- הכן ג'לי קולגן דק:
- לדלל קולגן לריכוז של 1 מ"ג / מיליליטר עם PBS סטרילית. שים לב: שימוש 1 מיליליטר ל100 צלחת מ"מ; להתאים בהתאם לכלים בגודל אחרים.
- מורחים את פתרון קולגן באופן שווה עם מפזר תא (מנות גדולות) או קצה פיפטה (מנות קטנות), ולאחר מכן משאיר בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות.
- כסה צלחת עם DMEM/F12 ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 10 דקות.
- הסר את הצלחת מן החממה ולשטוף עם 1x PBS. מייד לשאוב PBS 1X.
- מעיל עם שכבה שנייה דקה של קולגן, מתפשטת על ידי החלפה של הצלחת או הצבת צלחת על שייקר. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 10 דקות.
- לאחר קולגן יש הקרושה, כיסוי צלחת עם DMEM/F12 ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 30 דקות.
- פיצול תאים מהג'ל קולגן איכס:
- עם מרית תרבית תאים או מגרד תא, לגרד ג'ל קולגן בעדינות מהצלחת, כך שהוא צף.
- הכן פתרון collagenase על ידי דילול collagenase סוג XI (ראה רשימת חומרים) ל10 מ"ג / מיליליטר עם DMEM/F12. מערבבים היטב וסינון סטרילי.
- הוסף 1 מיליליטר של תמיסת collagenase (לעיל) ל60 מנה מ"מ של תאים בקולגן העבה. אל תסיר את תקשורת BEC (שאמורה להיות 3 מיליליטר). דגירה צלחת ל30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- הסר תמיסה המכילה תאים, ואת המקום ב15 מיליליטר צינור חרוטי.
- ספין למטה ב2,200 XG במשך 5 דקות. בטל supernatant מחדש להשעות גלולה בנפח דומה של DMEM/F12.
- ספין פתרון שוב ב2,200 XG במשך 5 דקות. הסר supernatant.
- Resuspend גלולה ב 3 מיליליטר של טריפסין 0.5%, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 5 דקות. לאחר דגירה, פיפטה הפתרון למעלה ולמטה כדי לשבור את הגיליונות של cholangiocytes. הוסף 5 מיליליטר של תקשורת BECפתרון ספין nd ב1,500 XG במשך 5 דקות.
- הסר supernatant, וגלול resuspend ב DMEM/F12, אז ספין פתרון ב1,500 XG במשך 5 דקות.
- הסר את supernatant מחדש להשעות גלולה בתקשורת BEC (טבלת 1). פלייט תאים על ג'ל קולגן הדק שנעשה בעבר.
4. מעבר ואחסון של תאים
הערה: תאים על ג'ל קולגן הדק ניתן לפצל לפי צורך.
- לשטוף צלחות עם PBS סטרילי לפני דוגרים בטריפסין 0.25% ב37 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות.
- לנטרל עם נפח שווה של מדיה BEC, וגלולה ב1,500 XG במשך 5 דקות. יש לשטוף גלולה עם DMEM/F12, ולאחר מכן גלולה ב1,500 XG במשך 5 דקות.
- תאי resuspend בתקשורת BEC לחלוקה לצלחות תרבית תאי קולגן מצופים.
הערה: לחלופין, ניתן resuspended תאים באמצעי אחסון ומאוחסנים במקפיא -80 ° C או חנקן נוזלי (טבלה 1).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
השימוש בתוצאות פרוטוקול זה בבידודה של אוכלוסייה של cholangiocytes ילוד עכבר extrahepatic עם טוהר מעולה, כפי שהודגם על ידי מכתים immunofluorescence K19 (2A דמויות ו2B); אנו משיגים תוצאות דומות לבודד תאים מעכברים בוגרים. יש לנו ציינו כי זה לוקח 3 שבועות לתאים מצינורות מרה מבודדים טרי כדי ליצור monolayers על ג'לי קולגן עבה. Cholangiocytes לגדול בצורה ליניארית לאורך קולגן העבה, ויוצר יריעות של תאים מהצינורות המבודדים. יש לפצל תאים מחדש מצופים על ג'ל קולגן הדק ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שתואר כאן הוא טכניקה לבודד cholangiocytes הטהור מדרכי המרה extrahepatic של עכברים של עכברים בכל הגילים, כולל תינוקות. הטכניקה מציעה את היתרון שניתן ללמוד cholangiocytes extrahepatic בנפרד מcholangiocytes intrahepatic, ועשויה להקל על מחקרים כדי לזהות את ההבדלים עיקריים בין האוכלוסיות של תאים אלה. אנו פורסמו לאחרונה מחקר אשר הוכיח ירידת cilia בcholangiocytes extrahepatic מבודדת בשיטה זו ונגועה בrotavirus רזוס 8. חסרונות כוללים שהטכניקה היא עבודה אינטנסיבית, והנתיחה מדוקדק...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.
