כדי לשפר את הידע של היווצרות neotissue תאית ומולקולרית שלנו, מודל עכברי של TEVG פותח לאחרונה. השתלים הושתלו שתלי כחציצת וריד נבוב infrarenal בעכברי C57BL / 6. מודל זה משיג תוצאות דומות לאלה שהושגו בחקירה הקלינית שלנו, אבל לאורך זמן כמובן הרבה מקוצר.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
פיגומים מתכלים נזרעו עם תאים חד גרעיניים מח עצם (BMCs) משמשים לעתים קרובות לניתוח שחזור לטיפול בחריגות לב מולדת. התוצאות הקליניות ארוך הטווח הראו שיעורי patency מצוינים, עם זאת, עם שכיחות משמעותית של היצרות. כדי לחקור את המנגנונים התאיים ומולקולריים של היווצרות neotissue כלי דם ומניעת התפתחות היצרות שבתלי רקמה מהונדסות כלי דם (TEVGs), פיתחנו מודל עכבר של השתל עם כ 1 מ"מ קוטר פנימי. ראשית, TEVGs הורכבו מפיגומים צינורי מתכלים מפוברק מלא ארוג חומצת polyglycolic הרגיש רשת מצופה עם קופולימר ε-caprolactone ו-L-lactide. הפיגומים לאחר מכן הושמו בlyophilizer, ונשאבים ל24 שעות, ומאוחסנים בתא ייבוש עד זריעת תאים. שנית, מח עצם נאסף מעכברי תורם ותאים חד גרעיניים היו מבודדים על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות. שלישית, כמיליון תאים היוזורעים על פיגום וטופחו O / נ לבסוף, פיגומי seeded היו אז מושתלים כמו שתלי חציצת וריד נבוב infrarenal בעכברי C57BL / 6. השתלים המושתלים הפגינו patency מצוין (> 90%) ללא עדות לסיבוכים תרומבואמבוליים או היווצרות aneurysmal. מודל עכברי זה יסייע לנו בהבנה וכימות מנגנונים התאיים ומולקולריים של היווצרות neotissue בTEVG.
מבוא
מומי לב מולדים הם מצבים חמורים המשפיעים על כמעט 8% מלידות חיות בארצות הברית. כ 25% מתינוקות עם מומי לב מולדים או 2.4 ל -1,000 לידה חי, דורשים טיפול פולשני בשנה הראשונה לחייהם 1. הטיפול היעיל ביותר למחלת לב מולדת הוא ניתוח שחזור. למרבה הצער, סיבוכים הנובעים מהשימוש של צינורות כלי דם זמינים כרגע הם הגורם המשמעותי ביותר לתחלואה ותמותה לאחר ניתוח.
כדי לטפל בבעיה זו, פיתחנו את השתלים הראשונים רקמות מהונדסות כלי דם (TEVGs) לשימוש קליני 2. TEVGs נבנו מצינורות פוליאסטר מתכלים נזרעו עם תאי מח עצם עצמי נגזר מונונוקלארים (BM-MNCs) ומושתלים כמוליכי ורידים לניתוח לב מולדים. התוצאות הראו שיעורי patency מעולים ב1-3 שנים של מעקב, אך עם שכיחות משמעותית של היצרות 3,4. הייתה ברורה שהבנה טובה יותר של היווצרות neotissue כלי דם ואת המנגנון בסיסי הפיתוח של היצרות TEVG הייתה צורך. על מנת להבין את התפתחות TEVGs והמנגנון של התפתחות היצרות טוב יותר, מודל כבש נוצר 5,6. במודל זה, TEVGs הפך בהצלחה לכלי חיים והיו דומים בשתי מורפולוגיה ותפקוד של ורידי ילידים. שימוש זה במודל חיה גדול היה צעד ראשון טוב במתן מידע טרום קליני חשוב שסייע לשימוש קליני של TEVGs. עם זאת, הבנה מלאה של המנגנונים התאיים ומולקולריים של היווצרות כלי דם בneotissue TEVGs באמצעות מודלים של בעלי חיים גדולים היא מוגבלת בשל מגבלות באפיון מולקולרי של פנוטיפים תאי כלי דם בשל חוסר מיני כלים מולקולריים ספציפיים. כדי להתגבר על חסרונות אלה, מודל עכברי של TEVGs פותח על ידי סיבה של הקידום המהיר בגנטיקה עכבר וmolecula הנרחב שלהםאפיון r עם היתרון הנוסף של היקף זמן מקוצר.
