שתואר כאן הוא הליך לקבלת משתרע הקלטה הנוכחית ארוך מערוץ יון אחד עם טכניקת התיקון-clamp מצורף תא. שיטה זו מאפשרת להתבוננות, בזמן אמת, את הדפוס של תצורות ערוץ פתוחות קרובים העומדות בבסיס האות הביולוגית. נתונים אלה להודיע על נכסי ערוץ בממברנות ביולוגיות באין מפריע.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
חלבוני ערוץ יון הם מכשירים אוניברסליים לתקשורת מהירה על פני ממברנות ביולוגיות. החתימה הזמנית של השטף היוני הם מייצרים תלויה במאפיינים פנימיים לכל חלבון ערוץ, כמו גם את המנגנון שבאמצעותו הוא נוצר ונשלט ומייצגת תחום חשוב של מחקר הנוכחי. ניתן להשיג מידע על הדינמיקה התפעולית של חלבוני תעלת יונים על ידי התבוננות פרקי זמן ארוכים של זרם המיוצרים על ידי מולקולה בודדת. שתואר כאן הוא פרוטוקול להשגת הקלטות אחד ערוצים מצורפים תא התיקון-clamp הנוכחיות לערוץ יגנד מגודרת יון, הקולטן NMDA, הביע heterologously בHEK293 תאים או באופן מקורי בתאי עצב בקליפת המוח. גם סיפקו הוראות כיצד להתאים את השיטה לתעלות יונים אחרות של עניין על ידי הצגת הדוגמא של PIEZO1 ערוץ מיכני רגיש. שיטה זו יכולה לספק נתונים לגבי מאפייני המוליכות של הערוץ ואת הרצף הזמני של אופתצורות n-סגורים המרכיבות את מנגנון ההפעלה של הערוץ, ובכך לסייע להבנת תפקודם בבריאות ובחוליים.
מבוא
תקשורת מהירה על פני ממברנות ביולוגיות מסתמכת כמעט אך ורק על חלבוני oligomeric נקבוביות ויוצר קרום, המכונות גם ערוצים. חלבונים אלה שונים באופן נרחב באותות הפעלה, מנגנוני gating, ומאפייני מוליכות. חלבוני ערוץ נקבוביות שהם סלקטיבית ליוני מסווגים כתעלות יונים; ההפעלה שלהם מייצרת זרמים יוניים על פני הקרום, והתגובות שלהם יכולות להיות מוקלטות עם רזולוציה גבוהה בזמן אמת תוך שימוש בטכניקות אלקטרו. אותות ההפעלה span מגוון רחב של תשומות כימיות ופיזיות הכוללים מילויים ריכוז, כוחות מכאניים וחשמליים, וטמפרטורה; וכך, סיווג נוסף תעלות יונים ליגנד מגודרת, mechanosensitive, מתח מגודרת, או סוגים רגישים לחום. במאמר זה, פרוטוקולים מתוארים להקליט פע....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. ביטוי תרבית תאים וחלבונים
- שמור על תאי HEK293 (מספר ATCC CRL-1573) בין הקטעים 22 ו40, הכולל קטעים שבוצעו על ידי ATCC, בתרבות monolayer DMEM בתוספת 10% שור סרום עוברי (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין בתערובת 5% CO 2 ו37 ° C. בין ניסויים, תאי מעבר לתוך צלוחיות T25 ב5-20 דילולים לקפל בנפח סופי של 10 מיליליטר. הערה: שימוש בתאים במהלך מעברים אלה מבטיח בריאות תא חיובית אשר תאפשר להיווצרות חותם אופטימלית ויציבות תיקון.
- עבור transfection, תאי צלחת HEK293 ב35 מנות מ"מ בצפיפות של ~ 10....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
רקומביננטי NMDA רצפטורים
קולטני NMDA להיקשר ולהגיב לפעולה במקביל של שני עמיתים לאגוניסטים: גלוטמט וגליצין. הם להרכיב כheterotetramers של שני גליצין המחייב יחידות משנה GluN1 ושני גלוטמט מחייב יחידות משנה GluN2. יחידות משנה GluN2 מקודדות על ידי ארבעה גנים (לספירה) ושל אלה הצורות ביותר עיבד נרחב במוח הן GluN2A במבוגרים וGluN2B בבעלי חיים לנוער. בגלל המגוון של תת NMDA קולטן בהכנות ילידים, לבטא קולטני.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בתחום ערוץ יון, אזור חשוב של מחקר מוקדש להבנת רצף אירועים שמוביל לערוץ פתיחה או מנגנון gating של הערוץ. עבור רוב הערוצים, תהליך זה הוא מורכב וכולל מספר שלבים הקינטית שלא ניתן להסיק מאות רב ערוצים מקרוסקופית. לעומת זאת, יכולים להיות מתוכננים ניסויים שבם התבוננות רצף אירועים פתוחים / סגורים ברשומת ערוץ אחד יכולה לייצר מידע מפורט יותר על מנגנוני gating. בשיטות שתוארו כאן, תחום יגנד מחייב ממוקם החיצוני ברשותו על ידי קולטנים NMDA מאפשר להקלטות תיקון מהדק פולשנית ללהתבצע בתנאים קבועים. .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
הסופרים של כתב היד הזה מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי F31NS086765 (KAC), F31NS076235 (MAP), וR01 NS052669 (GKP) וEIA9100012. המחברים מודים איילין Kasperek למומחיות וסיוע בביולוגיה מולקולרית ותרביות רקמה; וג'ייסון מאיירס לשיתוף נתונים המתקבלים מנוירונים בקליפת המוח הקדם חזיתית מוקדם.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| כימיקלים | סיגמא | שונים | |
| Borosillicate זכוכית | Sutter | BF-150-86-10 | |
| מיקרוסקופ הפוך שדה בהיר | אולימפוס | 1x51 | לניקון יש גם מיקרוסקופים דומים |
| תיבת פלורסנט | X-cite | סדרה 120 | |
| מדריך אור נוזלי | X-cite | OEX-LG15 | |
| מיקרומניפולטור | Sutter Instruments | MP-225 | |
| אוסילוסקופ | Tektronix | מגבר TDS1001 | |
| התקנים מולקולריים | Axon Axopatch 200B | ||
| טבלה | TMC | 63561 | |
| כרטיס NIDAQ | National Instruments | 776844-01 | |
| חולץ | Narishige | PC-10 | |
| מלטש | Narishige | Microforge MF-830 | |
| Faraday Cage | TMC | 8133306 | |
| מהדק לחץ במהירות גבוהה | ALA מכשירים מדעיים | ALA HSPC | |
| משאבת לחץ / ואקום | ALA מכשירים מדעיים ALA | משאבת PV | עבור HSPC-1 |
מקורות
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques f....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