תודות
המחברים מודים לCore פתולוגיה המולקולרית וההדמיה של מרכז NIDDK UPenn מולקולרית מחקרים בעיכול ומחלות כבד (DK50306 P30) לקבלת סיוע בהדמיה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות (R01 DK-092,111) ומפרד וסוזן Biesecker ילדים מרכז כבד (לRGW) ועל ידי מענק מרשת ילדות מחלת הכבד מחקר והחינוך (לSK).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 (1:1) | Gibco/ Life technologies | 11320-033 | 500 מ"ל, בשימוש במדיה BEC |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | 25 מ"ל, בשימוש במדיה BEC |
| MEM עם חומצות אמינו לא חיוניות | Gibco/ Life technologies | 11140-019 | 5 מ"ל, בשימוש במדיה BEC |
| טכנולוגיות אינסולין-טרנספרין-סלניום | Gibco/ Life | 51300-044 | 5 מ"ל, בשימוש במדיה BEC |
| Na Pyruvate | Cellgro | 25-000-CL | 5 מ"ל, משמש במדיה BEC |
| תרכיז שומנים מוגדר כימית | Gibco/ Life technologies | 11905-031 | 5 מ"ל, המשמש במדיה BEC |
| פניצילין-סטרפטומיצין | Cellgro | 30-002-CI | 5 מ"ל, משמש במדיה BEC ו-500 μ l בבידוד |
| Gentamicin | Gibco / Life technologies | 15750-060 | 0.2 מ"ל, בשימוש במדיה BEC ו- 500 & # 956; l בבידוד |
| אתנולמין | סיגמא אולדריץ' | E9508-100 מ"ל | 0.13 מ"ל, משמש בתמיסת ויטמין MEM מדיה |
| BEC Gibco / Life טכנולוגיות | 11120-052 | 5 מ"ל, המשמש במדיה BEC | |
| מעכב טריפסין פולי סויה | Biowhittaker | 17-605E | 5 מ"ל, המשמש במדיה BEC. הממס הוא PBS, מערבבים לריכוז מלאי של 5 מ"ג/מ"ל |
| L-גלוטמין | Cellgro | 25-005-CL | 5 מ"ל, המשמש במדיה BEC |
| תמצית יותרת המוח בקר | Gemini | 500-102 | 1.1 מ"ל, בשימוש במדיה BEC |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | 0.5 מ"ל, בשימוש במדיה BEC, Stock conc 393 & #956; גרם/מ"ל לדלל עם אתנול |
| 3 3',5-טריודו-L-תירונין | סיגמא אולדריץ' | T6397 | 0.5 מ"ל, בשימוש במדיית BEC, סטוק קונק 3.4 מ"ג/מ"ל לדלל עם אתנול |
| גורם גדילה אפידרמיס | Millipore | 01-101 | 0.5 מ"ל, בשימוש במדיה BEC, 25 & #956; גרם/מ"ל לדלל עם DMEM F12+1% BSA |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | 5 מ"ל, בשימוש במדיה BEC, לשימוש בריכוז מלאי של 0.411 מ"ג/מ"ל ולדלל עם DMSO |
| Fungizone | Gibco/ Life technologies | 15290-018 | 1 מ"ל, בשימוש במדיה BEC ו-500 μ l בבידוד |
| קולגן זנב עכברוש | BD Biosciences | 354236 | משתנה בהתאם לריכוז הקולגן |
| PBS 10x | USB Corporation | 75889 | שימוש ב-10x, סטרילי, המשמש לייצור קולגן, הכמות המשמשת תלויה בריכוז הקולגן |
| dH2O | N/A | N/A | סטרילי, המשמש לייצור קולגן, הכמות המשמשת תלויה בריכוז הקולגן |
| NaOH 10 N | Fischer Scientific | ss255-1 | מדולל ל-1 N, סטרילי, משמש לייצור קולגן, הכמות בשימוש תלויה בריכוז הקולגן |
| קולגנאז מסוג XI מ-Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C7657 | לדלל ב-DMEM ובמסנן סטרילי לפני השימוש |
| trypsin-EDTA (1x) 0.25% | Gibco/ Life technologies | 25200-056 | 3 מ"ל, דגירה מקסימום 10 דקות |
| טריפסין-EDTA (10x) 0.5% | Gibco / Life technologies | 15400-054 | 3 מ"ל, דגירה מקסימום 10 דקות |
| מיקרוסקופ ניתוח | ניקון | SMZ645 | דגמים אחרים מקובלים |
| מקור אור (תאורה פיבראופטית) | Schott-Fostec | Ace EKE LR 92240 | דגמים אחרים מקובלים |
| 12.5 ס"מ מספריים ישרים לקשתית | Kent Scientific | דגמים אחרים מקובלים | |
| 6 אינץ' מלקחיים מעוקלים לא משוננים עם טיפים עדינים | מיקרוסקופיה אלקטרונית | דגמים אחרים מקובלים | |
| מלקחיים אל חלד משוננים בגודל 4 אינץ' עם קצות עדינים | מדעי | אלקטרונית דגמים אחרים מקובלים |
מקורות
- Paradis, K., Sharp, H. L. In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model. J. Lab. Clin. Med. 113 (6), 689-694 (1989).
- Vroman, B., LaRusso, N. F. Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells. Lab. Invest. 74 (1), 303-313 (1996).
- Kumar, U., Jordan, T. W. Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats. Liver. 6 (6), 369-378 (1986).
- Ishii, M., Vromen, B., LaRusso, N. F. Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver. Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).
- Strazzabosco, M., Fabris, L. Development of the bile ducts: Essentials for the clinical hepatologist. J. Hepatol. 56 (5), 1159-1170 (2012).
- Carpentier, R., et al. Embryonic ductal plate cells give rise to cholangiocytes, periportal hepatocytes, and adult liver progenitor cells. Gastroenterology. 141 (4), 1432-1438 (2011).
- Cho, W. K., Mennon, A., Boyer, J. L. Isolation of functional polarized bile duct units from mouse liver. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 280 (2), (2001).
- Karjoo, S., Hand, N. J., Loarca, L., Russo, P. A., Friedman, J. R., Wells, R. G. Extra-hepatic cholangiocyte cilia are abnormal in biliary atresia. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 57 (1), 96-101 (2013).
- Sutton, M. E., op den Dries, S., Koster, M. H., Lisman, T., Gouw, A. S., Porte, R. J. Regeneration of human extrahepatic biliary epithelium: the peribiliary glands as progenitor cell compartment. Liver Int. 32 (4), 554-559 (2012).
- Cardinale, V., et al. Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets. Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