מודל החציצה העכברי IVC נאמנות סכם התהליך של neovessel היווצרות המתרחשת בבעלי חיים ובבני אדם גדולים, אבל מעל כמובן זמן קצר הרבה יותר 6-9. כאן, פרוטוקול מפורט לייצור שתל בקנה מידה קטנה באמצעות פיגומים מתכלים, קצירת BM-MNC ובידוד, זריעת BM-MNC על פיגום, והשתלת שתל במודל עכברי תוארו.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: כל נהלי בעלי החיים אושרו על ידי הוועדה בבית חולים בבעלי חיים מוסדי הטיפול ושימוש של הילדים ארצי.
1. שתל ייצור
- להפוך את פתרון ε-caprolactone וP קופולימר L-lactide (לוס אנג'לס / CL) על ידי הוספת P 100mg (לוס אנג'לס / CL) ב2 מיליליטר dioxane מתחת למכסת מנוע קטר. מניחים את הפתרון במערבולת ומערבבים ברציפות במשך 1-1.5 שעה לפזר לגמרי.
- בינתיים, להסיר גיליון של חומצת polyglycolic (PGA) הרגיש מהמקפיא ולגזור כמה סעיפי 5 מ"מ x 8. גם לחתוך את קצה פיפטה μl .1-10 בדיוק מעל המסנן.
- הכנס מחט 19 G (1.5 אורך) לקצה הדיסטלי של קצה pipet ולעטוף את PGA הרגיש סביב המחט באמצעות מלקחיים מיקרו.
- לדחוף בזהירות את הלבד לקצה הדיסטלי של קצה pipet, שבו לומן הוא ישר מהחלק הפרוקסימלי, באמצעות מחט 18 G בוטה, בעוד מחט G 19 מוכנסת לתוכו.
- פיפטהפתרון 40 P μl (CL / לוס אנג'לס) לקצה פיפטה מלמעלה. PGA להרוות הרגיש עם הפתרון. ואז לדחוף את בועות אוויר באמצעות מתקן פיפטה. חזור על תהליך זה במידת הצורך.
- שתלי מקום בצינור 50 מ"ל ולמקם אותו במקפיא -80 ° C עבור 20 דקות. ודא ראש מחטי הפנים כלפי מטה.
- העבר את הצינור לתוך lyophilizer ואבק ל24 שעות. הקפד לפתוח את המכסה של הצינור יש זרימת אוויר.
- להוציא את השתלים ולהסיר אותם מהמחטים. חותכים את שני הקצוות של השתל עוזב סעיף מ"מ ~ 5 והחזיר אותם למחטים כדי לשמור על צורתם. שמור את השתלים בייבוש.
- הנח את הפיגום תחת אור UV בO מכסה המנוע בטיחות ביולוגי / N לפני זריעת תאים.
2. קצירת תא מח העצם mononuclear ובידוד
- להרדים את העכברים עם מנת יתר של קטמין / xylazine (קטמין, 200 מ"ג / קילוגרם ו xylazine, 20 מ"ג / קילוגרם).
- עצמות הסר (עצמות ירךtibias ד) מ 3 עכברים ל10 השתלות שתל ומקום בצלחת פטרי עם 10 RPMI סמ"ק. חותכים את שני הקצוות של העצמות ומח עצם סומק באמצעות מזרק עם מחט 25 G לתוך צלחת פטרי חדשה עם 3 RPMI סמ"ק. לאסוף מח עצם ופתרון RPMI בצינור סמ"ק 15 ולשטוף את צלחת פטרי עם RPMI 2 סמ"ק נוסף כדי לאסוף את שארית BM.
- קח לדוגמא (5-10 μl) וספירת תאים באמצעות מונה תא אוטומטי או hemocytometer. רשום את התוצאה.
- שים 5 Ficoll סמ"ק בצינור 15 צנטריפוגות סמ"ק ולהוסיף מח עצם ופתרון RPMI. להוסיף את הפתרון מאוד בעדינות כדי למנוע ממנה הערבוב עם Ficoll.
- צנטריפוגה ב528 XG במשך 30 דקות עם "בלם לא" ב24 ° C.
- הסר את השכבה הוורודה העליונה. לאסוף את איור האמצע ברור שכבת 1, המהווה את שכבת MNC, ולדלל אותו עם PBS 1:1.
- צנטריפוגה פתרון MNC לדלל ב528 XG 10 דקות ב 24 ° C.
- הסר את supernatant ודיאוטה גלולה עם 5 מיליליטר PBS.
- צנטריפוגה פתרון גלולה ב528 XG 10 דקות ב 24 ° C.
- הסר את supernatant. לדלל את הכדור עם הנפח המתאים של RPMI (~ μl 200).
- קח לדוגמה μl 5-10 ולספור תאים באמצעות מונה תא אוטומטי או hemocytometer. רשום את התוצאה. חזור על התא לספור עוד פעם אחת ולחשב את המספר הסלולרי הממוצע.
- לדלל ריכוז תא ל1,000,000 cells/10 μl באמצעות RPMI.
3. זריעת תאים
- פיגום Prewet ידי הוספת 5 μl RPMI luminally למשך 5 דקות, ולאחר מכן להסיר RPMI.
- הוסף 10 תאי מח עצם μl נגזרים מונה גרעיניים בRPMI מהשלב 2.12 ללום פיגום ולחכות 10 דקות כדי לאפשר לתאים לצרף אל הגרדום.
- חותכים מחט 19 G לאורך 1 סנטימטר והכניס את המחט לתוך לומן של הפיגום כדי לשמור על צורתו של הפיגום. הנח את הדוגמא בצלחת 24 גם.
- הוספת 1,000 μl RPMI לכל היטב דגירה O / N באינקובטור.
4. שתל השרשה
- החיטוי כל הכלים הניתוחיים לפני הניתוח: X 1 מספריים בסדר, מלקחיים מייקר 3x, מלחציים כלי דם מיקרו 2x, מלקחיים החלת מהדק 1x, בעל מחט מייקר 1x, מספריים אביב 1x, מפשק 1x.
- 6-8 שבועות נקבה בת C57BL / 6 משמשים כמקבלי שתל כלי דם רקמות מהונדסות. הסר את העכבר מהכלוב שלה ולשקול אותה, ולאחר מכן להרדים באמצעות זריקת intraperitoneal לרבע ימני התחתון של הבטן עם קוקטייל קטמין / xylazine (קטמין, 100 מ"ג / קילוגרם ו xylazine, 10 מ"ג / קילוגרם). Ketoprofen (5 מ"ג / קילוגרם, IP) משמש כמשכך כאבים טרום הרדמה.
- בדוק את הרמה של הרגעה על ידי צביטת סיפור, ולאחר מכן קליפ שיער הבטן. לשמן את העיניים עם משחת עיניים סטריליות, ומניח את העכבר בעמדת recumbence גב על כרית. לחטא את הבטן עם רפידות בטאדין ואלכוהול. שיתוףVer העכבר עם וילון סטרילי ולחשוף את אזור החתך בלבד.
- לעשות חתך פיום בטן קו האמצע מלמטה xyphoid לאזור suprapubic, ולהכניס את מפשק שמירה עצמית. עטוף את המעיים בגזה טבול מלוחה. בוטות להגדיר את אב העורקים infrarenal ווריד נבוב.
- הנח שני חבקים בכלי דם מיקרו משני צדדים הפרוקסימלית ומ דיסטלי של קאווה אב העורקים ונבוב אז בבוטות להפריד את אב העורקים מהווריד הנבוב Transect הווריד הנבוב. במידת צורך, ולקשור את הענפים של אב העורקים בבטן עם 10-0 תפרי monofilament על מחטים מחודדות.
- להשתיל שתל נחותה וריד נבוב חציצה עם קצה הפרוקסימלי ודיסטלי לסיים anastomoses באמצעות תפר 10-0 סטרילי. חתוך את השתל, בדרך כלל 1-2 מ"מ, תלוי על האנטומיה של העכבר. אבטח את השתל עם תפר אחד משני קצוות הפרוקסימלית ומ דיסטלי ולהתחיל לתפור ברציפות עם 4-5 stiches מהצד השני של השתל האחר. לאחר שסיימתי את הצד הקדמי, להפוך את מהדק ושתליםלצד השני ותפר את הצד האחורי של השתל. במהלך השתלה, שטוף את השתל עם פתרון הפרין לעתים קרובות כדי למנוע פקקת חריף.
- הסר את המהדק הפרוקסימלית ולשלוט בדימום על ידי הפעלת סוכן hemostat אקטואלי נספג סטרילי. כאשר הדימום מפסיק לחלוטין, להסיר את מהדק דיסטלי ולשלוט בדימום באותו אופן. הפוך זורם דם בטוח באמצעות השתל.
- סגור את השרירים ועור הבטן בשתי שכבות באמצעות תפר monofilament 6-0 פוליאמיד השחור עם מחט מושחל כלולה.
- הזרק 0.5 מיליליטר תת עורי מלוח ומניח את העכבר בכלוב התאוששות על כרית חימום עד שהעכבר הוא נייד באופן מלא. עם ההתאוששות, להחזיר את העכבר לכלוב חדש עם מצעי נייר. תן משככי כאבים (איבופרופן, 30 מ"ג / קילוגרם, מי שתייה) ל48 שעות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
סכמטי של השתלת TEVG מוצגת באיור 1. מח העצם היה שנקטפו מן עכבר תורם ותאים הגרעיניים מונו בודדו באמצעות צנטריפוגה צפיפות ולאחר מכן זורעים על פיגום מתכלה. פיגומי seeded הודגרו O / N ומושתל לעכבר נמען כשתל חציצה נחותה וריד נבוב.
איור 2 ממחיש את מיקרוסקופ האלקטרונים סורק של פיגום PGA-P (CL / לוס אנג'לס). הקוטר הפנימי כ 1 מ"מ ועובי הקיר היה כ 0.17 מ"מ. נקבוביות סה"כ ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מודל העכבר של TEVG הוא כלי רב ערך כדי ללמוד מנגנונים תאיים ומולקולריים של היווצרות neotissue והפיתוח של היצרות. BM-MNC זרע הוצג בשני תמונות היסטולוגית וSEM של תאי זרע על השתל 11. יעילות זריעת תאים הוצגה גם באמצעות assay-DNA 7. שימוש במערכת מודל זה הראה שזריעת תאים מפחיתה את השכיחות של ההתפתחות של היצרות TEVG, שהייתה במצב העיקרי לכישלון בניסוי הקליני בבני האדם שלנו 3. תאי זרע נעלמו במהירות מTEVG, טוענים כי הם מפעילים ההשפעה שלהם באמצעות מנגנון ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש המחברים אין לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה, בין שאר, על ידי מענק מ-NIH (RO1 HL098228) לCKB.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| חומצה פוליגליקולית (PGA) הרגישה | מבנים ביו-רפואיים | Custome הזמינה | |
| קצה פיפט, 0.1-10 μ l | פישר סינטיפיק | 02-707-456 | |
| ליופילייזר | Labconco | 7070020 | |
| RPMI בינוני 1604 | Gibco | 11875-093 | |
| צלחת פטרי | BD | 353003 | |
| צלחת 24 בארות | קורנינג | 3526 | |
| צינור 15 סמ"ק | BD | 352096 | |
| Ficoll | Sigma | 10831-100 מ"ל | נקרא גם 'Histopaque'DPBS |
| Gibco | 14190-144 | ||
| Littauer חותך עצמות 4.5 אינץ' | ישר Roboz | RS-8480 | עבור BM קציר |
| מלקחיים 4.5 " | Roboz | RS-8120 | עבור BM קציר |
| מספריים 4.5 " | Roboz | RS-5912 | לקצירת BM |
| מיקרוסקופ | Leica | M80 | |
| C57BL/6J (H-2b), | מעבדות ג'קסון | 664 | 8-12 שבועות |
| הזרקת קטמין הידרוכלוריד | Hospira Inc. | NDC 0409-2053 | |
| תמיסה סטרילית קסילזין | Akorn Inc. | NADA# 139-236 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-4396-01 | |
| איבופרופן | PrecisionDose | NDC 68094-494-59 | |
| Heparin sodium | Sagent Pharmaceticals | NDC 25021-400 | |
| תמיסת מלח (סטרילית 0.9% נתרן כלורי) | Hospira Inc. | NDC 0409-0138-22 | |
| 0.9% הזרקת נתרן כלורי | Hospira Inc. | NDC 0409-4888-10 | |
| משחת עיניים וזלין | Dechra מוצרים וטרינריים | NDC 17033-211-38 | |
| רפידות הכנה ליוד | Triad Disposables, Inc. | NDC 50730-3201-1 | |
| רפידות הכנה לאלכוהול | McKesson Corp. | NDC 68599-5805-1 | |
| אפליקטורים עם קצה כותנה | פישר סיינטיפיק | 23-400-118 | |
| מספריים עדינים | FST | 14028-10 | |
| מלקחיים מיקרו-אדסון | FST | 11018-12 | |
| מהדק מריחת מלקחיים | FST | 00072-14 | |
| S& מהדק כלי דם T | FST | 00396-01 | |
| מספריים קפיציים | FST | 15008-08 | |
| מחזירי קוליברי | FST | 17000-04 | |
| דומונט #5 מלקחיים | FST | 11251-20 | |
| דומונט #7 - מלקחיים עדינים | FST | 11274-20 | |
| דומונט #5/45 מלקחיים | FST | 11251-35 | |
| מחזיק מחט טיש/ מלקחיים | Micrins | MI1540 | |
| תפר מונופילמנט פוליאמיד שחור, 10-0 | AROSurgical Instruments Corporation | TI638402 | לתפירת השתל |
| תפר מונופילמנט פוליאמיד שחור, 6-0 | AROSurgical Instruments | SN-1956 | לסגירת שרירים וסגירת עור |
| ספוגים לא ארוגים | McKesson Corp. | 94442000 | |
| המוסטט נספג | אתיקון | 1961 | |
| 1 מ"ל מזרק | BD | 309659 | |
| 3 מ"ל מזרק | BD | 309657 | |
| 10 מ"ל מזרק | BD | 309604 | |
| 18 גרם 1.5 אינץ', מחט | BD | 305190 | |
| 25 גרם 1 אינץ', מחט | BD | 305125 | |
| 30 גרם 1 אינץ', מחט | BD | 305106 | |
| מחזור מים חמים | Gaymar | TP-700 | |
| כרית חימום | Gaymar | TP-22G | |
| גוזם | Wahl | 9854-500 |
מקורות
- Heart Association, A. merican Heart Disease and Stroke Statistics—2012 Update. Circulation. 125, (2012).
- Shinoka, T., et al. Creation Of Viable Pulmonary Artery Autografts Through Tissue Engineering. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 115, 536-546 (1998).
- Hibino, N., et al. Late-term results of tissue-engineered vascular grafts in humans. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 139, 431-436 (2010).
- Shin'oka, T., et al. Midterm clinical result of tissue-engineered vascular autografts seeded with autologous bone marrow cells. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 129, 1330-1338 (2005).
- Brennan, M. P., et al. Tissue-engineered vascular grafts demonstrate evidence of growth and development when implanted in a juvenile animal model. Ann Surg. 248, 370-377 (2008).
- Roh, J. D., et al. Construction of an autologous tissue-engineered venous conduit from bone marrow-derived vascular cells: optimization of cell harvest and seeding techniques. Journal of Pediatric Surgery. 42, 198-202 (2007).
- Hibino, N., et al. Tissue-engineered vascular grafts form neovessels that arise from regeneration of the adjacent blood vessel. The FASEB Journal. 25, 2731-2739 (2011).
- Hibino, N., et al. A critical role for macrophages in neovessel formation and the development of stenosis in tissue-engineered vascular grafts. The FASEB Journal. 25, 4253-4263 (2011).
- Naito, Y., et al. Characterization of the Natural History of Extracellular Matrix Production in Tissue-Engineered Vascular Grafts during Neovessel Formation. Cells Tissues Organs. 195, 60-72 (2012).
- Naito, Y., et al. Beyond Burst Pressure: Initial Evaluation of the Natural History of the Biaxial Mechanical Properties of Tissue Engineered Vascular Grafts in the Venous Circulation Using a Murine Model. Tissue Eng. Part A. 20, (2013).
- Mirensky, T. L., et al. Tissue-engineered vascular grafts: does cell seeding matter. Journal of Pediatric Surgery. 45, 1299-1305 (2010).
- Roh, J. D., et al. Tissue-engineered vascular grafts transform into mature blood vessels via an inflammation-mediated process of vascular remodeling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 4669-4674 (2010).
- Mirensky, T. L., et al. Tissue-engineered arterial grafts: long-term results after implantation in a small animal model. Journal of Pediatric Surgery. 44, 1127-1133 (2009).
- Lee, Y. U., Naito, Y., Kurobe, H., Breuer, C. K., Humphrey, J. D. Biaxial mechanical properties of the inferior vena cava in C57BL/6 and CB-17 SCID/bg mice. Journal of Biomechanics. 46, 2277-2282 (2013).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
